任啟霞 崔 瓊 解承娟

(青海省第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，青海 西寧 810001)

阿爾茨海默病(AD)臨床主要表現(xiàn)為記憶力下降，言語、認(rèn)知等功能受到損害〔1〕。目前AD的發(fā)生機(jī)制尚未明確，神經(jīng)元丟失、老年斑產(chǎn)生及神經(jīng)纖維的聚集可能是其發(fā)生的重要原因〔2〕。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一種廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能夠通過三級級聯(lián)反應(yīng)將外界信號傳遞到細(xì)胞核，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞生長、發(fā)育、分化、凋亡等過程〔3～5〕。p38 MAPK在外界刺激如滲透壓變化、紫外線、生理應(yīng)激、缺氧、高糖、高脂等刺激下會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，被稱為應(yīng)激MAPK信號通路〔6〕。已有研究表明，p38 MAPK在AD腦組織中被激活〔7〕，但在外周血中的表達(dá)尚未見報(bào)道，且p38 MAPK在AD的發(fā)生發(fā)展中的作用報(bào)道較少，本研究將進(jìn)一步探討p38 MAPK在AD患者外周血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 根據(jù)美國國立神經(jīng)病語言障礙腦卒中和阿爾茨海默病及相關(guān)疾病學(xué)會(huì)(NINCDS-ADRDA)AD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，收集2015年3月至2017年3月青海省第三人民醫(yī)院進(jìn)行診斷的82例AD患者，其中男32例，女50例，年齡67～82〔平均(68.9±1.56)〕歲，病程1.2～4.3年。患者均無自身免疫性疾病或內(nèi)分泌性疾病，也無因腦血管、腦外傷等導(dǎo)致的血管癡呆，家族無精神病史。同時(shí)期在本院進(jìn)行健康體檢的志愿者20例，男6例，女14例，年齡68～82〔平均(70.1±2.32)歲〕。患者或家屬知情同意，并由我院倫理委員會(huì)通過。

1.2試劑與儀器 四甲基偶氮唑鹽(MTT)、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Hyclone公司；p38 MAPK抑制劑SB203580、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、Annexin V-FITC/PI流式雙染試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人p38 MAPK，pp38 MAPK，B淋巴細(xì)胞瘤，Bcl-2，Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)，p53，酶切天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體均購自美國Abcam公司；Caspase3活性檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司。MK3酶標(biāo)儀購自美國thermo公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；DYCZ-25D型雙垂直電泳儀，DYCZ-25D型轉(zhuǎn)印電泳儀均購自北京六一生物科技有限公司；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司。

1.3淋巴細(xì)胞的獲得 研究對象均于空腹前抽取10 ml靜脈血于抗凝管中，室溫靜置2 h后，加入等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻，后以1∶2的比例緩慢將混合液加入淋巴細(xì)胞分離液中，1 500 r/min離心15 min，此時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分層，由上至下第2層即為淋巴細(xì)胞層，小心取此層細(xì)胞液，反復(fù)清洗離心2次，即可獲得外周血淋巴細(xì)胞，然后采用Western印跡檢測外周血中p38 MAPK的表達(dá)。

1.4分組 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。PC12細(xì)胞隨機(jī)分為正常組、模型組和SB203580組，模型組及SB203580組采用20 μmol/L β淀粉樣蛋白(Aβ25～35)構(gòu)建PC12細(xì)胞損傷模型。

1.5MTT法檢測細(xì)胞活力 將5×103個(gè)PC12細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，按1.4分組給藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入20 μl終濃度為5 mg/ml 的MTT孵育4 h，翻轉(zhuǎn)96孔板舍棄上清液，再加入150 μl的二甲基亞砜，震蕩使結(jié)晶物溶解，于酶標(biāo)儀波長560 nm處測OD值，即代表細(xì)胞活力。

1.6Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡情況 將8×103個(gè)PC12細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，按1.4分組給藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每組收集1×105/ml個(gè)細(xì)胞，加入500 μl結(jié)合緩沖液吹打混勻后，再按順序?qū)? μl Annexin V-FITC及5 μl PI加入，繼續(xù)吹打混勻，在室溫條件下避光孵育10 min，于1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。

1.7紫外分光光度法檢測Caspase3活性 將8×103個(gè)PC12細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，按1.4分組給藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞上清液，按照Caspase3活性檢測試劑盒檢測Caspase3活性。

1.8Western印跡檢測p38 MAPK、pp38 MAPK、Bax、Bcl-2、p53、酶切Caspase3蛋白表達(dá) 在冰浴條件下收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解30 min，在4℃條件下離心，收獲上清液即總蛋白。采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。制作5%濃縮膠，12%分離膠，室溫水封靜置30 min。蛋白變性，上樣，進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗溶液(兔抗人p38 MAPK、pp38 MAPK、Bax、Bcl-2、p53、酶切Caspase3及GAPDH多克隆抗體，稀釋度為1∶100)孵育，4℃過夜；二抗溶液室溫孵育1 h。在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用Quantity one軟件分析各抗體條帶灰度值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1p38 MAPK在AD患者外周血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)及激活情況 AD患者外周血淋巴細(xì)胞中p38 MAPK表達(dá)量(1.04±0.12)與健康志愿者(0.98±0.11)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而AD患者外周血淋巴細(xì)胞中pp38 MAPK表達(dá)量(1.12±0.12)顯著高于健康志愿者(0.34±0.03，P<0.01)。見圖1。

