丁文波 楊 璐 宮兆奇 李明欣

(丹東市中心醫(yī)院骨外一科，遼寧 丹東 118000)

糖皮質(zhì)激素(以下簡(jiǎn)稱“激素”)的過度使用，所造成的副作用是極其嚴(yán)重的。臨床上將該類由激素引起的股骨頭壞死統(tǒng)稱為激素性股骨頭壞死(SANFH)〔1〕。目前，SANFH機(jī)制尚無統(tǒng)一的結(jié)論，研究發(fā)現(xiàn)，使用激素處理成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞可促進(jìn)其凋亡，從而導(dǎo)致骨細(xì)胞數(shù)量減少，最終引起股骨頭壞死〔2〕。激素可能通過結(jié)合成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及骨細(xì)胞的表面受體，從而調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)某些基因轉(zhuǎn)錄和翻譯〔3〕。持續(xù)使用激素?cái)?shù)周可顯著促進(jìn)小鼠體內(nèi)成骨細(xì)胞凋亡，同時(shí)也可引起大量的皮質(zhì)骨干骺端的骨細(xì)胞凋亡，該凋亡過程可能是由于激素誘導(dǎo)了凋亡相關(guān)基因的表達(dá)〔4〕。他汀類藥物除降脂功能外，其抗感染作用，清除自由基，抗氧化作用，促血管生成及修復(fù)血管內(nèi)皮功能等功效也被廣泛報(bào)道〔5〕。他汀類藥物可以通過提高骨細(xì)胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)2的表達(dá)以促進(jìn)成骨作用，并降低破骨細(xì)胞的活性〔6，7〕；還可以通過抑制激素誘導(dǎo)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成脂化，最終促進(jìn)成骨分化〔8〕。輔酶Q10又稱作癸烯醌、泛醌和維生素Q10，可以參與線粒體氧化磷酸化和ATP的產(chǎn)生，調(diào)控細(xì)胞氧化還原的環(huán)境；也可以在電子穿膜過程中攜帶還原電子進(jìn)入囊泡內(nèi)或帶出到胞外，并參與內(nèi)膜和質(zhì)膜之間的質(zhì)子梯度的形成〔9，10〕。此外，在病變組織中加入外源性輔酶Q10，可有效緩解組織中輔酶Q10 缺乏的狀態(tài)，并且可以維持細(xì)胞膜上離子通道的完整，進(jìn)而使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定；同時(shí)輔酶Q10的脂溶特性還可以使其通過血腦屏障，抑制脂質(zhì)造成的細(xì)胞過氧化損傷，進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡〔11，12〕。本文擬分析輔酶Q10發(fā)揮輔助辛伐他汀治療兔SANFH的作用及可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1試劑及藥物 輔酶 Q10(30 mg/片，能氣朗)購自衛(wèi)才藥業(yè)有限公司，地塞米松磷酸鈉注射液購自焦作福瑞堂制藥有限公司，乙二胺四乙酸(EDTA)-Tris 緩沖液(100 g/L)購自上海士鋒生物科技有限公司，辛伐他汀分散片(辛可)購自廣州市南新制藥有限公司，0.9%氯化鈉注射液(250 ml)購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司，10%中性甲醛溶液(0.1 mol/L，pH7.4)購自上海哈靈生物科技有限公司。

1.2構(gòu)建兔SANFH模型 將健康成年新西蘭大白兔隨機(jī)分成空白對(duì)照組15 只和實(shí)驗(yàn)組60只。向?qū)嶒?yàn)組兔雙側(cè)臀大肌以20 mg/kg劑量左右交替注射地塞米松磷酸鈉，1次/w，持續(xù)6 w制備兔SANFH模型。6 w后將造模成功的45只兔隨機(jī)分成模型組、辛伐他汀組和辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組各15只。分組方案及給藥情況如下：對(duì)照組左右交替通向大白兔雙側(cè)臀大肌注射0.9%氯化鈉注射液；注射6 w后用蒸餾水灌胃。造模成功后，模型組蒸餾水灌胃。辛伐他汀組以辛伐他汀10 mg·kg-1·d-1灌胃治療。辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組以辛伐他汀 10 mg·kg-1·d-1和輔酶 Q10 30 mg/kg灌胃給藥。灌胃8 w后進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)。

