董天宇，朱 昱，李宏達(dá)，劉思佳

(中國刑事警察學(xué)院 法化系，遼寧 沈陽 110035)

硫化物(硫化鈉，硫化鋇，硫化氫等)大量的存在于自然界中，在工業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥合成和軍工等方面具有廣泛的應(yīng)用。硫化物同時(shí)也是一種有毒的物質(zhì)，如果大量的硫化物進(jìn)入水體或空氣中對(duì)自然環(huán)境與人類健康能夠產(chǎn)生極大的風(fēng)險(xiǎn)。人們過量的吸食硫化物會(huì)引發(fā)糖尿病、高血壓、肝硬化、唐氏綜合征等疾病[1]。在我國，硫化物的含量是飲用水及地表水檢測(cè)的常用指標(biāo)之一。規(guī)定指出，污水中的硫化物濃度不得超過1mg/L，飲用水中硫化物濃度不得超過0.02mg/L。目前，檢驗(yàn)硫離子的方法有很多種，只是各有所長，各有不足。主要的檢測(cè)方法有：碘量法、亞甲藍(lán)法、試紙法、離子色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、離子選擇電極法、紫外分光光度法等。在這些方法中有的靈敏度低、樣品需求量大，有的前處理比較復(fù)雜、耗時(shí)比較長[2]。因此開發(fā)一種操作簡單、響應(yīng)速度快、靈敏度高、選擇性好的硫離子檢驗(yàn)方法具有重要的實(shí)際意義。

1 熒光探針的設(shè)計(jì)原理與分類

熒光探針是在分子識(shí)別基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型檢測(cè)方法。由于其具有操作簡單、響應(yīng)速度快、靈敏度和選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域具有非常廣泛的應(yīng)用。熒光探針是由識(shí)別基團(tuán)(Receptor)、連接臂(Spacer)和熒光團(tuán)(Fluorophophre)三個(gè)部分組成[3]。識(shí)別基團(tuán)與被測(cè)物之間通過非共價(jià)相互作用(如靜電引力、氫鍵、配位鍵合、范德華力、分子間作用力等)以及化學(xué)反應(yīng)等方式誘導(dǎo)熒光團(tuán)的光學(xué)性能(熒光強(qiáng)度、熒光壽命、熒光波長等)發(fā)生改變，將熒光探針與被測(cè)物之間的相互作用轉(zhuǎn)化為儀器可探測(cè)的或人為感知的信號(hào)[4]，實(shí)現(xiàn)快速地、準(zhǔn)確地分析被測(cè)物的目的。

熒光探針的設(shè)計(jì)原理主要有以下幾種：光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機(jī)理(Photo-induced Electron Transfer, PET),分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機(jī)理(Intra-molecular Charge Transfer, ICT),配合體-金屬電荷轉(zhuǎn)移機(jī)理(Ligand-Metal Charge Transfer, LMCT)，激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移機(jī)理(Excited-state Intra-molecular Proton Transfer, ESIPT),熒光共振能量轉(zhuǎn)移機(jī)理(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)等[5]。按照熒光探針的設(shè)計(jì)原理可以分為三類：(1)鍵合型熒光探針，即基于配位作用的熒光探針；(2)取代型熒光探針，如識(shí)別目標(biāo)的取代；(3)反應(yīng)型熒光探針，也就是說探針主體與識(shí)別物之間發(fā)生了特定的、不可逆的化學(xué)反應(yīng)[6]。

依據(jù)硫離子的兩種特性，即容易與堿金屬和堿土金屬形成難溶的物質(zhì)和強(qiáng)的親核性，可以將硫離子的熒光探針分為兩類，置換型硫離子熒光探針和反應(yīng)型硫離子熒光探針。下面按照作用機(jī)理的不同進(jìn)行詳細(xì)闡述。

2 置換型硫離子熒光探針

首先，熒光探針與堿金屬或堿土金屬發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)形成新的配合物，當(dāng)加入硫離子后，硫離子與堿金屬或者堿土金屬發(fā)生無機(jī)反應(yīng)，生成難溶的硫化物，此時(shí)，熒光探針被置換出來，釋放出熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了熒光探針ON-OFF-ON的變化，從而制備出可逆性熒光探針。

2013年尹炳柱教授課題組[7]成功合成了基于香豆素-DPA-Cu2+復(fù)合體的硫離子置換型熒光探針1-Cu2+。在水溶液中探針識(shí)別S2-具有很好的選擇性、靈敏度和抗干擾能力，而且僅需2 當(dāng)量硫離子就能完全置換出香豆素衍生物，使熒光信號(hào)完全恢復(fù)。另外，作者獲得了探針的單晶結(jié)構(gòu)，通過single-crystal X-ray衍射分析獲得了絡(luò)合模式。

2012年鄭教授[8]課題組發(fā)表了一種以熒光素作為熒光發(fā)光基團(tuán)的置換型熒光探針2-Cu2+，通過設(shè)計(jì)多個(gè)雜原子配位點(diǎn)使其與銅離子有很好的絡(luò)合能力。該絡(luò)合物對(duì)硫離子形成了一種off-on型的熒光開關(guān)，而且還顯示了很好的可逆性。

