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(青島大學(xué)，山東 青島 266071)

溶菌酶(Lysozyme)又稱胞壁質(zhì)酶(Muramidase), 廣泛存在于自然界，具有抗細(xì)菌、真菌及腫瘤等多種藥理作用，具有生物相容性好對(duì)組織無(wú)刺激性、無(wú)毒性的特點(diǎn)，已被制作為一種性質(zhì)優(yōu)良?xì)≡⑸锒黄茐臋C(jī)體的酶制劑。根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)和來(lái)源的不同分為6類：植物溶菌酶、微生物溶菌酶、噬菌體溶菌酶(主要為T(mén)4噬菌體)、C型(蛋清溶菌酶、胃溶菌酶等)、G型(鵝型溶菌酶)和I型(無(wú)脊椎動(dòng)物溶菌酶)，其中C、G型和噬菌體溶菌酶最常見(jiàn)。溶菌酶化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，商品化主要為蛋清溶菌酶，僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有抑制作用，為此國(guó)內(nèi)外一直致力于開(kāi)發(fā)改良新型溶菌酶。本文就溶菌酶的作用機(jī)制、目前的改良開(kāi)發(fā)及應(yīng)用情況進(jìn)行綜述。

1 溶菌酶的作用機(jī)制

1.1抗細(xì)菌作用 溶菌酶是存在于動(dòng)物體液及組織中的固有免疫因子，通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞壁激活細(xì)菌自溶蛋白，使膜通透性增大導(dǎo)致細(xì)菌裂解死亡，其機(jī)制如下：N-乙酰己糖胺酶水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的β-1,4糖苷鍵；酰胺酶水解細(xì)菌細(xì)胞壁內(nèi)N-乙酰葡糖胺與肽橋之間的連接—N-乙酰葡糖胺-L-丙氨酸鍵及內(nèi)肽酶水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽橋內(nèi)的肽鍵。蛋清溶菌酶是目前研究最為透徹的一種溶菌酶。通過(guò)X-射線衍射得到的晶體學(xué)數(shù)據(jù)，Phillips等最先提出蛋清溶菌酶催化糖苷鍵斷裂的能力來(lái)自靜電穩(wěn)定的碳正離子中間體及空間位阻效應(yīng)，酶的活性位點(diǎn)與糖結(jié)合使其變構(gòu)成半椅型構(gòu)象，使糖苷鍵容易斷裂；之后Vocadlo等又發(fā)現(xiàn)酶結(jié)構(gòu)中Glu35對(duì)于維持酶的活性至關(guān)重要，Glu35作為糖苷鍵的質(zhì)子供體，切割底物碳氧單鍵，通過(guò)Asp52形成糖基酶中間體，隨后Glu35與水反應(yīng)形成的氫氧根攻擊糖基酶中間體，水解生成產(chǎn)物，而酶保持不變。

蛋清溶菌酶不能直接殺傷革蘭氏陰性菌，源于革蘭氏陰性菌與陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中肽聚糖含量及膜結(jié)構(gòu)的不同，但可通過(guò)與革蘭氏陰性菌中的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)結(jié)合，形成非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，進(jìn)而減弱LPS與巨噬細(xì)胞及上皮細(xì)胞受體的相互作用，在一定程度上可以減輕組織的非特異性炎癥反應(yīng)。

MCR-1是已知能進(jìn)行基因水平轉(zhuǎn)移的第一個(gè)多粘菌素抗性基因[1]。最近發(fā)現(xiàn)MCR-1基因還能改變細(xì)胞外膜帶電水平，從而對(duì)溶菌酶產(chǎn)生交叉抗性[2]。另外，有些細(xì)菌能產(chǎn)生溶菌酶抑制劑以對(duì)抗溶菌酶。抑制劑錨定于細(xì)胞外表面或周質(zhì)空間，通過(guò)封閉溶菌酶活性位點(diǎn)使細(xì)菌細(xì)胞壁不受外源溶菌酶的分解。

