秦莉霞，吳 倩，夏鵬，高麗娟，徐世軍＊＊

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)腦病藥物整合轉(zhuǎn)化研究所 成都 611137）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer Disease，AD）是一種復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病，是老年癡呆最常見的形式，隨著社會人口老齡化的加劇，AD發(fā)病率隨之增加，AD給家庭乃至社會帶來的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)也將日益加劇。磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B（Phosphatidyl alcohol kinase/protein kinase B；PI3K/AKT）信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)通路之一，參與細(xì)胞增殖、能量代謝、葡萄糖代謝等多種生物學(xué)途徑[1]。多項(xiàng)研究顯示該信號通路參與AD多項(xiàng)病理進(jìn)程[2]。中醫(yī)認(rèn)為AD屬于“癡呆”等范疇，其病癥以瘀阻脈絡(luò)、濁毒痹阻為主，基于以上病機(jī)，中醫(yī)臨床防治AD以解毒通絡(luò)、醒神開竅等為主。參芪益智顆粒是王永炎教授治療AD的臨床經(jīng)驗(yàn)方，前期研究提示對5XFAD小鼠和APP/PS1小鼠有一定的抗癡呆作用[3,4]。但其對Aβ1-42雙側(cè)海馬注射AD模型大鼠的作用和PI3K/AKT信號通路的影響還未涉及。

1 材料

1.1 藥物與試劑

參芪益智顆粒，北京師范大學(xué)，批號：20151215；鹽酸多奈哌齊片，衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，批號：1511048；Aβ1-42，杭州中肽生化有限公司，批號：CK0500748；Thermo Scientific Gene JET RNA Purification Kit，賽默飛世爾科技公司，批號：K0731；Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，賽默飛世爾科技公司，批號：K1622；SYBR Premix Dimer Eraser TM（Perfect Real Time），寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，批號：RR091A；PI3K抗體，abcam，批號：ab151549；AKT抗體，Cell Signaling Technology，批號：#4685。

圖1 參芪益智顆粒對Aβ1-42雙側(cè)注射AD大鼠Morris水迷宮的影響

引物序列如下：

1.2 動物

SPF級，SD大鼠，40只，全雄，體質(zhì)量220-260 g，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供，合格證：NO：0012338。

1.3 儀器

Exp Trade C0.Ltd Morris水迷宮系統(tǒng)，成都泰盟軟件有限公司；BA400Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；ND2000PCR擴(kuò)增儀，美國BIO-RAD公司；i Cycler iQ Multicolor Real-Time PCR Detection System，美國BIO-RAD公司；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，美國Media Cybernetics公司。

2 方法

2.1 動物造模及分組

參照文獻(xiàn)[5]，制備Aβ1-42（2 μg·uL-1）寡聚體，并造模[6]，假手術(shù)組動物雙側(cè)海馬注射生理鹽水，其余步驟相同。造模成功大鼠30只，隨機(jī)分為模型組（Model），陽性組（安理申組，Aricept，1.17 mg·kg-1），參芪益智顆粒高劑量組（SYG-H，9.8 g·kg-1），參芪益智顆粒中劑量組（SYG-M，4.9 g·kg-1），參芪益智顆粒低劑量組（SYG-L，2.45 g·kg-1），每組6只，另取假手術(shù)組動物6只作為空白對照（Control）。各組動物灌胃給予等體積相應(yīng)藥物（10 ml·kg-1），空白組和模型組灌胃給予等體積蒸餾水。1次/天，連續(xù)給予60天。

2.2 學(xué)習(xí)記憶功能檢測

給藥55天后，進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[7]，期間繼續(xù)給藥。定向航行實(shí)驗(yàn)連續(xù)5天，記錄各組動物逃避潛伏期，定向航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后撤去平臺，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄各動物穿越平臺目標(biāo)象限的時間、穿越平臺目標(biāo)象限的次數(shù)、穿越平臺次數(shù)及穿越平臺區(qū)域次數(shù)。

2.3 HE染色

Morris水迷宮檢測結(jié)束后，處死大鼠。取腦組織，10%甲醛固定，梯度脫水，包埋，切片（5 μm），脫蠟，染色，封片，鏡檢。

2.4 腦組織PI3KmRNA、AKT mRNA的表達(dá)

取海馬，加Lysis buffer工作液和Proteinase K工作液，提取總RNA；反轉(zhuǎn)錄：42℃ 60 min，70℃ 5 min；PCR反應(yīng)：95℃ 30 s，（95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s）40個循環(huán)；計(jì)算相對于GAPDH mRNA的表達(dá)，-△△Ct=（藥物組目的基因Ct值-藥物組內(nèi)參基因Ct值）-（空白組目的基因Ct值-空白組內(nèi)參基因Ct值）。

2.5 腦組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)

大鼠處死，取腦組織、免疫組化測定PI3K、AKT蛋白含量。測定平均光密度（IA）。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s±s）表示，Morris水迷宮逃避潛伏期用雙因素方差分析，其余符合正太分布數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-way ANOVA），不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用兩個獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 參芪益智顆粒對Aβ1-42雙側(cè)注射AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

