梁 倩，李 璐，安 茜，周雅莉，王計(jì)平

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801）

紫蘇（Perilla frutescens（L.）Britt.）是雙子葉 1 年生草本植物，是國家衛(wèi)生部第1批頒發(fā)的藥食兩用的中藥植物之一，種子油富含α-亞麻酸[1-2]。目前，紫蘇被認(rèn)為是一種新型油料作物。

在植物油脂合成過程中，脂肪酸去飽和酶基因FAD2是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Δ12油酸去飽和酶[3]，是產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶基因，調(diào)控亞油酸和亞麻酸2種脂肪酸的合成，同時(shí)也用來調(diào)控植物細(xì)胞中大多數(shù)不飽和脂肪酸的合成，其催化產(chǎn)物及其衍生物對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。油酸是植物油脂中主要的單不飽和脂肪酸，在脂肪酸脫氫酶（FAD2）催化下形成亞油酸，而亞油酸是人體所必需的脂肪酸。研究表明，當(dāng)兒童缺乏亞油酸時(shí)，會(huì)出現(xiàn)發(fā)育遲緩和濕疹皮炎等癥狀；當(dāng)成人缺乏亞油酸時(shí)，會(huì)出現(xiàn)磷狀皮屑、脫發(fā)和傷口難以愈合等癥狀[4-5]。FAD2是催化多不飽和脂肪酸生物合成的第1步反應(yīng)[6]，在植物種子中，其表達(dá)量的多少?zèng)Q定著亞油酸含量的多少。所以，脂肪酸去飽和酶FAD2在不飽和脂肪酸的合成過程中發(fā)揮重要作用。

本研究對(duì)紫蘇FAD2基因進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析，并分析了該基因在晉紫蘇1號(hào)不同組織及不同發(fā)育時(shí)期種子中的表達(dá)特性，旨在為進(jìn)一步闡明紫蘇FAD2基因在脂肪酸合成代謝過程中的作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

從紫蘇轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫中挑選出功能注釋為FAD2的基因，根據(jù)不同物種間同源基因的核酸序列相對(duì)保守的特點(diǎn)，將紫蘇中該基因序列與擬南芥FAD2同源序列進(jìn)行比對(duì)分析，最后得到紫蘇FAD2基因全長(zhǎng)cDNA序列。

選取由中北大學(xué)張志軍老師提供的晉紫蘇1號(hào)作為試驗(yàn)材料，分析不同組織及不同發(fā)育時(shí)期的種子（開花后 10，20，30，40 d）中 PfFAD2 基因的表達(dá)特性。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫蘇FAD2基因序列及蛋白功能分析 紫蘇FAD2基因編碼蛋白的理化性質(zhì)通過ProtParam在線軟件分析；親疏水性、跨膜域利用ProtScale在線軟件和TMHMM-2.0在線軟件分析；功能結(jié)構(gòu)域運(yùn)用 NCBI的 CDD（Conserved Domiand Database）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析鑒定；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用SOPMA在線軟件分析；三級(jí)結(jié)構(gòu)分析及建模采用Swiss-Model在線軟件分析。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析運(yùn)用MEGA6.0多序列比對(duì)軟件進(jìn)行構(gòu)建。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 根據(jù)紫蘇FAD2基因的cDNA序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異引物，cDNA合成采用ABM公司試劑盒，實(shí)時(shí)熒光定量采用康潤(rùn)公司GenStar試劑盒。以紫蘇18SrRNA作為內(nèi)參基因[7]，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系（10 μL）：2 ×RealStar Green Power Mixture 5 μL，RNase-free H2O 4.4 μL，上下游引物各 0.2 μL，模板cDNA 0.2 μL；反應(yīng)條件為 95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60℃1 min，40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PfFAD2基因全長(zhǎng)cDNA序列及編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

紫蘇FAD2基因全長(zhǎng)cDNA序列1 545 bp，ORF為1 149 bp，共編碼382個(gè)氨基酸殘基（圖1），紫蘇FAD2蛋白相對(duì)分子量為43.668 47 ku；分子式為C2033H3038N516O532S14，原子總數(shù)為6 133，脂溶系數(shù)為90.29，總平均親水系數(shù)為-0.019，不穩(wěn)定系數(shù)為36.58，屬于穩(wěn)定性蛋白。

利用ProtScale在線分析FAD2蛋白的親疏水性，結(jié)果表明，F(xiàn)AD2蛋白在264位氨基酸殘基處有最高值，是2.622；在369位氨基酸殘基處有最低值，是-3.033，且以0為分界線，0以上代表疏水性氨基酸，0以下代表親水性氨基酸。所以，F(xiàn)AD2蛋白是親水性蛋白（圖2）。