1.2抗真菌作用 類似于水解細(xì)菌細(xì)胞壁，溶菌酶能水解真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的β-1,4糖苷鍵。此外溶菌菌酶中殼多糖酶可以分解真菌細(xì)胞壁殼多糖。β-1,3、β-1,6葡聚糖酶和甘露糖酶可分解酵母菌的細(xì)胞壁；Sowa等[3]發(fā)現(xiàn)溶菌酶溶壁后通過(guò)誘導(dǎo)真菌凋亡發(fā)揮作用，多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)溶菌酶處理過(guò)的白色念珠菌表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞凋亡特征：線粒體膜電位改變、磷脂酰絲氨酸暴露以及染色質(zhì)固縮和DNA斷裂等。Smedowski等[4]在真菌性角膜炎研究中發(fā)現(xiàn)：角膜炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)平均密度是細(xì)菌性感染的2～3倍 ，這表明了在真菌感染時(shí)控制炎癥反應(yīng)，避免產(chǎn)生過(guò)強(qiáng)炎癥反應(yīng)的重要性。溶菌酶可抑制高遷移率族蛋白1(High mobility group box-1 protein，HMGB1)的釋放和內(nèi)皮細(xì)胞中白細(xì)胞的遷移，抑制TNF-α、IL-1β及MCP-1等炎癥因子在人內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。Lee等[5]也證明溶菌酶減輕炎癥后期反應(yīng)的機(jī)制之一是抑制HMGB1信號(hào)通路，降低其表達(dá)改善預(yù)后。

在我國(guó)真菌病屬于高發(fā)常見(jiàn)病，而抗真菌藥療效差、毒副作用大。因此亟待尋找低毒高效的新型抗真菌藥物。溶菌酶性質(zhì)優(yōu)良具有較強(qiáng)的抗真菌活性，如綠豆溶菌酶等植物溶菌酶、海洋分支桿菌溶菌酶等對(duì)煙曲霉菌、茄病鐮刀菌、腐皮霉菌、白色假絲酵母等均具有殺菌療效，可以作為潛在的新型抗真菌藥物[6-7]。

1.3抗病毒作用 溶菌酶抗病毒的報(bào)道相對(duì)較少。機(jī)制之一作為堿性蛋白質(zhì)，在體內(nèi)中性條件下可攜帶大量正電荷，作為陽(yáng)離子蛋白與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接作用，和DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽，使侵入機(jī)體的病毒失活[8]。另外，通過(guò)激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用殺傷病毒。因此，溶菌酶可以作為一種安全的輔助抗病毒藥物使用。

1.4抗腫瘤作用 從Shumacher等發(fā)現(xiàn)溶菌酶可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，溶菌酶對(duì)腫瘤的治療研究已有50年的歷史。資料顯示有些溶菌酶對(duì)大多數(shù)腫瘤細(xì)胞起作用，甚至是惡性淋巴瘤，減少腫瘤細(xì)胞密度并延長(zhǎng)動(dòng)物的存活時(shí)間[9]。常用的蛋清溶菌酶抗腫瘤效果不明顯，而鯊魚(yú)軟骨溶菌酶則具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，通過(guò)直接或間接激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。海洋微生物溶菌酶還具有類似于血管生成抑制因子的作用，體外實(shí)驗(yàn)顯示可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移，通過(guò)抑制新生血管的生成來(lái)抑制腫瘤組織的生長(zhǎng)。此外，溶菌酶聯(lián)合絲裂霉素等化療藥物還可優(yōu)化化療效果，因此可作為輔助藥物，增強(qiáng)治療效果，改善愈后。

研究還發(fā)現(xiàn)HMGB1在癌變組織中表達(dá)量增高，胞外的HMGB1可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移，這對(duì)腫瘤細(xì)胞侵潤(rùn)尤為重要。將肺癌細(xì)胞注射至小鼠皮下，給予HMGB1抗體即可抑制后期腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，HMGB1不僅在炎癥后期起重要促炎作用，還可引起晚期糖基化終產(chǎn)物(Receptor for advanced glycation end products，RAGE)增多，RAGE與細(xì)胞粘附聚集有關(guān)，是腫瘤治療的靶點(diǎn)之一[10]。而溶菌酶可以降低HMGB1表達(dá)量，可能通過(guò)抑制HMGB1-RAGE通路發(fā)揮抗腫瘤作用。

2 溶菌酶的改良開(kāi)發(fā)

溶菌酶化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，一般等電點(diǎn)在10～11左右，最適pH為在6～7之間，不同溶菌酶最適溫度差別可較大。新的溶菌酶開(kāi)發(fā)主要是從各種生物中發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)活性、性質(zhì)獨(dú)特的酶系，或?qū)ΜF(xiàn)有溶菌酶進(jìn)行化學(xué)修飾、吸附等以增強(qiáng)其生物活性，或賦予其新的性質(zhì)。 介質(zhì)吸附提高酶活：例如溶菌酶吸附于納米銀粒子，抗大腸桿菌活性提高了35%[11]。然而與無(wú)機(jī)納米顆粒相比，天然大分子制備而成的有機(jī)納米顆粒生物相容性更好。因此，F(xiàn)rank等 通過(guò)將溶菌酶與聚乙二醇或聚丙二醇復(fù)合生產(chǎn)出一種具有抗菌活性、可注射用的低免疫原性的溶菌酶復(fù)合物。Hashemi等[12]發(fā)現(xiàn)溶菌酶和阿拉伯樹(shù)膠交聯(lián)使用可以增強(qiáng)溶菌酶的廣譜抗菌活性，并且產(chǎn)物具有低溫不結(jié)晶析出、不易被微生物侵蝕、無(wú)刺激性無(wú)毒等多種優(yōu)良性質(zhì)，可以應(yīng)用于食品保鮮防腐等領(lǐng)域。還有許多交聯(lián)物與溶菌酶交聯(lián)可增強(qiáng)溶菌酶活性，如黃芪膠等植物膠、EDTA-2Na等螯合劑、烷基化合物、植物精油、紫蘇醛等[13-15]。

