郝生宏，楊榮芳,2，曲 強(qiáng)，于 明，溫 萍，瞿建平，李春華，劉素杰

（1.遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧 營(yíng)口 115009；2.遼寧省蛋雞健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 營(yíng)口 115214）

作為與食品安全密切關(guān)聯(lián)的飼料安全問(wèn)題已成為養(yǎng)殖業(yè)關(guān)注的首要問(wèn)題，安全高效的飼料添加劑的使用是養(yǎng)殖品安全的重要保障。對(duì)違禁藥物或未來(lái)可能被列入違禁藥物的添加劑尋求可替代物，是未來(lái)飼料添加劑研究領(lǐng)域的重點(diǎn)研究方向。飼用微生物作為一種新型綠色添加劑，通過(guò)改善微生態(tài)平衡而對(duì)動(dòng)物施加有益影響，具有潛在的綠色飼料添加劑應(yīng)用前景。

1 飼用枯草芽孢桿菌研究概況

枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一個(gè)種，為典型好氧菌，該菌種為中國(guó)、美國(guó)、歐盟等國(guó)家允許作為飼料添加劑使用的芽孢桿菌，能液化明膠、胨化牛奶、還原硝酸鹽、水解淀粉；能產(chǎn)生蛋白酶、α-淀粉酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶和木聚糖酶等。在目前我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)中，對(duì)于飼用枯草芽孢桿菌的研究和應(yīng)用較為廣泛，本文主要從飼用枯草芽孢桿菌分離鑒定、益生特性、制劑開(kāi)發(fā)、功能性成分、與其他因子協(xié)同等方面進(jìn)行論述。

1.1 飼用枯草芽孢桿菌分離鑒定及益生特性研究

目前用于試驗(yàn)的飼用枯草芽孢桿菌有的來(lái)源于菌種保藏部門收藏的菌種，有的分離自土壤及腐敗的有機(jī)物中或動(dòng)物腸道。白延琴等從秸稈垛底層土壤中分離3株枯草芽孢桿菌；林志琳等從健康雞腸道內(nèi)容物中分離獲得一株高活性菌株HEW-B403為枯草芽孢桿菌；巴翠玉等從養(yǎng)魚(yú)塘底泥和健康鯽魚(yú)腸道中分離出枯草芽孢桿菌[1-3]。

對(duì)飼用枯草芽孢桿菌益生特性的研究多集中于耐酸、耐高溫、病原菌頡頏等方面。張璐體外模擬制粒工藝、肉雞消化道環(huán)境，通過(guò)耐熱性、耐酸性、耐膽鹽性、抑菌性、黏附性評(píng)價(jià)枯草芽孢桿菌產(chǎn)品的益生特性，建立了枯草芽孢桿菌益生特性的體外評(píng)價(jià)指標(biāo)體系[4]。竇茂鑫等針對(duì)枯草芽孢桿菌的益生特性展開(kāi)廣泛的體外模擬研究，結(jié)果顯示，該菌在耐高溫、耐膽酸等與動(dòng)物胃腸道耐受性能有關(guān)的指標(biāo)表現(xiàn)較為一致，顯示出較強(qiáng)的抗逆性特征[5]。這為該菌在飼料添加劑開(kāi)發(fā)和應(yīng)用方面提供了有力的理論基礎(chǔ)，并且能大幅降低菌種穩(wěn)定性的保護(hù)所產(chǎn)生的開(kāi)發(fā)成本，在提高制劑的貨架壽命方面也更為有利。

枯草芽孢桿菌對(duì)病原菌的抑制作用也是近年來(lái)研究的重點(diǎn)，張媛媛等研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌PB6菌株的培養(yǎng)液對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌抑菌效果尤為明顯，對(duì)大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌和金黃色葡萄球菌等常見(jiàn)腸道致病菌亦有不同程度的抑菌作用，另外，PB6菌株對(duì)引起鴨傳染性漿膜炎的鴨疫里氏桿菌和引起海洋水產(chǎn)動(dòng)物疾病的弧菌也表現(xiàn)出明顯的抑菌性能[6]。葉小蘭等對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌機(jī)理進(jìn)行了探討，其研究結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌是通過(guò)與病原菌競(jìng)爭(zhēng)黏附位點(diǎn)來(lái)抑制病原菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附和入侵的[7]。崔志文等研究表明，枯草芽孢桿菌能提高氧化應(yīng)激狀態(tài)下Caco-2細(xì)胞的抗氧化功能[8]。

