王玉萍 張 娟

(河南省中醫(yī)院 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450002)

胃癌是我國(guó)發(fā)病率最高的消化道惡性腫瘤，發(fā)病隱匿，患病早期一般無(wú)消化道癥狀或癥狀不明顯，當(dāng)患者出現(xiàn)胃痛等癥狀時(shí)多已進(jìn)展至中晚期。中晚期胃癌的治療預(yù)后相對(duì)差，且腫瘤細(xì)胞可通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)入血液和淋巴系統(tǒng)，進(jìn)而傳播至全身各組織和器官。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，關(guān)于腫瘤精準(zhǔn)治療的基礎(chǔ)研究進(jìn)一步成熟，其中利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的腫瘤趨向性制作以BMSCs為載體的“生物導(dǎo)彈”成為新的研究熱點(diǎn)〔1～3〕。但BMSCs作為一個(gè)分化程度較低的細(xì)胞類(lèi)型，在細(xì)胞微環(huán)境的影響下誘導(dǎo)分化的可能性增大，當(dāng)以BMSCs為載體進(jìn)行藥物遞送時(shí)載體細(xì)胞在腫瘤組織微環(huán)境中的誘導(dǎo)分化問(wèn)題成為當(dāng)前細(xì)胞遞送抗胃癌藥物的難點(diǎn)〔4～6〕。本研究將人胃癌BCG-823細(xì)胞與大鼠BMSCs共培養(yǎng)，分析其細(xì)胞形態(tài)及腫瘤標(biāo)記物CD34、CD44的表達(dá)情況，旨在探析人胃癌BCG-823細(xì)胞模擬的胃癌組織微環(huán)境對(duì)BMSCs生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性健康SD大鼠6只，鼠齡2～3 w，質(zhì)量(50.00±5.00)g，均購(gòu)于凱學(xué)生物科技(上海)有限公司，自由進(jìn)食，并在自然光照下飼養(yǎng)待用。

1.2人胃癌BCG-823細(xì)胞 購(gòu)于江蘇菲亞生物科技有限公司，組織來(lái)源于62歲未分化胃腺癌患者，癌胚抗原(CEA)(+)；培養(yǎng)條件：RPMI1640+10%胎牛血清(FBS)；細(xì)胞形態(tài)呈上皮樣，貼壁生長(zhǎng)；采購(gòu)時(shí)均采用凍存的細(xì)胞干冰運(yùn)輸。

1.3試劑與儀器 FBS、磷酸鹽緩沖液(PBS)、DMEM/F12培養(yǎng)液、FBS消化液均來(lái)自美國(guó)SIGMA公司；0.05%胰酶-EDTA、1%青鏈霉素混合液均來(lái)自Hyclone公司；MTT試劑盒、CD34/異硫氰酸熒光素(FITC)抗體、CD44/藻紅蛋白(PE)抗體均來(lái)自英國(guó)Cayman公司；采用ACEA Biosciences公司提供的ACEA NovoCyte流式細(xì)胞儀；Transwell小室由美國(guó)康寧公司提供。

1.4BMSCs培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死6只SD大鼠，分離、剪斷股骨和脛骨，用DMEM/F12溶液將骨髓細(xì)胞沖出，吹打分離細(xì)胞后將骨髓細(xì)胞懸濁液移入離心管中離心棄上清，PBS重懸后移入15 ml離心管中，離心管內(nèi)提前配好淋巴細(xì)胞分離液5 ml。2 000 r/min離心20 min，取白色渾濁的中間層(骨髓基質(zhì)細(xì)胞層)，PBS反復(fù)沖洗2～3次后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中常規(guī)恒溫傳代培養(yǎng)。

1.5大鼠BMSCs共培養(yǎng)微環(huán)境對(duì)照的建立 共培養(yǎng)建立前準(zhǔn)備Transwell小室2個(gè)，大鼠BMSCs傳至3代時(shí)分別以2×105(個(gè))細(xì)胞量接種至預(yù)先準(zhǔn)備好的Transwell小室。其中，對(duì)照組BMSCs接種于Transwell小室內(nèi)，下層為DMEM/F12培養(yǎng)液，并加入10%FBS和1%青鏈霉素。觀察組BMSCs接種于Transwell下室，將Transwell上室置于6孔位板的孔中，Transwell上室接種2×105(個(gè))人胃癌BGC-823細(xì)胞。兩組BMSCs均置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。

1.6大鼠BMSCs共培養(yǎng)微環(huán)境對(duì)照的檢測(cè) 培養(yǎng)1～7 d，每天均采用MTT法檢測(cè)BMSCs的增殖情況，吸光度測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm，細(xì)胞增殖率=〔1 -(實(shí)驗(yàn)孔A 值- 空白孔A 值)/(對(duì)照孔A 值- 空白孔A 值)〕×100%。每天鏡下觀察細(xì)胞懸濁及貼壁生長(zhǎng)情況，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。培養(yǎng)7 d后，采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)BMSCs細(xì)胞分裂情況，計(jì)算G1、S、G2/M比率；并采用FCM檢測(cè)兩組BMSCs CD34、CD44表達(dá)情況，CD34采用FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗，CD44采用PE標(biāo)記的羊抗鼠二抗。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件。計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組大鼠BMSCs生長(zhǎng)形態(tài)變化情況 對(duì)照組BMSCs在原代培養(yǎng)1 d后即有少量細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)液中仍有大量懸浮細(xì)胞；培養(yǎng)3 d時(shí)可見(jiàn)明顯貼壁細(xì)胞，分布分散，但已出現(xiàn)短梭狀、橢圓形等短平狀形態(tài)；培養(yǎng)7 d時(shí)可見(jiàn)明顯的貼壁細(xì)胞集落單位，細(xì)胞均勻、有序地鋪滿(mǎn)整個(gè)瓶底，且細(xì)胞形態(tài)改變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，鏡下觀察細(xì)胞輪廓不清，具有較強(qiáng)的折光性。觀察組BMSCs在原代培養(yǎng)1 d時(shí)與對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況相似；培養(yǎng)3 d時(shí)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象不明顯，細(xì)胞核變小，且其細(xì)胞形態(tài)較對(duì)照組更細(xì)長(zhǎng)；培養(yǎng)7 d時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)較細(xì)長(zhǎng)，且細(xì)胞間連接不緊密，排列紊亂，呈團(tuán)狀生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，與人胃癌 BCG-823細(xì)胞形態(tài)雷同。