化學(xué)修飾廣泛應(yīng)用于改良酶的性質(zhì)，賦予酶更強(qiáng)的活性、更穩(wěn)定的性質(zhì)。常見(jiàn)的修飾類型有乙?；Ⅴ０坊?、酯化、琥珀?；⒘姿峄?、硫醇化和糖基化等，例如：糖基化可以改變蛋白表面電荷，從而改變蛋白的親疏水性，影響蛋白質(zhì)-水互作和蛋白-蛋白互作，從而引起構(gòu)象改變，影響蛋白質(zhì)功能。Ladan等[16]利用美拉德反應(yīng)糖基化蛋清溶菌酶，然后用棕櫚酸進(jìn)行脂化，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物具有極強(qiáng)的抗大腸桿菌活性。Takahashi等則將糖和脂肪酰基結(jié)合并與溶菌酶交聯(lián)形成綴合物，盡管產(chǎn)物的殺菌活性降低了，但更加穩(wěn)定并具有較強(qiáng)的蛋白酶抗性，變性溫度增加到了74 ℃。

有一部分溶菌酶由于其所處的特殊環(huán)境，導(dǎo)致性質(zhì)不同于一般溶菌酶，如反芻動(dòng)物牛瘤胃中的胃溶菌酶，能夠在富含胃酸和胃蛋白酶的環(huán)境中發(fā)揮作用，因而在低pH等情況下具有很好的應(yīng)用潛力。海洋特殊的高鹽、高壓、低溫(或高溫)、低營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境，使海洋生物所產(chǎn)的溶菌酶也具有一些獨(dú)特性質(zhì)，如嗜低溫(嗜高溫)、抗氧化作用強(qiáng)、廣譜殺菌等。分析氨基酸殘基發(fā)現(xiàn)，嗜低溫酶相比中溫酶含有大量帶負(fù)電荷的氨基酸殘基，主要是是天冬氨酸殘基，因此缺乏離子鍵，分子呈相對(duì)“松散”狀態(tài)而具有較大可變性，使其能在低溫環(huán)境下仍能維持較高的催化活性。嗜高溫酶中亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸及精氨酸含量較高。一定程度說(shuō)明了蛋白質(zhì)氨基酸組成與熱穩(wěn)定的關(guān)系，這對(duì)蛋白質(zhì)工程改造替換氨基酸具有重要意義。

對(duì)一些獨(dú)特性質(zhì)的酶，可以利用交聯(lián)有機(jī)大分子、化學(xué)修飾、蛋白酶切等手段增強(qiáng)酶的優(yōu)良性質(zhì)。開(kāi)發(fā)藥物關(guān)鍵在于發(fā)現(xiàn)具有生物活性的新型化合物或先導(dǎo)物，從動(dòng)植物及微生物中發(fā)現(xiàn)提取新型生物活性物質(zhì)，是新藥研究的重要選擇。利用宏基因組、功能基因篩查及測(cè)序分析找到新型溶菌酶。通過(guò)發(fā)酵與基因工程相結(jié)合，或利用動(dòng)植物生物反應(yīng)器如乳腺生物反應(yīng)器等，較容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，進(jìn)而獲得高效、安全的新型藥物。

3 溶菌酶的應(yīng)用

3.1溶菌酶在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用 溶菌酶在人體內(nèi)非特異性免疫中發(fā)揮著重要作用，具有殺菌抗炎，促進(jìn)組織修復(fù)及增強(qiáng)免疫力等多種生物活性作用，是一種性質(zhì)優(yōu)良的藥用酶，因而已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，例如治療急慢性鼻咽喉炎、口腔潰瘍、水痘、帶狀皰疹及扁平疣等，偶有較輕的過(guò)敏反應(yīng)。