圖2 參芪益智顆粒對Aβ1-42雙側(cè)注射AD大鼠海馬CA3區(qū)病理形態(tài)學(xué)的影響

圖3 參芪益智顆粒對Aβ1-42雙側(cè)注射AD大鼠海馬PI3K/AKT基因表達(dá)的影響

由圖1可知，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組動物逃避潛伏期均有不同程度的縮短。與空白組相比，模型組動物逃避潛伏期明顯延長（F=80.13；P＜0.001），進(jìn)入平臺象限次數(shù)、穿越平臺象限百分比明顯縮短（P＜0.05）；與模型組相比，參芪益智顆粒各劑量組逃避潛伏期均明顯縮短，其中，高劑量組（F=19.35；P＜0.001）；中劑量組（F=29.48；P ＜0.001）；低劑量組（F=24.14；P＜0.001）；進(jìn)入平臺象限次數(shù)和穿越平臺象限百分比均明顯增加（P＜0.05）。

3.2 參芪益智顆粒對Aβ1-42雙側(cè)注射AD模型大鼠海馬組織病理形態(tài)學(xué)的影響

與空白組相比，模型組海馬錐體細(xì)胞（Pyramidal cells，PC）數(shù)量減少且排列紊亂、神經(jīng)細(xì)胞（nerve cell，NC）出現(xiàn)空泡化、壞死等現(xiàn)象。與模型組相比，參芪益智顆粒各劑量組動物海馬錐體細(xì)胞排列整齊，神經(jīng)元數(shù)量減少、空泡化、壞死等現(xiàn)象均有所改善（圖2）。

3.3 參芪益智顆粒對Aβ1-42雙側(cè)注射AD模型大鼠海馬PI3K、AKT蛋白及基因表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組PI3K、AKT蛋白及mRNA相對表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，參芪益智顆粒各劑量組PI3K、AKT蛋白呈明顯激活狀態(tài)（P＜0.05），mRNA相對表達(dá)有增加趨勢（P ＞ 0.05）（圖3、圖4、圖5、圖6）。

4 討論

圖4 各組大鼠海馬PI3K的表達(dá)

圖5 各組大鼠海馬AKT的表達(dá)

圖6 參芪益智顆粒對Aβ1-42雙側(cè)注射AD大鼠腦組織PI3K/AKT蛋白表達(dá)的影響

AD在中醫(yī)屬“呆癡”等范疇，腦失所養(yǎng)、腎精虧虛是其主要發(fā)病基礎(chǔ)，其發(fā)病部位雖然主要在腦，五臟六腑功能失調(diào)與其發(fā)病同樣密切相關(guān)[8]。早在二十世紀(jì)初，王永炎教授就提出“毒損腦絡(luò)”可作為中醫(yī)治療癡呆新的切入點(diǎn)[3]。參芪益智顆粒是王永炎教授長期臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上提煉的組方，方由黃芪、黃芩、人參等藥配伍組成，共奏益氣健脾、安神益智、解毒通絡(luò)之功效。方中各藥有效成分，如黃芩多種有效成分[9]，人參皂苷[10,11]，黃芪多糖[12]，丹參有效成分[13]等，對多種 AD細(xì)胞、動物模型病理進(jìn)程具有不同程度的改善作用。前期實(shí)驗(yàn)提示，該方可減少腦內(nèi)老年斑的沉積、抑制膠質(zhì)細(xì)胞過度活化、減少腦內(nèi)Aβ1-42的含量，改善5XFAD小鼠學(xué)習(xí)記憶功能[3]，也可以通過調(diào)節(jié)外周血清MMP2和VEGF的含量來改善APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶功能、自發(fā)性探索運(yùn)動活性和焦慮行為[8]。PI3K/AKT信號通路是胞內(nèi)調(diào)控細(xì)胞增殖、分化的重要的途徑之一，可參與調(diào)節(jié)包括AD在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[14]。多種AD動物模型[15]、細(xì)胞模型[16]均顯示PI3K/AKT信號通路明顯抑制，該信號通路的抑制與脂糖代謝障礙[17,18]、認(rèn)知功能障礙[19]、等密切相關(guān)，而AD病理過程中伴隨明顯的葡萄糖代謝障礙和認(rèn)知功能損傷。Aβ的聚集被視為AD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[20]，其在腦內(nèi)的異常聚集，可誘導(dǎo)一系列神經(jīng)毒性作用從而導(dǎo)致AD的發(fā)生[21]，故Aβ1-42誘導(dǎo)的動物、細(xì)胞模型被廣泛應(yīng)用于AD研究。報(bào)道顯示該模型動物可見明顯學(xué)習(xí)記憶障礙[22]，同時PI3K/AKT信號通路呈明顯抑制狀態(tài)[23]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，經(jīng)參芪益智顆粒干預(yù)后，該模型動物學(xué)習(xí)記憶能力顯著改善，PI3K、AKT蛋白水平上明顯激活，基因水平上也可見明顯趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能是動物樣本個體差異，數(shù)據(jù)偏差過大所致。綜上可知，參芪益智顆粒改善Aβ1-42雙側(cè)海馬注射AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能可能與以下兩方面有關(guān)：直接改善腦內(nèi)AD病理變化；激活腦內(nèi)PI3K/AKT信號通路，延緩AD進(jìn)程。