2.2兩組BMSCs細(xì)胞分裂周期分布比較 培養(yǎng)7 d后，觀察組BMSCs G1周期占比明顯低于對(duì)照組，S周期占比及G2/M占比均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 兩組BMSCs細(xì)胞分裂周期分布比較

2.3兩組BMSCs增殖率比較 兩組BMSCs在培養(yǎng)1 d時(shí)細(xì)胞增殖率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；培養(yǎng)2～7 d時(shí)，觀察組BMSCs增殖率明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 兩組BMSCs增殖率比較

2.4兩組大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD34、CD44表達(dá)水平比較 培養(yǎng)7 d后，觀察組CD34陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，CD44陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 兩組BMSCs的CD34、CD44表達(dá)水平比較

3 討 論

腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的集落與正常細(xì)胞不同，多表現(xiàn)為圓團(tuán)形或不規(guī)則形。腫瘤細(xì)胞原癌基因和抑癌基因表達(dá)異常，生長(zhǎng)周期失控表現(xiàn)為無(wú)限增殖，加細(xì)胞因子等表達(dá)改變，導(dǎo)致細(xì)胞的接觸抑制消失，且伴有較強(qiáng)的遷移性〔7,8〕。但腫瘤組織并非僅僅由腫瘤細(xì)胞構(gòu)成，而是腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞等多種類(lèi)型細(xì)胞組成的異質(zhì)混合體。研究表明，將人工誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞iPSCs與腫瘤組織共培養(yǎng)可觀察到iPSCs向腫瘤組織分化的趨勢(shì)，其細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞因子表達(dá)狀態(tài)均明顯改變，并提出腫瘤組織微環(huán)境的概念〔9,10〕。腫瘤組織微環(huán)境是指腫瘤組織發(fā)生及發(fā)展時(shí)所處的內(nèi)環(huán)境，主要是腫瘤組織及腫瘤組織細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子和組織液等。既往研究已表明，上皮來(lái)源的惡性腫瘤在腫瘤微環(huán)境影響下具有較強(qiáng)的間質(zhì)轉(zhuǎn)化生物功能〔11～13〕。BMSCs是一種最常見(jiàn)的多能干細(xì)胞，與人工誘導(dǎo)分化程度較高細(xì)胞而得到的多能干細(xì)胞iPSCs相比，其分化能力更強(qiáng)，且通過(guò)動(dòng)物骨髓小劑量獲取更方便。隨著對(duì)BMSCs的不斷研究，其在臨床治療中的應(yīng)用逐漸深入。既往在臨床治療中的應(yīng)用多為利用其多向分化和免疫排斥小的特點(diǎn)進(jìn)行替代治療，但在嘗試用間充質(zhì)干細(xì)胞作為藥物遞送載體的研究中發(fā)現(xiàn)其藥物遞送效果較差，且腫瘤組織甚至?xí)M(jìn)一步發(fā)展。

近年研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞與胃癌組織的發(fā)展顯著相關(guān)，且間充質(zhì)干細(xì)胞在胃癌微環(huán)境的誘導(dǎo)下能向胃癌細(xì)胞分化，并且影響干細(xì)胞表面CD34、CD44等標(biāo)記物的表達(dá)〔14～16〕。CD34是在造血祖細(xì)胞等造血前體細(xì)胞中選擇性表達(dá)的跨膜糖蛋白，主要參與細(xì)胞間的黏附，在細(xì)胞的增殖分化及轉(zhuǎn)移中均具有重要意義。CD44是一種與細(xì)胞異質(zhì)性黏附相關(guān)的跨膜糖蛋白，與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性密切相關(guān)。CD34、CD44是BMSCs的重要標(biāo)志物。本研究結(jié)果說(shuō)明人胃癌BCG-823細(xì)胞提供的腫瘤微環(huán)境能對(duì)BMSCs分化產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞增殖情況檢測(cè)顯示，人胃癌BCG-823細(xì)胞共培養(yǎng)的BMSCs分裂能力更強(qiáng)，考慮為BMSCs受人胃癌BCG-823細(xì)胞誘導(dǎo)分化后細(xì)胞生長(zhǎng)抑制消除所致；并且人胃癌BCG-823可影響B(tài)MSCs CD34、CD44的分泌。

綜上所述，人胃癌 BCG-823細(xì)胞對(duì)大鼠BMSCs增殖速度及CD34、CD44表達(dá)具有顯著影響，并可誘導(dǎo)大鼠BMSCs向人胃癌 BCG-823細(xì)胞分化。

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