對(duì)于常見(jiàn)的腸道微生態(tài)菌群失調(diào)引起的腹瀉、腸源性內(nèi)毒素血癥等，及陰道微生態(tài)平衡失調(diào)、厭氧菌和加德納菌過(guò)剩生長(zhǎng)所引起的炎性綜合征等，抗生素殺菌療效雖好但同樣會(huì)殺傷益生菌，耐藥菌成為新的優(yōu)勢(shì)菌造成情況惡化。而溶菌酶通過(guò)殺死腸道腐敗球菌，促進(jìn)益生菌雙歧乳酸桿菌的增殖，扶植正常菌群提升免疫力，保護(hù)微生態(tài)環(huán)境增加腸道抗感染力。

在目前的研究中，已將海洋微生物發(fā)酵得到的溶菌酶膜劑成功用于治療細(xì)菌性陰道炎，臨床療效顯著[17]。從牡蠣中提取的海洋溶菌酶，已被用于制造海婦潔膜，治療細(xì)菌性陰道炎，無(wú)毒無(wú)刺激性，放置后對(duì)胎兒和新生兒均無(wú)影響，療效肯定，使用方便且不易產(chǎn)生耐藥性[17]。

3.2溶菌酶在食品工程的應(yīng)用 微生物引起的腐敗會(huì)導(dǎo)致食品質(zhì)量及食用價(jià)值下降，甚至可能導(dǎo)致食物中毒。因此，殺滅微生物對(duì)食品質(zhì)量及安全十分重要。目前常用的手段有干燥、加熱、排除空氣、紫外線照射、添加防腐劑等，但對(duì)各項(xiàng)措施副作用的擔(dān)憂也越來(lái)越多。因此，溶菌酶等天然抗菌活性物質(zhì)逐漸登上食品工程的舞臺(tái)，一些溶菌酶具有無(wú)毒防腐、抗氧化及溶菌譜廣等特點(diǎn)功效，與一些化學(xué)試劑配伍后還可增強(qiáng)活性[18]。歐盟在2000年已經(jīng)允許在海產(chǎn)品、奶酪等乳制品、豆類產(chǎn)品、葡萄酒等酒類及紅腸等肉類中添加溶菌酶，作為一種安全廣譜的殺菌防腐劑。

Cooper等[19]發(fā)現(xiàn)可以使用溶菌酶治療大腸桿菌引起的仔豬腹瀉，因此可以用作飼料的防腐劑和保健添加劑。又如人乳中含有大量溶菌酶，遠(yuǎn)高于牛乳，可在動(dòng)物乳制品中添加溶菌酶，使牛乳“人乳化”，有利于維持嬰兒腸道微生物群正常同時(shí)還能促進(jìn)嬰兒腸道雙歧乳酸桿菌增殖，促進(jìn)乳酪蛋白凝乳利于消化。所以溶菌酶又是嬰幼兒食品的良好添加劑 。海產(chǎn)品一般在低溫下儲(chǔ)藏，低溫會(huì)限制大多數(shù)酶的使用效果。海洋生物特別是生活在極端環(huán)境下的海洋微生物能產(chǎn)生豐富的極端酶，具有更為獨(dú)特的酶學(xué)性質(zhì)，如嗜低溫幾乎不受金屬離子等添加劑的影響等，已引起國(guó)內(nèi)外研究人員的極大關(guān)注。

此外，溶菌酶還可用于分解細(xì)胞壁，制備原生質(zhì)體，及用于微生物分類和育種，作為遞送藥物蛋白及研究蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)的模式蛋白等，已成為細(xì)胞工程和基因工程中不可或缺的工具酶之一[20]。近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，尋找具有全新性質(zhì)的酶已成為酶制劑研究的熱點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，人們已經(jīng)從微生物中發(fā)現(xiàn)了10 000多種具有生物活性的代謝產(chǎn)物，許多具有開(kāi)發(fā)前景的生物活性物質(zhì)并不是由動(dòng)植物產(chǎn)生的，而是由與其共生的微生物產(chǎn)生的。海洋微生物資源豐富、種類繁多，幾乎包括所有微生物類型，能產(chǎn)生豐富的極端酶，其生物多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于陸地生物多樣性。利用宏基因組手段，篩查環(huán)境中的微生物，發(fā)現(xiàn)具有優(yōu)良性質(zhì)的新型酶，利用發(fā)酵、生物反應(yīng)器等手段或結(jié)合基因工程實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)，獲得高純高效的酶類，例如通過(guò)生物發(fā)酵得到的海洋溶菌酶以其顯著療效已引起了極大關(guān)注。因此，溶菌酶在醫(yī)藥、生產(chǎn)科研等領(lǐng)域具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闕的應(yīng)用前景。