劉 偉 潘吳君 趙靜雅 常 娜 謝南昌 連亞軍

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 開封 475000)

癲癇是一種由多種原因引發(fā)的以行為和功能異常發(fā)作的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，臨床表現(xiàn)為短暫性、發(fā)作性、刻板性和重復(fù)性。現(xiàn)主要用抗癲癇藥物和手術(shù)治療，但效果均不佳。MicroRNAs(miRNAs)是一類由19～25 bp長度的核苷酸組成的小分子非編碼RNA，可通過與其互補的序列靶mRNA結(jié)合，從而對蛋白的表達及細胞的功能進行調(diào)控〔1〕。miRNAs普遍存在于多種生物細胞中，占整個基因組總數(shù)的2%。已有研究證實miRNAs參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控及神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)形態(tài)的維持〔2〕。miR-181a也影響了神經(jīng)細胞的發(fā)育〔3〕，但對癲癇發(fā)生中的作用及機制目前還未研究清楚。本實驗擬分析miR-181a對海馬神經(jīng)元突觸生長的影響及機制。

1 材料與方法

1.1材料 出生24 h內(nèi)的SD大鼠，由河南大學(xué)實驗動物中心提供。動物操作按照河南大學(xué)實驗動物倫理要求進行。主要試劑和儀器：胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、胰酶、青鏈霉素、NeuroBasal-A培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；miR-181a-mimic、miR-181a-inhibitor、scramble miRNA均購自廣州銳博生物科技有限公司；多聚賴氨酸、乳酸脫氫酶(LDH)細胞毒性檢測試劑盒均購自美國Sigma；磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、t-Akt、磷酸化糖原合酶激酶(p-GSK3β)、t-GSK3β單克隆抗體及辣根過氧化物標記的二抗均購自美國abcam公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、免疫染色固定液均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；TUNEL凋亡檢測試劑盒購自德國Roche公司；增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光液購自美國Millipore公司；細胞培養(yǎng)箱購自美國西盟公司；倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2方法

1.2.1原代大鼠海馬神經(jīng)元的分離培養(yǎng) 取出SD大鼠，75%的酒精對全身消毒、斷頭、剪開頭部的皮膚及顱骨，將全腦組織分離，放入D-Hanks溶液中沖洗后，在光學(xué)顯微鏡下用解剖鑷分離出海馬組織，并除掉軟腦膜和血管。D-Hanks多次沖洗海馬組織后用眼科剪將其剪成1 mm3小塊，37℃水浴箱中用0.25%的胰酶消化5 min，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻。細胞置于200目篩過濾，4℃，1 000 r/min離心5 min，棄掉上清，加入神經(jīng)元培養(yǎng)基，巴氏管吹打混勻細胞，將細胞制成濃度為3×105個/ml的單細胞懸液，接種至玻片上(已用0.1 mg/ml多聚賴氨酸包被)。置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)12～24 h后，將神經(jīng)元種植培養(yǎng)基換成神經(jīng)元維持培養(yǎng)基，之后每3～4 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)元生長狀況。

1.2.2miR-181a對海馬神經(jīng)元生長的影響 神經(jīng)元培養(yǎng)的第5天，將miR-181a-mimic、miR-181a-inhibitor及scramble miRNA轉(zhuǎn)染到神經(jīng)元細胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染48 h后，用4%多聚甲醛固定細胞10 min，加入一抗β-Ⅲ微管蛋白，4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，加入兔抗鼠IgG-羊抗異硫氰酸熒光碘(FITC)，作用1 h后，熒光標記神經(jīng)細胞的β-Ⅲ微管蛋白，計算突觸的數(shù)目和長度。

