包久兵，史良會

（1.皖南醫(yī)學院研究生院，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院胃腸外科）

結直腸癌（CRC）是我國最常見的惡性腫瘤之一，在腫瘤導致的死亡中居第5位［1］，預計到2030年，全球CRC的發(fā)病率將增加60%［2］。對CRC侵襲及轉移的分子機制及腫瘤細胞與外界信息交流的機制的了解，將有助于進一步預防和治療CRC，其中外泌體介導的運輸形式發(fā)揮著重要作用。癌細胞能釋放多種囊泡，這些囊泡可以通過體液，如外周血、唾液、尿液和腹水等進行轉移［3］，某些特殊的細胞囊泡稱為“外泌體（exosomes）”，其與癌癥的進展相關［4］。

1 外泌體

1.1 外泌體的產生 外泌體是在內化過程中由質膜產生的。首先，細胞通過內吞作用形成早期內涵體（early endosomes，EE），其逐漸變?yōu)橥砥趦群w或多泡體（MVBs），MVBs膜內陷形成腔內囊泡（ILVs），MVBs與溶酶體膜融合可降解蛋白質，并且釋放ILVs進入溶酶體，或者MVBs與質膜融合，ILVs被釋放到細胞外環(huán)境中，稱為外泌體［5］。外泌體融合了mRNA、miRNA、蛋白質和部分特定區(qū)域的DNA等。外泌體的大小在30～100 nm［6］，40～100 nm［7］，50～150 nm［8］不等。然而，外泌體的生物起源機制尚不十分清楚，還需要進行更深入的研究。

1.2 外泌體的分離方法 根據(jù)其大小、密度、含量、標記物或電位等一些自身特點，從血漿、血清、培養(yǎng)基中分離外泌體的方法有多種。第一種分離方法是超速離心法，因其性能高、操作簡單和易獲得性而被廣泛應用［9］。為了從細胞培養(yǎng)物中分離外泌體，必須使用無血清培養(yǎng)基或補充除外泌體的血清培養(yǎng)基來避免可能對結果造成干擾。超速離心法實施方案：先將上清液以480×g離心5 min，然后再用2 000×g離心10 min，移除細胞和細胞碎片［8，10］；取離心后的上清液，用0.2 μm孔過濾除去大的囊泡，在4℃以100 000×g離心60 min；將沉淀重懸于PBS中，通過蔗糖梯度離心法，在4℃以100 000×g離心60 min進行純化，所得含有外泌體的物質必須用PBS洗滌并儲存在-80 ℃環(huán)境中［11］。

近年來，超速離心的替代方法（包括超濾［12］）與日俱增。BiooScientific研發(fā)了“ExoMir Kit”試劑盒，通過第一個微濾器（0.22 μm）移除細胞和細胞碎片等，通過第二個微濾器（0.02 μm），使用正壓驅動流動并最終獲取外泌體［13］。另外一種方法是：通過使用針對膜蛋白如CD9、CD63、CD81、CD82、Alix、膜聯(lián)蛋白、EpCAM和Rab5的抗體來特異性分離外泌體，這些抗體被固定在層析基質或平板上［14］。值得強調的是，對于外體的分離、純化、量化或儲存，并沒有一種普遍的方法。我們期待在不久的將來研究出一種普遍適用的方法，這將促進腫瘤的進一步研究。外泌體分離出來后，可以通過不同的技術如ELISA、Western blot、流式細胞術，qPCR、蛋白質組學或NanoSight等，分析其組成或定量。

2 CRC來源外泌體

外泌體可以攜帶致癌蛋白、腫瘤抑制因子、轉錄調節(jié)因子、剪接因子等多種蛋白質和RNA（mRNA、miRNA和其他非編碼RNA）［8］。外泌體內還包含某些DNA片段，這可能提供有關癌細胞起源的相關信息［15-16］。此外，外泌體還可以運輸和遞送大量的蛋白質、脂質和核酸，并且可以修飾細胞和器官功能［4］。