2.2SB203580對Aβ25～35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞活力的影響 與正常組(0.68±0.07)比較，模型組細(xì)胞活力(0.38±0.04)降低，與模型組比較，SB203580組(0.59±0.06)顯著提高(均P<0.01)。見圖2。

2.3SB203580對Aβ25～35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響 與正常組(3.18%±0.31%、2.56%±0.25%)比較，模型組細(xì)胞早期凋亡率(21.49%±2.15%)及晚期凋亡率(18.32%±1.83%)均顯著提高，與模型組比較，SB203580組(7.55%±0.75%、3.24%±0.32%)均顯著降低(P<0.01)。

2.4SB203580對Aβ25～35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中Bcl-2及Bax表達(dá)的影響 與正常組Bcl-2(0.42±0.04)、Bax(0.20±0.02)比較，模型組中Bcl-2表達(dá)(0.15±0.10)下調(diào)，Bax表達(dá)(0.48±0.05)上調(diào)(均P<0.01)，與模型組比較，SB203580組中Bcl-2表達(dá)(0.32±0.03)上調(diào)，Bax表達(dá)(0.26±0.03)下調(diào)(均P<0.01)。見圖2。

2.5SB203580對Aβ25～35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中p53及酶切Caspase3表達(dá)的影響 與正常組p53(0.13±0.01)、酶切Caspase3(0.16±0.01)比較，模型組中p53(0.42±0.04)及酶切Caspase3(2.19±0.22)表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，與模型組比較，SB203580組(0.17±0.02,0.18±0.02)均表達(dá)下調(diào)(P<0.01)。見圖3。

2.6SB203580對Aβ25～35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中Caspase3活性的影響 與正常組Caspase3活性〔(0.56±0.05)μg/ml〕比較，模型組〔(4.38±0.43)μg/ml〕顯著提高，與模型組比較，SB203580組〔(1.12±0.11)μg/ml〕顯著降低(均P<0.01)。

圖2 SB203580對Aβ25～35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中Bcl-2及Bax表達(dá)的影響

圖3 SB203580對Aβ25～35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中p53及酶切Caspase3表達(dá)的影響

3 討 論

本研究提示p38 MAPK對AD的發(fā)生發(fā)展可能起著促進(jìn)作用。神經(jīng)元及突觸的丟失、神經(jīng)纖維的聚集及老年斑的產(chǎn)生是AD的主要病理特征〔2〕。Aβ沉積是老年斑形成的主要原因，是AD發(fā)生及發(fā)展的重要因素〔2〕。Aβ包括Aβ1～40、Aβ1～42、Aβ25～35 3個(gè)片段，其中Aβ25～35不僅能夠促進(jìn)老年斑形成，還對神經(jīng)元具有毒性作用，是模擬AD模型的主要片段之一，是目前AD治療的主要靶點(diǎn)之一〔8〕。另外SB203580是p38 MAPK特異性抑制劑，是探討p38 MAPK信號通路阻斷后細(xì)胞后續(xù)應(yīng)答反應(yīng)的常用抑制劑〔6〕。因此本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)并預(yù)實(shí)驗(yàn)〔8〕，結(jié)果提示阻斷p38 MAPK信號通路能夠抑制Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。

Bcl-2是研究最為廣泛的抑制凋亡蛋白，能夠與促凋亡蛋白Bax形成異二聚體，阻斷凋亡信號的傳遞，而且還能夠抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)細(xì)胞存活及生長。Bax能夠自身形成二聚體，將凋亡信號傳遞給Caspase家族，促使級聯(lián)放大，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase3是Caspase家族下游蛋白，正常生理?xiàng)l件下，以無活性蛋白形式存在，在凋亡因素的刺激下，Caspase3被激活并被切割成酶切Caspase3，導(dǎo)致DNA斷裂，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)有研究報(bào)道通過下調(diào)pp38 MAPK表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)Bcl-2表達(dá)，抑制酶切Caspase3表達(dá)，能夠顯著的治療膽固醇誘導(dǎo)的大鼠動(dòng)脈粥樣硬化〔9〕。降低p38 MAPK磷酸化水平，進(jìn)而提高Bcl-2表達(dá)及Bcl-2/Bax比例，能夠顯著抑制放射誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷〔10〕。本研究結(jié)果表明SB203580能顯著上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax、p53及酶切Caspase3表達(dá)，降低Caspase3活性，最終抑制Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。

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3Reig I，Boixeda P，F(xiàn)leta B，etal.Neurofibromatosis-noonan syndrome：case report and clinicopathogenic review of the Neurofibromatosis-Noonan syndrome and RAS-MAPK pathway〔J〕.Dermatol Online J，2011；17(4)：4.

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5劉婷婷，張淑萍，覃筱燕，等.MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與神經(jīng)損傷研究進(jìn)展〔J〕.中國公共衛(wèi)生，2016；32(2)：248-54.

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8申茉函，王全才，楊 麗.β淀粉樣蛋白1～42促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2015；35(13)：3498-501.

9Bayatmakoo R，Rashtchizadeh N，Yaghmaei P，etal.Atorvastatin inhibits cholesterol-induced caspase-3 cleavage through down-regulation of p38 and up-regulation of Bcl-2 in the rat carotid artery〔J〕.Cardiovasc J Afr，2017；28：1-6.

10Zhang W，Li Y，Li R，etal.Sodium tanshinone IIA sulfonate prevents radiation-induced toxicity in H9c2 cardiomyocytes〔J〕.Evid Based Complement Alternat Med，2017；2017：4537974.