李 萌，李 雪，鄭志強

（河北農(nóng)業(yè)大學，河北 保定 071000）

實時熒光定量簡稱PCR。該技術以PCR技術為基礎進行改進得到的更加快速、靈敏、特異的核算定量技術，有著光譜高敏感性以及定量精確等特點，可以對PCR中熒光信號變化進行直接探測，從而得到定量結果。為進一步加強對該技術研究及應用，本文將針對其原理、特點及應用前景進行探討。

1 原理

Ct是熒光定量PCR技術中重要的一個值，代表著每個反應管內(nèi)熒光信號在達到設定閾值過程中所需要經(jīng)歷循環(huán)數(shù)。在進行熒光定量PCR反應中需要加入特定波長的熒光染料或者基團，然后通過儀器對熒光物質進行監(jiān)測，得到其積累信號即為PCR反應進程，從而定量定性分析起始模板。PCR反應產(chǎn)物隨著PCR反應的進行而不斷積累，同時熒光信號強度也會不斷呈正比增加。熒光強度信號隨著每個循環(huán)的完成而不斷收集，從而通過熒光強度變化對產(chǎn)物量的變化進行監(jiān)測，進而將結果繪制成擴增曲線圖。

2 實時熒光定量PCR的檢測方法

SYBR Green I檢測。SYBR Green I是一種燃料，具有綠色激發(fā)波長，能夠和dsDNA小溝部位相結合，不過期綠色激發(fā)波長只有在和dsDNA結合后方可發(fā)光。變性過程中DNA的雙鏈分開，此時熒光不會發(fā)生；復性和延伸過程中會形成dsDNA此時SYBR Green I會與之結合并有綠色熒光出現(xiàn)。因此，擴增產(chǎn)物的數(shù)量可以根據(jù)熒光強度反應出來。

TaqMan探針。常規(guī)TaqMan探針的5'端對熒光發(fā)射基團FAM（6-羧基熒光素）進行標記，3'端對熒光淬滅基團TAMRA（6-羧基四甲基若丹明）進行標記。在PCR過程中，該探針無法實現(xiàn)延伸。按照FRET原理可知，如果保持完整的探針那么5'端發(fā)射基團的熒光發(fā)射會受到3'端淬滅基團的抑制作用。探針和模板在PCR的退火期會出現(xiàn)特異性雜交，在Taq酶作用下延伸期引物會沿DNA模板不斷延伸直到抵達探針處，此時Taq酶的5'-3'外切活性會發(fā)揮出來，從而置換過程初選。在將探針切斷后，會導致FAM和TAMRA出現(xiàn)分離同時將釋放熒光信號。此時光密度會增加，通過熒光探測系統(tǒng)能夠檢測到這一現(xiàn)象。每復制一次模板就會切斷一個探針，并且釋放一個熒光信號。

分子信標。Taq Man探針衍生了分子信標（Molecular beacons）。分子信標結構為發(fā)夾形狀，主要是單鏈DNA形成，兩段分別標記報告基團和淬滅基團，熒光報告基團會在發(fā)夾結構形成時靠近淬滅基團，發(fā)生FRET，構象會在熱循環(huán)溫度達到分子信標解鏈溫度時出現(xiàn)改變，可以結合模板形成線性分子，線性分子具有延展性，能夠促使FRET消失，同時熒光信號由報告基團發(fā)出。

復合探針。復合探針法是將Light Cycler和分子信標兩種技術的優(yōu)勢充分結合應用，首先將熒光探針和淬滅探針結合，兩探針分別包含5'端接熒光分子和3'端接淬滅分子，兩者可以實現(xiàn)雜交。兩種探針如果在沒有模板的溶液中仍可以特異結合，淬滅探針會吸收熒光探針發(fā)出的熒光，此時熒光并不會產(chǎn)生在容易當中；兩者在有模板的溶液中且溫度較高情況下可以結合模板，從而分離兩探針，此時有熒光產(chǎn)生。溶液中模板數(shù)量越多，熒光強度會越大，所以能夠根據(jù)熒光強度定量分析PCR。

3 實時熒光定量PCR的定量方法

3.1 絕對定量法

用已知的標準曲線對未知樣本的量進行推算的方法為絕對定量法。此種方法需要明確標準樣品的濃度情況，然后稀釋標準樣品，分為幾個不同梯度濃度然后進行反應測試。橫坐標為標準品拷貝數(shù)的對數(shù)值，縱坐標為測得的Ct值，進而繪制出標準曲線。以標準曲線為基礎，在定量分析未知樣品過程中根據(jù)其Ct值能夠將樣起始拷貝數(shù)推算出。

3.2 相對定量法

比較標準曲線的相對定量法。在一定樣本中，靶序列相對于另一參照樣本量變化情況進行分析的方法為相對定量法。在采用該方法過程中，需要有參照物，所以較容易繪制定量標準曲線，只要將標準品稀釋度確定便可進行對比分析。

比較Ct值的相對定量法。此方法是將待測靶基因片段和內(nèi)參照基因片段同時擴增，可以在兩個反應管中或者一個反應管中進行擴增反應，并且就兩者的Ct值之差即ΔCt進行測量。在采用此方法過程中需要用數(shù)學公式進行相對量的計算，首先要假設每個循環(huán)產(chǎn)物增加一倍時PCR反應指數(shù)期得到Ct值對起始模板的量一個循環(huán)的估算和起始模板數(shù)兩倍相當。這種方法的前提是靶基因和內(nèi)源控制物的擴增效率基本一致，所以在應用過程中效率的偏移會對實際拷貝數(shù)估計產(chǎn)生一定影響，因此，為了保證目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率相等應當加強對反應體系的優(yōu)化，這也是該方法應用的難點之一。

4 應 用

4.1 在獸醫(yī)學上的應用

病原體的分子檢測。PCR技術能夠快速、準確地對病原體的DNA或者RNA序列進行定性分析，能夠盡早觀察整個病程中病原體的情況，由于其特性，該技術在疾病早期診斷、藥物治療效果、病情判斷以及診斷遺傳病過程中發(fā)揮了重要作用。有相關研究者利用TaqMan MGB探針方法對牛流行熱病毒進行檢測，利用該技術定量分析10～100個病毒基因組分子的范圍的病毒RNA。

環(huán)境監(jiān)測。微生物含量是否超標是當前水資源、居家辦公環(huán)境質量報告中一項重要指標，如果沒有及時有效監(jiān)測微生物含量，這些物質可能威脅人體的身心健康。和傳統(tǒng)方法相比，實時定量熒光PCR能夠縮短環(huán)境監(jiān)測時間，且有著較高的靈敏度。

4.2 在腫瘤方面的應用

有研究學者在1998年利用RQ-PCR重排了4例前B細胞ALL中TCR，發(fā)現(xiàn)其敏感性類似于斑點雜交，但是比液相雜交低。還有研究者在2004年結直腸癌淋巴結的癌胚抗原（CEA）mRNA的表達量中利用PCR技術進行了測定，測量結果可以用于癌癥轉移的測定。

5 展 望

當前在生物學及其他領域已經(jīng)充分利用實時熒光定量PCR技術，該技術有著敏感性高、測量快速等特點。隨著信息科技的不斷發(fā)展，該技術也在不斷進步，成為醫(yī)學實驗研究的一項重要方法。