1.3一般情況觀察及骨細(xì)胞凋亡檢測(cè) 觀察記錄各組兔體重、精神狀況、飲食狀況及毛發(fā)變化(如光澤度)，為了避免兔子雙腿的負(fù)重，應(yīng)適當(dāng)降低飼養(yǎng)籠中飲水及飼料的高度，以有利于股骨頭壞死的治療。處死兔后，術(shù)區(qū)消毒、剪毛，逐層分離暴露髖關(guān)節(jié)嚢，切開關(guān)節(jié)嚢后取下股骨頭。之后對(duì)去除的股骨頭進(jìn)行解剖，對(duì)股骨頭形態(tài)，光澤及軟骨顏色進(jìn)行觀察。骨細(xì)胞凋亡的檢測(cè)采用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)。將組織切片染色后，當(dāng)胞核出現(xiàn)黃色顆粒，即凋亡細(xì)胞，圖中以綠色熒光表示。

1.4實(shí)驗(yàn)兔血清乳酸(LA)含量的測(cè)定 使用商業(yè)化試劑盒(購自武漢艾美捷科技有限公司)，嚴(yán)格按照廠商說明書中的步驟進(jìn)行測(cè)定。

1.5實(shí)驗(yàn)兔血清超氧化物歧化酶(SOD )活性的測(cè)定 使用商業(yè)化試劑盒(購自武漢艾美捷科技有限公司)，嚴(yán)格按照廠商說明書中的步驟進(jìn)行測(cè)定。

1.6實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定BMP2的基因表達(dá) 組織剪碎至EP管，Trizol試劑法提取總RNA。最后用75%乙醇洗滌總RNA兩次，自然晾干，用焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解。紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280的比值，在1.8～2.1范圍內(nèi)視為總RNA純度較高，可以使用。反轉(zhuǎn)錄用 TaKaRa PrimeScript 試劑盒的 SYBR GreenAssay根據(jù)廠家說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系如下：2 μl 5×PrimeScript緩沖液，Prime Script RT Enzyme，Oligo dT Primer和Random 6mers 各0.5 μl，總 RNA 定量到500 ng，加入不含RNase的雙蒸水，得到的終體系為10 μl。然后用得到的cDNA為模板采用 7300 Real-time PCR 系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系為：2 μl cDNA模板，上游引物和下游引物各0.5 μl，5 μl 2×混合緩沖液和2 μl雙蒸水。以2-ΔΔCt值進(jìn)行結(jié)果分析其中ΔCt=Ct 基因-Ct內(nèi)參。

1.7Western印跡法測(cè)定BMP2蛋白及天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3的表達(dá) 向各組樣品中分別加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，提取總蛋白后，使用BCA蛋白定量試劑盒(購自上海碧云天生物科技有限公司)進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定，之后每個(gè)樣品中加入上樣緩沖液，沸水浴10 min使蛋白變性，然后進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)或放置-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。將上述所得樣品用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，然后將樣品轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。隨后將膜放入含有5%脫脂奶粉的Tween-20 Tris-磷酸鹽緩沖液(PBST)中，置于搖床室溫封閉2 h；之后用PBST洗膜3次，每次10 min。加一抗4℃搖床過夜(一抗溶于封閉液，1∶300稀釋)；第二天，Tween-20 Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h候，加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液(購自上海碧云天生物科技有限公司)進(jìn)行顯色。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1一般情況及骨細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組兔無異常表現(xiàn)，體重逐漸增加，反應(yīng)較為靈敏，精神狀態(tài)好，飲食一切正常，毛發(fā)光澤度好。模型組兔明顯處于病態(tài)，反應(yīng)較遲鈍，精神狀態(tài)萎靡不振，不喜歡行動(dòng)，毛發(fā)光澤度差。辛伐他汀組兔實(shí)驗(yàn)初期與模型組狀況類似，灌胃4 w后，活動(dòng)量和體重均增加，精神狀態(tài)恢復(fù)，反應(yīng)較靈敏，走路姿勢(shì)呈好轉(zhuǎn)趨勢(shì)，毛發(fā)光澤度好，脫落較少。辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組情況較辛伐他汀組更好，治療效果更明顯。對(duì)照組兔股骨頭外形始終光滑完整，顏色正常；模型組兔股骨頭總體形態(tài)完整，但表面不光滑，色澤較暗，呈灰白色；辛伐他汀組兔股骨頭表面完整，基本光滑，顏色接近正常；辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組較辛伐他汀組更好。對(duì)照組無顯著骨細(xì)胞凋亡，模型組細(xì)胞凋亡較多，辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組及辛伐他汀組均有不同程度凋亡，但較模型組均有顯著改善；辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組較辛伐他汀組更好，見圖1。