1.2 飼用枯草芽孢桿菌制劑的開(kāi)發(fā)研究

近年來(lái)，飼用枯草芽孢桿菌制劑的開(kāi)發(fā)研究主要集中在培養(yǎng)基配方和工藝參數(shù)的優(yōu)化（pH、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、接種量、時(shí)間等）兩個(gè)方面。培養(yǎng)的方式通常會(huì)選擇固態(tài)發(fā)酵或液態(tài)發(fā)酵，在發(fā)酵原料方面注重經(jīng)濟(jì)節(jié)約，在發(fā)酵效果方面主要以活菌量為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，在發(fā)酵工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上，也注重制劑后加工，比如干燥、包被方面的研究。

劉惠知等將優(yōu)化后的配方進(jìn)行發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，獲得的菌體數(shù)量約1.3×1011cfu·mL-1[9]。付小猛研究了枯草芽孢桿菌高密度固態(tài)發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基與最佳培養(yǎng)條件，并比較了轉(zhuǎn)盤發(fā)酵、通風(fēng)發(fā)酵罐及淺盤發(fā)酵三種固態(tài)發(fā)酵方式的發(fā)酵效果，其中淺盤發(fā)酵效果最佳（11.1×1010cfu·mL-1）[10]。張麗美將枯草芽孢桿菌接種于金針菇菌糠中，優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，最終產(chǎn)品的枯草芽孢桿菌的芽孢數(shù)為8.0×109cfu·mL-1[11]。宋文龍等采用海參腸道中篩選的枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌株，經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，發(fā)酵液的活菌濃度可達(dá)到4.0×109cfu·mL-1[12]。魏姍姍等對(duì)分離自健康仔豬空腸黏膜的枯草芽孢桿菌進(jìn)行抑菌培養(yǎng)條件優(yōu)化，篩選出最佳發(fā)酵液的抑菌條件[13]。胡紅偉等從雞腸道篩選出一株枯草芽孢桿菌，并對(duì)該菌株的培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，最終芽孢數(shù)可達(dá)51.95×108cfu·mL-1[14]。崔臘梅等在優(yōu)化培養(yǎng)基之后，通過(guò)對(duì)吸附載體配比的正交實(shí)驗(yàn)，篩選最佳枯草芽孢桿菌液體吸附載體[15]。宋文龍等以1%海藻酸鈉為壁材，4%氯化鈣作為固化劑，將發(fā)酵后收集的菌體通過(guò)乳化法和擠壓法制成微膠囊制劑[12]。劉宇等優(yōu)化了豬源枯草芽孢桿菌噴霧干燥工藝，并檢測(cè)芽孢率對(duì)菌體噴霧干燥存活率的影響[16]。

1.3 飼用枯草芽孢桿菌功能性成分的研究

雷元培等將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液分成上清液、菌懸液和胞內(nèi)液組分，結(jié)果顯示，起解毒作用的活性物質(zhì)是其分泌的一種胞外酶[17]。盛琴對(duì)枯草芽孢桿菌肽聚糖成分檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)含量為53.55%，總糖含量32.98%，總脂為2.91%，肽聚糖氨基酸組成分析顯示，天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸的含量較高，并證明該枯草芽抱桿菌細(xì)胞壁肽聚糖可增強(qiáng)特異性和非特異性免疫，并且呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系[18]。喻鋼等研究了枯草芽孢桿菌發(fā)酵上清液抑菌活性物質(zhì)，質(zhì)譜檢測(cè)推測(cè)為Subtilosin A結(jié)構(gòu)類似物[19]。鄒遠(yuǎn)軍等從枯草芽孢桿菌分離制備得到抑菌單體化合物（GNH-2），初步推斷GNH-2屬于直鏈的肽類化合物[20]。