1.2.3實驗分組及模型建立 (1)對照組：培養(yǎng)14 d的海馬神經(jīng)元用含鎂生理外液沖洗3遍，然后向細胞中加入含鎂生理外液，置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，之后用維持培養(yǎng)基培養(yǎng)。(2)無鎂組：培養(yǎng)14 d的海馬神經(jīng)元用無鎂生理外液沖洗3遍，然后向細胞中加入無鎂生理外液，置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，用維持培養(yǎng)基培養(yǎng)。(3)無鎂+miR-181a-mimic組：向海馬神經(jīng)元(培養(yǎng)14 d)培養(yǎng)基中加入miR-181a-mimic，將終濃度調(diào)整為50 μmol/L，反應(yīng)30 min后無鎂刺激3 h，之后用維持培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.4神經(jīng)元死亡狀況檢測 采用TUNEL的方法。首選固定細胞爬片樣本1 h，PBS洗滌細胞玻片2次，每次1 min。封閉液在室溫條件下孵育玻片10 min，PBS洗滌細胞玻片2次，每次1 min。滲透液在2℃～8℃條件下孵育2 min，PBS洗滌細胞玻片2次，每次1 min，置于空氣中干燥。將酶溶液(50 μl)與標記液(450 μl)混合制成500 μl的TUNEL反應(yīng)液，混勻。在樣品上滴加50 μl的TUNEL反應(yīng)液，置于37℃，暗室，濕盒加蓋孵育1 h，PBS洗滌細胞玻片4次，每次5 min。在玻片上滴加二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，5 min后吸出，用PBS洗滌細胞玻片3次，每次5 min，在玻片上滴加抗淬滅劑15 μl，封片。熒光顯微鏡下計數(shù)死亡神經(jīng)元數(shù)目。

1.2.5LDH細胞毒性檢測 從6孔細胞培養(yǎng)板上刮取神經(jīng)元，離心后棄掉上清，調(diào)整細胞濃度為每毫升含有106個細胞。反復(fù)凍融后，室溫下2 500 r/min離心20 min，收集上清。設(shè)立空白孔和待測樣品空，加10 μl待測樣品于酶標版孔底物，然后加入40 μl樣品稀釋液，充分混勻后用封板膜密封酶標版，置于37℃條件下溫育30 min，棄掉液體，洗滌后甩干。每孔細胞中加入50 μl酶標試劑，如前所述進行孵育和洗滌后，加入顯色劑，充分混勻后置于37℃避光條件下顯色15 min，在每孔細胞中加入50 μl終止液。在450 nm波長處測定OD值，根據(jù)標準曲線計算樣品的實際濃度。

1.2.6NAD+含量測定 從6孔細胞培養(yǎng)板上刮取神經(jīng)元，4℃，2 000 r/min離心5 min，棄掉上清，加NAD抽提緩沖液400 μl，反復(fù)凍融后，14 000 r/min離心5 min，收集上清。取10 μl還原型輔酶Ⅰ(NADH)標準品加入到990 μl抽提的緩沖液中，將混合物加入標準品孔中，分別加入0、2、4、6、8、10 μl，調(diào)節(jié)終濃度為50 μl，將50 μl待測樣本加入96孔培養(yǎng)板底部。混合NAD循環(huán)緩沖液及NAD循環(huán)酶緩沖液，每孔樣品孔與標準孔分別加入100 μl混合液，混勻后靜置5 min，加NAD顯色劑，每孔10 μl，室溫環(huán)境中靜置2 h，在每孔細胞中加入50 μl終止液。在450 nm波長處測定OD值，根據(jù)標準曲線計算樣品的實際濃度。

1.2.7Western印跡檢測蛋白表達 提取細胞中的總蛋白，BCA試劑盒檢測提取的蛋白濃度。充分混勻蛋白樣品和上樣緩沖液，100℃變性6 min，每孔取100 μl變性蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)至聚氰偏乙稀(PVDF)膜上，5%的脫脂奶粉封閉2 h后，加入p-Akt、t-Akt、p-GSK3β、t-GSK3β單克隆抗體(1∶500稀釋)，4℃孵育過夜，次日Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜后加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，室溫孵育2 h，ECL發(fā)光劑顯影，自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參，分析蛋白表達水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-181a對原代海馬神經(jīng)元生長的影響 miR-181a-mimic組海馬神經(jīng)元細胞突觸的長度及分支數(shù)均顯著低于對照組和scramble miRNA組，而miR-181a-inhibitor組均顯著高于對照組和scramble miRNA組(P<0.01)。scramble miRNA不影響突觸的生長。見表1。

表1 miR-181a對原代海馬神經(jīng)元生長的影響

與對照組比較：1)P<0.01；與scramble miRNA組比較：2)P<0.01

2.2miR-181a對無鎂誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞凋亡的影響 無鎂刺激神經(jīng)元細胞1 h和24 h后，無鎂+miR-181a-mimic組陽性細胞率(21.2%±4.08%、36.8%±6.21%)均顯著低于無鎂組(42.1%±5.04%、81.6%±8.21%，P<0.01)。