2.2SOD活性 和對(duì)照組相比，灌胃8 w后模型組SOD活性明顯降低，辛伐他汀組和辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組較模型組SOD活性顯著增高，辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組效果比辛伐他汀組顯著(P<0.05)，見表1。

2.3LA含量 和對(duì)照組相比，灌胃8 w后模型組LA明顯升高，辛伐他汀組和辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組較模型組LA含量顯著降低，辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組比辛伐他汀組更顯著(P<0.05)，見表2。

圖1 各組骨細(xì)胞凋亡檢測(cè)(×400)

表1 各組各時(shí)段SOD活性

與對(duì)照組相比：1)P<0.05；與模型組相比：2)P<0.05；與辛伐他汀組相比：3)P<0.05；表2同

表2 各組各時(shí)段LA含量

2.4BMP2 mRNA和蛋白水平 和對(duì)照組(1.0±0.1、1.5±0.4)相比，模型組BMP2 mRNA水平(0.4±0.1)和蛋白水平(0.9±0.2)明顯降低，辛伐他汀組(1.0±0.2、1.1±0.2)和辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組BMP2 mRNA(0.8±0.1)和蛋白水平(1.3±0.2)顯著增加，辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組效果比辛伐他汀組顯著(P<0.05)，見圖2。

2.5Caspase-3蛋白水平 和對(duì)照組(0.2±0.1)相比，模型組Caspase-3蛋白水平(0.8±0.2)明顯升高；辛伐他汀組(0.4±0.1)和辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組Caspase-3蛋白水平(0.6±0.2)較模型組顯著降低，辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組效果比辛伐他汀組顯著(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組BMP2與Caspase-3蛋白水平

3 討 論

股骨頭壞死是在一種骨科常見的對(duì)髖關(guān)節(jié)具有特殊破壞性的病變，一般來說，其病程較長，再加上其發(fā)病機(jī)制尚不明確，導(dǎo)致治療效果差，患者的致殘率很高。目前手術(shù)的方法很多，如帶血管蒂的排骨移植〔13〕、髓芯減壓〔13〕、血管束植入和表面置換〔14，15〕等，均可以取得一定療效，但都不可以徹底治療。

SANFH是股骨頭壞死的一個(gè)常見類型，該病往往以局部股骨頭的骨髓壞死及骨小梁破壞作為其基本臨床特征〔1〕，而這種現(xiàn)象的原因主要是由于濫用激素引起的股骨頭局部區(qū)域的供血障礙。目前，對(duì)于其發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)主要有以下幾種可能：細(xì)胞凋亡學(xué)說：有學(xué)者認(rèn)為激素可以通過促進(jìn)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡，引起骨細(xì)胞數(shù)量減少進(jìn)而導(dǎo)致股骨頭壞死。而細(xì)胞凋亡信號(hào)的激活進(jìn)一步引起細(xì)胞內(nèi)各種信號(hào)通路的激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞的各種生物學(xué)行為的紊亂，從引起繼發(fā)性組織損傷〔4〕；間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)脂肪分化學(xué)說：MSC是一種最常見的干細(xì)胞，其具有包括成骨、成脂肪、成軟骨等多向分化潛能，Yin 等〔16〕從分子生物學(xué)角度證實(shí)了，激素可以誘導(dǎo)MSC向脂肪定向分化，而這樣的結(jié)果可能導(dǎo)致患者骨內(nèi)壓增加進(jìn)而引起股骨頭壞死；而Wang等〔17〕的結(jié)果也證實(shí)導(dǎo)致股骨頭壞死的重要原因是激素誘導(dǎo)的MSC成脂分化。外源性輔酶Q10 能減少由于細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷引起的細(xì)胞凋亡〔11，12〕。本研究表明，輔酶Q10可以輔助辛伐他汀緩解兔股骨頭壞死，但相應(yīng)機(jī)制還不清楚。本文結(jié)果和關(guān)于輔酶Q10功能的報(bào)道一致〔9，10〕。研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥在體外及大鼠和小鼠體內(nèi)都可促進(jìn)新骨生成并伴有BMP2表達(dá)的增加〔7〕。本文結(jié)果和關(guān)于輔酶Q10抑制凋亡的報(bào)道一致〔11，12〕。

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