1.4 飼用枯草芽孢桿菌與其他功能性因子協(xié)同的研究

程志斌等研究表明，添加絲蘭提取物和枯草芽孢桿菌能夠顯著降低雞舍臭氣，改善肉雞生長(zhǎng)性能[21]。師寧寧等研究表明，藥散劑（由黃連、黃柏、穿心蓮、石菖蒲、藿香、蒼術(shù)組成）與枯草芽孢桿菌聯(lián)合使用對(duì)蛋雞平均蛋重、破損率和耗料量顯著改善，蛋殼厚度顯著提高，蛋黃膽固醇含量降低12.47%，且蛋黃顏色顯著改善[22]。潘寶海等從牛膝、黃芪和蘆薈中提取了三種植物多糖，篩選出了三種多糖與枯草芽孢桿菌的最佳協(xié)同劑量[23]。邊連全等研究結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌-菊糖合生元可提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能與體液免疫功能，并表現(xiàn)出較好的協(xié)同效應(yīng)[24]。李興華研究表明，枯草芽孢桿菌和酵母細(xì)胞壁多糖復(fù)合物對(duì)哺乳和斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、腹瀉率均有改善[25]。吳陽(yáng)等研究結(jié)果表明，飼料中添加低聚木糖與枯草芽孢桿菌能不同程度地提高團(tuán)頭魴的生長(zhǎng)性能，提高腸道消化酶的活性，促進(jìn)其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[26]。鄧軍等研究結(jié)果顯示，同時(shí)飼喂枯草芽孢桿菌和豬源乳酸桿菌能顯著提高十二指腸和回腸的腸絨毛高度，增加十二指腸和空腸絨毛的數(shù)量，降低空腸和回腸的隱窩深度，以及增加十二指腸、空腸和回腸的絨腺比，能有效地拮抗大腸埃希菌K88對(duì)仔豬腸道上皮的損傷，總體效果優(yōu)于單獨(dú)飼喂[27]。郭軍蕊等試驗(yàn)證明，飼糧中枯草芽孢桿菌與苜蓿多糖聯(lián)合使用能夠改善蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)，降低糞和盲腸大腸桿菌數(shù)量，增加腸道雙歧桿菌數(shù)量，且聯(lián)合使用效果在改善血清生化指標(biāo)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能方面較單獨(dú)使用枯草芽孢桿菌有一定優(yōu)勢(shì)[28]。汪帥男等研究表明，枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物具有抗豬傳染性胃腸炎病毒（TGE）作用，枯草芽孢桿菌和黃芪多糖聯(lián)合處理后TGEV抑制率顯著上升[29]。

2 飼用枯草芽孢桿菌在研究和應(yīng)用中存在的問(wèn)題

動(dòng)物微生態(tài)系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，目前對(duì)其認(rèn)識(shí)較為有限。作為一種有益的微生物，枯草芽孢桿菌在動(dòng)物養(yǎng)殖中的效果得到了廣泛驗(yàn)證，但研究深度和廣度仍顯不足。飼用枯草芽孢桿菌的研究和應(yīng)用主要存在如下問(wèn)題：目前使用的枯草芽孢桿菌菌種來(lái)源廣泛，很多菌株都來(lái)自實(shí)驗(yàn)室自行分離，對(duì)菌種的質(zhì)量控制措施不夠重視。重視該菌種在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用研究，缺乏對(duì)該菌株的基礎(chǔ)性研究，尤其是潛在的變異所引發(fā)的安全性和有效性問(wèn)題，需要進(jìn)一步改進(jìn)新菌種審批流程，建立嚴(yán)格的菌種的準(zhǔn)入制度?？莶菅挎邨U菌對(duì)動(dòng)物微生態(tài)系統(tǒng)的影響研究較為局限，未見(jiàn)全面系統(tǒng)研究其對(duì)動(dòng)物正常微生物區(qū)系中各位點(diǎn)產(chǎn)生干擾的可能性，也缺乏其產(chǎn)生的各類活性物質(zhì)對(duì)正常區(qū)系成員進(jìn)行干擾的可能性。枯草芽孢桿菌的添加劑量差異較大，產(chǎn)品的有效性和穩(wěn)定性仍顯不足，受檢測(cè)技術(shù)、分類體系等的限制，國(guó)家對(duì)于該類產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定也存在難點(diǎn)，短期內(nèi)難有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)出臺(tái)，在計(jì)量表述方面也存在不規(guī)范。在未驗(yàn)證是否相互干擾的情況下，存在枯草芽孢桿菌與其他菌種、中草藥、功能性寡糖、植物提取物、多肽隨意協(xié)同配伍的現(xiàn)象，個(gè)別商家借此進(jìn)行商業(yè)炒作，夸大產(chǎn)品效果。標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型的選擇、飼養(yǎng)環(huán)境的規(guī)范化非常重要，對(duì)研究結(jié)果的穩(wěn)定性和說(shuō)服力有可靠的參考意義。生產(chǎn)性能方面的研究重復(fù)研究現(xiàn)象明顯，缺乏深入、系統(tǒng)地向細(xì)胞及分子水平的擴(kuò)展性研究，應(yīng)努力建立相互聯(lián)系，探明枯草芽孢桿菌在動(dòng)物生態(tài)環(huán)境中的作用機(jī)制。

3 小結(jié)

目前，對(duì)于飼用枯草芽孢桿菌分離鑒定、開(kāi)發(fā)研究、功能性成分及與其他功能性因子協(xié)同的研究已取得了一定進(jìn)展，但研究深度和廣度仍顯不足。今后應(yīng)加強(qiáng)飼用枯草芽孢桿菌質(zhì)量控制、安全性、添加劑量、配伍方法、作用機(jī)制等方面的研究，使飼用枯草芽孢桿菌的應(yīng)用更加廣泛。