目前常用下列細胞系來研究CRC，如LIM1215、LIM1863、HCT-15、SW480、SW620、DiFi和WiDr等。這些細胞系的囊泡含有高濃度的細胞黏附蛋白以及參與分子運輸?shù)牡鞍缀桶饣|蛋白。Ji等［8］通過免疫親和力的方法，在LIM1863細胞系中發(fā)現(xiàn)了2種外泌體（E-A33和E-EpCAM），其miRNA種類具有顯著差異，E-A33特異性富集了33種miRNAs，其中14種miRNAs在CRC組織分析中未曾報道過，其可能作為診斷CRC的潛在生物標記物。Mitsuru等［7］檢測了CRC細胞系HCT-15、SW480和WiDr分泌的外泌體內的RNA種類，發(fā)現(xiàn)了管家基因ACTB mRNA和GAPDH mRNA，miR-21、miR-192、miR-221，以及LRRC24、MDM2和CDKN1A基因的天然反義RNA，這也是首次發(fā)現(xiàn)在外泌體內存在天然反義RNA；此外，還發(fā)現(xiàn)來源于CRC細胞系的PKH67標記的外來體被攝取到HepG2和A549細胞中；這些發(fā)現(xiàn)表明，細胞內RNA通過外泌體分泌到細胞外，并且源自CRC細胞系的外泌體能夠轉移至HepG2和A549細胞中，外泌體中的RNA在細胞間穿梭，可能參與調節(jié)受體細胞中的基因表達。

Ji等［10］分析比較了來自 SW480細胞系（ESW480）和其轉移性SW620細胞系（E-SW620）的“外泌體”中的蛋白表達譜，發(fā)現(xiàn)兩者均含有典型的外泌體標記物TSG101、Alix、CD63；而轉移因子（MET、S100A8、S100A9、TNC）、信號轉導分子（EFNB2、JAG1、SRC、TNIK）和脂質筏及其相關成分（CAV1、FLOT1、FLOT2、PROM1）選擇性富集于E-SW620中；此外，在E-SW620中也發(fā)現(xiàn)了高水平的Src家族激酶，其與E-SW620中脂筏及其相關分子CAV1、FLOT1和FLOT2相互作用，參與了信號轉導、內吞和細胞骨架重塑，提示它們在信號轉導中起重要作用，可促進細胞轉化和腫瘤進展。據(jù)報道，包裹在E-SW620中的七次跨膜磷酸化酪氨酸激酶可能參與調節(jié)外泌體的生命周期［17］。

KRAS基因在30%～40%的CRC腫瘤中出現(xiàn)了突變，Demory Beckler等［6］研究發(fā)現(xiàn)，與表達野生型KRAS的CRC細胞分泌的外泌體相比，表達突變型KRAS的細胞分泌的外泌體可增強受體細胞的侵襲性，進一步研究發(fā)現(xiàn)，KRAS突變可顯著影響外泌體的蛋白質組成，突變型KRAS的細胞產生的外泌體含有多種促腫瘤蛋白，包括Src家族激酶、EGFR、整合蛋白和突變KRAS蛋白；含突變型KRAS的外泌體可被內化并將突變型KRAS轉移至含野生型KRAS蛋白的DKs-8細胞中，從而促進DKs-8細胞的黏附和增殖。此外，有研究發(fā)現(xiàn)miR-100在含突變型KRAS蛋白的外泌體中顯著增加［18］。

Lydic等［19］比較分析了CRC細胞系LIM1215和其分泌的外泌體的脂質譜，結果顯示在外泌體中存在某些脂質的富集，包括鞘脂、固醇脂質、甘油脂、甘油磷脂、縮醛磷脂等。

3 外泌體在CRC細胞中的作用

3.1 參與腫瘤細胞的轉化和增殖 腫瘤侵襲和轉移的重要機制是上皮-間質轉化（EMT）。EMT機制與癌癥的發(fā)生、癌細胞侵襲、轉移以及復發(fā)的早期階段有關［20］。研究表明，腫瘤來源的外泌體可以促進受體細胞的EMT過程［21］。Bigagli等［22］研究發(fā)現(xiàn)，CRC細胞系HCT-8在培養(yǎng)7 d后，一些細胞開始在懸浮液中生長，細胞呈E-鈣黏蛋白陰性和波形蛋白陽性，表明細胞具有失巢凋亡抵抗和轉移潛能；通過電子顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)，由貼壁細胞分泌的外泌體可被轉移性細胞吸收，并且貼壁細胞分泌的外泌體中的miR-210水平顯著高于細胞內水平，因此miR-210可能是EMT的觸發(fā)信號，促進癌細胞轉移。