紫蘇FAD2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)表明，F(xiàn)AD2蛋白有6個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)，分別在52～69位、82～104位、114～136位、178～195位、222～239位、246～268位氨基酸（圖 3）。

通過NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫對(duì)紫蘇FAD2進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明，F(xiàn)AD2蛋白含有PLN02505保守結(jié)構(gòu)域，屬于Membrane-FADS-like超蛋白家族（圖 4）。

運(yùn)用SOPMA對(duì)紫蘇FAD2蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋（38.37%）、無規(guī)則卷曲（31.41%）、延伸鏈（23.04%）、β-轉(zhuǎn)角（9.16%）4種結(jié)構(gòu)元件組成。通過SWISS-MODEL在線軟件對(duì)該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖5所示。

利用MEGA 6.0多序列比對(duì)軟件對(duì)紫蘇（Perilla frutescens）及蓖麻（Ricinus communis）、油桐（Vernicia fordii）、芝麻（Sesamum indicum）、芡歐鼠尾草（Salvia hispanica）、紅花（Carthamus tinctorius）等FAD2蛋白序列進(jìn)行了比對(duì)分析，并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析結(jié)果表明，紫蘇與芡歐鼠尾草的親緣關(guān)系較近，與紅花的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖6）。

2.2 PfFAD2基因表達(dá)特性分析

為進(jìn)一步了解FAD2基因在紫蘇不同組織中的表達(dá)特性，本研究利用熒光定量PCR技術(shù)分析了該基因在晉紫蘇1號(hào)不同組織及不同發(fā)育時(shí)期的種子中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖7所示。FAD2在紫蘇的不同組織器官中均有表達(dá)，并且在開花后20 d的種子中表達(dá)量最高，在其他組織中只是微量表達(dá)。

3 結(jié)論與討論

脂肪酸去飽和酶FAD2（fatty acid desaturase 2）屬于ω-6脂肪酸脫氫酶（ω6 fatty acid desaturase），是廣泛存在于植物中的一種能催化油酸（oleic acid，C18∶1Δ9）脫氫生成亞油酸（linoleicacid，LA，C18∶2Δ9，12）的還原酶。亞油酸能有效降低血液中膽固醇含量[8]，是α-亞麻酸、花生四烯酸等重要多不飽和脂肪酸合成的前體，具有廣泛的藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[9-11]。PENG等[12]通過對(duì)油菜FAD2和FAE1基因的抑制表達(dá)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，油酸含量由15%提高到80%，多不飽和脂肪酸含量降至10%，而對(duì)人體有害的芥酸含量則降為0；TOPFER等[13]通過導(dǎo)入FAD2基因的反義基因，阻止FAD2基因表達(dá)，結(jié)果獲得了油酸含量83%的轉(zhuǎn)基因油菜。也有研究表明，過表達(dá)FAD2基因可以有效提高亞油酸的含量。崔琴琴[14]將FAD2基因?qū)胝臣t酵母中，結(jié)果表明，油桐FAD2基因的過表達(dá)能夠調(diào)節(jié)酵母的亞油酸含量，轉(zhuǎn)FAD2酵母亞油酸含量分別提高102.85%，81.95%，21.80%。趙娜等[15]在亞油酸缺失的擬南芥fad2突變體中導(dǎo)入文冠果FAD2基因，使得突變體中產(chǎn)生了亞油酸。

為進(jìn)一步了解FAD2基因在紫蘇脂肪酸合成機(jī)制中的調(diào)控作用，本試驗(yàn)對(duì)FAD2進(jìn)行了較為詳細(xì)的生物信息學(xué)分析，并研究了FAD2在晉紫蘇1號(hào)的不同組織及不同發(fā)育時(shí)期的種子中的表達(dá)特性，結(jié)果表明，該基因cDNA全長(zhǎng)序列為1 545 bp，共編碼382個(gè)氨基酸殘基，紫蘇FAD2蛋白含有PLN02505保守結(jié)構(gòu)域，屬于Membrane-FADS-like超蛋白家族。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，紫蘇與芡歐鼠尾草的親緣關(guān)系較近，與紅花的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。周菲等[16]研究了脂肪酸脫氫酶基因FAD2-1在向日葵種子中的表達(dá)特異性，結(jié)果顯示，該基因在12～22 d的時(shí)候表達(dá)量達(dá)到高峰。本研究分析結(jié)果表明，紫蘇FAD2基因在開花后20 d的種子中高效表達(dá)，這與周菲等[16]的研究結(jié)果相似。

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