2.3miR-181a對無鎂誘導(dǎo)神經(jīng)元漏出率的影響 用無鎂刺激海馬神經(jīng)元細胞24 h，無鎂組(115.6%±14.50%)和無鎂+miR-181a-mimic組細胞漏出率(43.2%±11.2%)均顯著高于對照組(4.23%±1.02%)，而無鎂+miR-181a-mimic組顯著低于無鎂組(均P<0.01)。

2.4miR-181a對無鎂誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞中NAD+含量的影響 無鎂刺激神經(jīng)元細胞24 h，無鎂組(30.6%±8.50%)和無鎂+miR-181a-mimic組NAD+含量(74.2%±11.2%)均顯著低于對照組(96.3%±4.02%)，而無鎂+miR-181a-mimic組顯著高于無鎂組(均P<0.01)。

2.5miR-181a對無鎂誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞中Akt和GSK3β磷酸化蛋白及總蛋白表達的影響 無鎂刺激神經(jīng)元細胞24 h，無鎂組Akt和GSK3β磷酸化蛋白表達與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，無鎂+miR-181a-mimic組顯著高于對照組及無鎂組(P<0.01)。Akt和GSK3β總蛋白表達在3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1，表2。

圖1 miR-181a對無鎂誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞中蛋白表達的影響

表2 miR-181a對無鎂誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞中蛋白表達的影響

與對照組比較：1)P<0.01；與無鎂組比較：2)P<0.01

3 討 論

癲癇機制的研究主要集中在神經(jīng)遞質(zhì)釋放、神經(jīng)元突觸聯(lián)系、胞膜通透性及膜電位、自由基損傷等神經(jīng)元的功能及狀態(tài)方法〔4〕。miRNA能通過研究的時空次序調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，并參與神經(jīng)細胞功能和形態(tài)的維持，且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達有組織特異性、保守性及瞬時性〔5〕。已有研究證實miRNA能通過調(diào)控神經(jīng)元凋亡及微結(jié)構(gòu)、干預(yù)膠質(zhì)增生和炎癥過程等降低癲癇的發(fā)生〔6〕。起初發(fā)現(xiàn)miR-181a與造血系統(tǒng)有關(guān)，隨著研究深入發(fā)現(xiàn)miR-181a參與血管發(fā)育、心律失常等疾病的過程〔7，8〕。在神經(jīng)系統(tǒng)中miR-181a表達豐富，參與缺血再灌注腦損傷過程〔9〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-181a-mimic可顯著降低突觸的長度及數(shù)目，而轉(zhuǎn)染miR-181a-inhibitor增加了突觸的長度及數(shù)目。已有研究證實miRNA可作用生物標志物用于癲癇的診斷，通過檢測miRNA的表達可對急性腦損傷和神經(jīng)系統(tǒng)疾病進行區(qū)分〔10〕。NAD+是傳遞氫離子的輔酶，在細胞代謝和呼吸中發(fā)揮重要作用。有文獻報道NAD+能抑制神經(jīng)元死亡，在腹腔注射NAD+能降低腦缺血引起的腦損傷〔11〕。本研究顯示，無鎂+miR-181a-mimic能降低細胞死亡及LDH細胞毒性，上調(diào)NAD+含量。PI3K/Akt是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，能通過調(diào)控下游的凋亡蛋白、周期蛋白等維持細胞的凋亡和生長。AKT是PI3K下游的靶激酶，當(dāng)受到胞內(nèi)信號刺激后，PI3K活化產(chǎn)生PIP3，將Akt磷酸化，引發(fā)信號通路的級聯(lián)反應(yīng)從而對細胞的凋亡進行調(diào)控〔12〕。GSK3β是GSK-3其中的一個亞型，能使多種轉(zhuǎn)錄因子和蛋白磷酸化，在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用〔13〕。且PI3K/Akt信號通路對GSK3β的作用最明顯〔14〕。本研究結(jié)果提示，miR-181a影響海馬神經(jīng)元突觸生長，并通過調(diào)控PI3K/Akt/GSK3β信號通路降低神經(jīng)元細胞的凋亡及細胞漏出率，提高NAD+含量對癲癇起保護作用。該研究為癲癇的分子治療提供了理論依據(jù)。

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