郝凱華 胡鵬斌 韓 宇 韓 濤

(甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000)

松科植物雪松松針富含黃酮類化合物〔1〕。松針性溫、味苦，入肝、腎、脾經(jīng)，具祛風活絡、活血止血、消腫生肌之功效，能治濕瘡，安五臟〔2〕?，F(xiàn)代研究表明雪松具有抗腫瘤、抗氧化、抑菌等多種藥理活性〔3〕。我國雪松松針資源豐富，分布廣泛，極易采收，可再生。此外，研究證實黃酮類化合物抗腫瘤藥理活性廣泛，作用于腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié)〔4～6〕，具良好抗腫瘤作用，是一類值得深入挖掘并具開發(fā)價值的物質(zhì)〔7,8〕，目前尚未見雪松松針總黃酮(TFCD)抗腫瘤活性研究報道。本文觀察TFCD的體外抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1藥品、材料與儀器 TFCD由甘肅省醫(yī)學科學研究院藥物研究所提供(純度：54.28%)。人宮頸癌HeLa細胞株(蘭州大學醫(yī)學院)，人胃癌細胞株MKN28(蘭大二院消化系腫瘤重點實驗室)，人肺癌細胞株A549及人肝癌細胞株HepG2(甘肅省醫(yī)學科學研究院轉化醫(yī)學中心)，人膠質(zhì)瘤細胞株SHG44(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨研所)。RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone)，胎牛血清(FBS，上海尚寶生物科技有限公司)，RnaseA，5-氟尿嘧啶(5-FU，上海銳聰科技發(fā)展有限公司)，PI細胞周期檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。X-mark酶標儀(BioRad公司)，F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀(Becton-Dickinson公司)。

1.2MTT法檢測TFCD對5種腫瘤細胞增殖的影響 分別取對數(shù)生長期的HeLa、MKN28、A549、HepG2及SHG44細胞，消化，制備濃度為2.5×104個/ml細胞懸液。將細胞接種到96孔板中，每孔200 μl，培養(yǎng)24 h，加藥，使藥物終濃度分別為0、5、10、20、30、40、50、60、80、100 μg/ml。37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h后，各孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，棄掉培養(yǎng)孔中液體，每孔加入150 μl DMSO完全溶解紫色結晶，于570 nm處測定吸光度，計算增殖抑制率。

1.3流式細胞儀檢測TFCD對HepG2細胞周期的影響〔9〕取對數(shù)生長期的HepG2細胞，接種于6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別加入終濃度為0、10、20、40、80、160 μg/ml的TFCD藥液，培養(yǎng)48 h后，吸棄培養(yǎng)液，消化細胞，制備單細胞懸液，收集細胞，清洗細胞2次，于70%乙醇中4℃條件下固定，過夜，次日除去70%乙醇，清洗細胞2次，加入100 μl RnaseA(濃度100 μg/ml)，37℃水浴30 min，加入400 μl PI(100 μg/ml)，4℃避光染色30 min后，用流式細胞儀進行細胞周期分析。

1.4Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測TFCD對HepG2細胞凋亡的影響〔9〕將對數(shù)生長期的HepG2細胞，消化，接種于6孔板中，于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，加入終濃度分別為0、10、20、40、80、160 μg/ml的TFCD，37℃ 5%CO2培養(yǎng)48 h后，消化收集細胞，洗滌細胞2次，收集5×105個細胞，400 μl結合緩沖液懸浮細胞，加入5 μl Annexin V-FITC，5 μl PI，混勻后，室溫、避光、反應15 min，用流式細胞儀檢測(Ex=488 nm;Em=530 nm)細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1形態(tài)學觀察 與空白對照組比較，加入不同濃度藥物后，A549、HepG2及SHG44細胞形態(tài)由規(guī)則菱形和梭形逐漸變圓，連接逐漸消失，數(shù)目減少，增殖活力顯著下降。HeLa、MKN45細胞數(shù)目逐漸增加，細胞間連接致密。

2.2MTT法檢測腫瘤細胞增殖抑制率 不同濃度TFCD作用于HeLa和MKN45細胞48 h，TFCD≥60 μg/ml時，對HeLa細胞增殖產(chǎn)生抑制作用(P<0.05)。TFCD≥40 μg/ml時，對MKN45細胞增殖產(chǎn)生抑制作用，且有量-效關系(P<0.05)。不同濃度TFCD作用于A549、HepG2和SHG44細胞48 h后，均有增殖抑制作用，其中對A549、HepG2細胞抑制作用有量-效關系(P<0.05)，其IC50分別為211.39 μg/ml和114.12 μg/ml，當TFCD濃度為100 μg/ml時，對HepG2細胞抑制率為(50.94±6.11)%。見表1。

表1 TFCD對腫瘤細胞增殖抑制率的影響

-：TFCD對腫瘤細胞增殖無抑制作用；與本組細胞前一濃度組比較：1)P<0.05

2.3TFCD對HepG2細胞周期的影響 隨TFCD濃度增加，G0/G1期細胞比例逐漸增高，S期及G2/M期的細胞比例降低。當TFCD為40 μg/ml和80 μg/ml時，與空白對照組相比阻滯作用顯著(P<0.05)；當TFCD為160 μg/ml時，G0/G1期細胞比例與空白對照組相比具極顯著差異(P<0.01)；表明TFCD能夠影響HepG2腫瘤細胞周期進程，使其停滯于G0/G1期，且此作用具有濃度依賴性。見表2。

表2 TFCD對HepG2細胞周期影響

與空白對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.4TFCD對HepG2細胞凋亡的影響 不同濃度TFCD作用于HepG2細胞48 h后隨著TFCD濃度的增加，HepG2細胞凋亡率逐漸升高。當藥物濃度為10、20 μg/ml時凋亡率為(8.32±0.94)%、(12.71±1.29)%，與空白對照組〔(8.72±1.69)%〕相比誘導凋亡作用顯著(P<0.05)；當濃度為40、80、160 μg/ml時，凋亡率分別為(20.53±2.07)%、(33.86±1.17)%、(64.56±2.05)%，與空白對照組有極顯著差異(P<0.01)，表明TFCD能夠誘導HepG2細胞凋亡，且此作用具有濃度依賴性。

3 討 論

研究證實黃酮類化合物對腫瘤細胞具有生長抑制及促凋亡作用〔10,11〕，本研究結果顯示TFCD能夠體外抑制不同腫瘤細胞增殖，并具劑量依賴性，但該作用較平緩。腫瘤細胞增殖受到細胞周期調(diào)控，若其周期調(diào)控紊亂，則可導致細胞無限增殖，G0/G1期對細胞周期調(diào)控及增殖起著極為關鍵作用，正常機體細胞因受到嚴格細胞周期調(diào)控、啟動、監(jiān)控，從而有節(jié)制增殖。誘導腫瘤細胞凋亡，是抑制腫瘤發(fā)展的重要手段之一〔12～14〕。本研究發(fā)現(xiàn)，隨TFCD濃度升高，HepG2細胞停滯于G0/G1期比例呈增加趨勢，凋亡率亦逐漸升高，并呈現(xiàn)劑量依賴性。本研究與何光志等〔15〕運用皂角刺總黃酮，選用HepG2細胞進行體外抗腫瘤研究，不同濃度皂角刺總黃酮作用48 h后，能顯著抑制并誘導HepG2細胞增殖及凋亡，并隨給藥濃度增加作用增強。

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