2018年李教授[9]課題組開發(fā)了一種基于雙羥基喹啉并半菁染料-Cu2+置換型熒光探針3-Cu2+。探針識(shí)別硫離子具有非常好的選擇性，不受其他類似分析物(其中包括生物硫醇，氰化鈉，活性物質(zhì)等)的干擾。在交替滴加銅離子和硫離子時(shí)，探針展現(xiàn)出良好的可逆性，呈現(xiàn)出紅色熒光信號(hào)的開與關(guān)。最后，探針成功的應(yīng)用于真實(shí)的血液樣本和生物體內(nèi)檢測(cè)硫化物。

圖3 置換型熒光探針3

3 反應(yīng)型硫離子熒光探針

反應(yīng)型熒光探針與被測(cè)物的結(jié)合一般是通過不可逆的化學(xué)反應(yīng)，被測(cè)物與熒光探針作用后，新的加成物能夠使測(cè)試體系的熒光信號(hào)發(fā)生變化(熒光強(qiáng)度、發(fā)射波長等)。此外，被測(cè)物還可以作為熒光探針自身反應(yīng)的催化劑，生成新的化合物，通過檢測(cè)新化合物的生成間接的識(shí)別被測(cè)物。

2012年，Cho課題組[10]報(bào)道了第一個(gè)硫化氫雙光子熒光增強(qiáng)型探針4。探針在pH值=7.2的HEPES緩沖溶液中，當(dāng)加入20當(dāng)量硫化鈉反應(yīng)后，單光子光譜顯示在548nm出現(xiàn)一個(gè)強(qiáng)的發(fā)射峰，其檢測(cè)下限達(dá)到5～10 μm,其雙光子熒光光譜也得到相似的結(jié)果，熒光增加倍數(shù)達(dá)到了21倍。探針4不僅對(duì)常見活性氮(RNS)和活性氧(ROS)表現(xiàn)出好的選擇性，而且對(duì)活性硫化物(RSS)(如：半胱氨酸和谷胱甘肽)也表現(xiàn)出好的選擇性。在750nm激發(fā)時(shí)，pH值=7.2的HEPES緩沖溶液中，探針4與硫化氫反應(yīng)產(chǎn)物4-NH2的雙光子活性截面積分別為15GM和302GM，這說明探針4具有很好的雙光子吸收效果。探針4不僅可以應(yīng)用于細(xì)胞里硫化氫成像分析，還可以應(yīng)用在組織里硫化氫成像分析，其在組織里對(duì)硫化氫檢測(cè)深度達(dá)到190μm。

圖4 反應(yīng)型熒光探針4

Ahn課題組[11]設(shè)計(jì)了一個(gè)新的增強(qiáng)型雙光子硫化氫探針5。它是利用硫化氫先與熒光探針5中的醛基反應(yīng)，再通過Michael加成到相鄰的不飽和丙烯酸醋上，形成一個(gè)Thioacetal半縮醛結(jié)構(gòu)。采用這種新的策略，探針對(duì)硫化氫具有的選擇性好、靈敏度高、響應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)。更重要的是，雙光子探針實(shí)現(xiàn)了在活細(xì)胞中識(shí)別硫化氫，呈現(xiàn)雙光子成像的目的。

圖5 反應(yīng)型熒光探針5

Liu課題組[12]開發(fā)了一種打開型熒光探針6。以熒光素作為熒光發(fā)光團(tuán)，醛基作為反應(yīng)基團(tuán)，利用S2-的親核性，與醛基發(fā)生縮醛反應(yīng)，可以定量檢測(cè)S2-，且檢測(cè)的S2-濃度范圍比較寬(2.5～1000μm)。由于探針里面有兩個(gè)親電子的羰基，硫化氫進(jìn)行了兩次親核反應(yīng)，因此探針表現(xiàn)出對(duì)S2-較好的選擇性。

Xian課題組[13]研發(fā)了一種反應(yīng)型熒光探針7，首先H2S迅速進(jìn)攻探針分子中的二硫鍵，然后由生成的硫醇中間體進(jìn)一步進(jìn)攻酯基，經(jīng)自環(huán)化后，釋放出熒光素衍生物，該探針可以與H2S快速反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)“關(guān)-開”型熒光探針。

4 展望

近年來硫離子熒光探針在生命科學(xué)、環(huán)境 科學(xué)、材料科學(xué)、信息科學(xué)等領(lǐng)域得到了迅猛的發(fā)展，同時(shí)也獲得了許多優(yōu)異的熒光探針。通過比較分析可以發(fā)現(xiàn)，二者具有各自的特點(diǎn)。

首先，反應(yīng)型硫離子熒光探針通常對(duì)硫離子具有很高的選擇性 。而且，反應(yīng)型熒光探針發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后的熒光產(chǎn)物通常是不與金屬離子絡(luò)合的，從而有效避免了熒光發(fā)生猝滅。此外，反應(yīng)型熒光探針體系中，由于與客體作用后生成了不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的光活性產(chǎn)物，會(huì)產(chǎn)生肉眼可見的顏色變化，從而為鑒定提供了方便。

其次，置換型硫離子熒光探針具有反應(yīng)時(shí)間較短，反應(yīng)速度快，反應(yīng)可逆等優(yōu)點(diǎn)，但由于它是和金屬絡(luò)合產(chǎn)生的熒光探針，因此也具有選擇性差，易受其他金屬離子干擾等缺點(diǎn)。

總之，目前所開發(fā)的硫離子熒光探針還存在諸多問題，需要我們克服與解決，從而更好地應(yīng)用熒光探針檢驗(yàn)硫離子。