除了影響EMT過程外，從SW620和SW480細胞系中提取的外泌體能夠顯著增加2F2B小鼠內皮細胞的體外增殖，從而促進腫瘤血管的生長［10］。這種對內皮細胞的影響可能與外泌體中富集細胞周期相關基因mRNA有關，這些富集的mRNA主要與細胞周期M期活性相關，在腫瘤生長和轉移中發(fā)揮重要作用［23］。CRC來源外泌體能夠誘導結腸間充質干細胞（MSCs）的形態(tài)和功能改變，誘導后的MSCs具有非典型的形態(tài)并且具有更高的增殖率、遷移率和侵襲性［24］。Mulvey等［25］研究發(fā)現(xiàn)，用來自CRC細胞系HCT116和惡性CRC患者組織的外泌體誘導正常結腸成纖維細胞時，可誘導其產生惡性表型，同樣地，用來自正常結腸成纖維細胞和正常患者組織的外泌體誘導，逆轉了HCT116細胞的惡性表型。還有研究發(fā)現(xiàn)，來自小鼠CRC細胞系CT26的外泌體顯著促進了腫瘤的生長，并降低了動物的存活率；此外，發(fā)現(xiàn)外泌體能夠將巨噬細胞的M1表型轉變?yōu)镸2表型，并與腫瘤細胞的細胞因子和趨化因子相互作用，從而促進腫瘤的生長［26］。

3.2 參與腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉移 Wang等［27］研究發(fā)現(xiàn)，源自高度肝轉移性CRC細胞系HT-29的外泌體可通過招募表達趨化因子受體4（CXCR4）的基質細胞來促成轉移性微環(huán)境，進而促進CRC的肝轉移。Senfter等［28］研究發(fā)現(xiàn)，CRC細胞系CCL227分泌的外泌體含有miR-200家族成員，可轉移至鄰近的淋巴內皮細胞中，抑制調控EMT的轉錄因子ZEB1和SLUG的表達，外泌體中miR-200c的缺失可能導致鄰近內皮細胞產生侵襲、遷移能力。此外，缺氧狀態(tài)下的CRC細胞釋放的外泌體能夠通過富集Wnt4來增加內皮細胞中的β-連環(huán)蛋白核轉運來促進內皮細胞的增殖和遷移，在動物體內研究也證實CRC細胞分泌的外泌體能促進腫瘤生長以及加快血管生成［29］。由CRC細胞Caco-2分泌的外泌體含有Wnt5b蛋白，能夠刺激A549細胞中的Wnt5b信號傳導，促進A549細胞的遷移和增殖［30］。在CRC患者中，APC（腺瘤性結腸息肉病）腫瘤抑制基因的突變很常見，并且與Wnt信號傳導失調有關，當SW480中穩(wěn)定表達野生型APC時，細胞表現(xiàn)出減弱的Wnt信號傳導，并降低致瘤性；蛋白質組分析表明SW480 APC細胞分泌的外泌體特異性表達Wnt拮抗劑DKK4，這可能是調控Wnt信號通路在CRC發(fā)展過程中丟失的機制［31］。

值得注意的是，不管是在體外或體內的研究已經(jīng)表明，CRC細胞的外泌體能通過腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）和Fas配體（FasL）誘導T細胞凋亡，這有助于腫瘤細胞逃避免疫系統(tǒng)的“監(jiān)視”［32］。

4 小結與展望

癌細胞分泌的外泌體可被靶細胞攝取，在細胞間信號傳導中發(fā)揮重要作用，促進腫瘤增殖、侵襲和轉移等。作為細胞間通訊載體的外泌體可作為CRC診斷和預后的有效生物標志物。從非侵入性液體活組織中分離的CRC外泌體的核酸和其他成分可以作為CRC早期診斷和預后監(jiān)測的有效指標。CRC來源外泌體也具有潛在的臨床實用性，其可作為攜帶RNA、蛋白質和藥物并作用于靶細胞的載體。外泌體分泌后可以將其攜帶的內容物傳遞至相鄰或遠處的細胞，并且可以調節(jié)受體細胞中的基因表達、信號傳導或整體功能。抑制腫瘤外泌體的的釋放，可作為干擾腫瘤的生物學進展以及減少耐藥性產生的一種治療癌癥方法。在大多數(shù)的研究中，外泌體是從體外培養(yǎng)物中提取的，并且使用的濃度與生理條件有所差別。體外模型提供了有效的工具來實現(xiàn)快速和有價值的實驗結果。然而，為了加深對CRC來源外泌體的認識及其臨床意義，需要更多的體內研究來評估CRC來源外泌體在腫瘤增殖、宿主免疫調控、血管生成和對治療的反應以及其他方面的作用。