趙宇莎， 鄭 丹， 于 琪， 茍 敏， 湯岳琴

(1.四川大學(xué) 建筑與環(huán)境學(xué)院， 成都 610065； 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部沼氣科學(xué)研究所， 成都 610041； 3.中原康達(dá)環(huán)保產(chǎn)業(yè)有限公司， 鄭州 450000)

厭氧消化能有效地促進(jìn)能源與環(huán)境的協(xié)調(diào)發(fā)展，一直備受關(guān)注。該過程通常需要不同微生物群落(發(fā)酵細(xì)菌，產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌和產(chǎn)甲烷菌)的參與協(xié)作，才能實(shí)現(xiàn)甲烷的生產(chǎn)[1]。研究證實(shí)，有更多功能與特性未知的未培養(yǎng)微生物參與了厭氧消化過程，產(chǎn)甲烷機(jī)制比預(yù)期的更加復(fù)雜[2]。因此，鑒定厭氧消化體系中的微生物多樣性，有助于深入理解產(chǎn)甲烷機(jī)制并指導(dǎo)工藝優(yōu)化調(diào)控。宏基因組學(xué)是近20年新興的科學(xué)領(lǐng)域，它避開微生物的分離培養(yǎng)過程，直接從基因?qū)用嬖谎芯课⑸锏亩鄻有?，可最大限度地識(shí)別環(huán)境微生物的群落信息[3]?；诤昊蚪M的分子生物學(xué)技術(shù)(如DGGE，16S rRNA基因克隆文庫，T-RFLP等)的發(fā)展，已經(jīng)成為分析厭氧消化過程優(yōu)勢微生物的重要平臺(tái)[4]。但這些傳統(tǒng)方法鑒定到的優(yōu)勢菌群往往并非是“真正”的功能微生物。

DNA穩(wěn)定同位素探針(DNA stable-isotope probing, DNA-SIP)是一種新興的分子生態(tài)學(xué)技術(shù)，可用于甄別復(fù)雜環(huán)境中參與特殊代謝功能的微生物。其基本原理為：環(huán)境樣品經(jīng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記的底物(以13C為主)培養(yǎng)后，微生物利用13C-底物生長繁殖合成13C-DNA，通過浮力密度差異將13C-DNA與12C-DNA分離，進(jìn)一步對(duì)13C-DNA進(jìn)行分析即可獲得功能微生物的信息。由于DNA-SIP僅以來源于底物利用菌的13C-DNA為研究對(duì)象，因此極大地降低了環(huán)境微生物群落的復(fù)雜性，從而將底物代謝過程與微生物群落組成直接相聯(lián)系[5]。鑒于DNA-SIP技術(shù)的優(yōu)勢，現(xiàn)已被應(yīng)用于不同環(huán)境中各類微生物功能菌的鑒定(如甲基互營，生物降解，碳氮循環(huán)等過程)，但其在厭氧消化過程中的應(yīng)用相對(duì)較少[6]。

此外，DNA-SIP存在13C-DNA回收量小、時(shí)間長、容易交叉標(biāo)記等缺陷，因此，探索合適的標(biāo)記及離心條件并獲得足夠的13C-DNA是成功富集功能微生物的關(guān)鍵[6]。本研究以13C-葡萄糖為底物，考察了不同條件對(duì)厭氧消化污泥中葡萄糖利用菌的標(biāo)記效果，旨在為鑒定真正的厭氧消化功能群提供基礎(chǔ)，進(jìn)而促進(jìn)對(duì)厭氧產(chǎn)甲烷機(jī)制的理解。

1 材料與方法

1.1 污泥來源

用于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的污泥來自本實(shí)驗(yàn)的纖維素厭氧消化反應(yīng)器。該完全混合型反應(yīng)器總體積3 L，工作體積2 L，纖維素進(jìn)料負(fù)荷為1 g·L-1d-1，在53℃，低速攪拌(85 rpm)條件下連續(xù)穩(wěn)定運(yùn)行212 d。

1.2 試劑

主要試劑如13C-葡萄糖(13C，99%)，CsCl，CTAB購于sigma公司(美國)。

1.3 污泥樣品的標(biāo)記及分析

1.3.1 標(biāo)記樣品的培養(yǎng)及采樣

取30 mL厭氧消化污泥于50 mL厭氧瓶中，通入氮?dú)庵脫Q空氣后，立即采用丁基膠塞和鋁蓋密封，并放置于搖床中餓養(yǎng)至污泥停止產(chǎn)氣。隨后將葡萄糖溶于滅菌水后采用無菌注射器投入?yún)捬跗?，同時(shí)補(bǔ)充少量微量元素溶液，于53℃和150 rpm條件下培養(yǎng)并取樣分析。底物添加及取樣操作均在厭氧手套箱(Gene Science AG300，美國)中進(jìn)行。所有處理均設(shè)置兩個(gè)平行樣，并分別以12C-葡萄糖作為對(duì)照。其中，使用的微量元素溶液組分如下(g·L-1)：FeCl3·6H2O, 1.35；MnCl2·4H2O, 0.1；CaCl2·2 H2O，0.1；ZnCl2，0.1；CuCl2·2H2O，0.025；H3BO3，0.01；Na2MoO4·2H2O，0.024；NaCl，1.0；Na2SeO3·5 H2O，0.026；次氮基三乙酸 (NTA)，12.8。

1.3.2 標(biāo)記過程的氣體和樣品收集

定期采用10 mL無菌注射器測定產(chǎn)氣量。污泥品樣定期取樣后，于12000 rpm，4℃離心10 min后，污泥沉淀和適量體積PBS緩沖溶液混合震蕩，于12000 rpm，4℃離心10 min，反復(fù)清洗2～3次后，去除上清液，污泥沉淀保存于-80℃，用于后續(xù)的PCR定量分析。

1.3.3 超高速密度梯度離心分離

利用常規(guī)CTAB法提取污泥的總DNA。取2.5 μg DNA，與4.8 mL CsCl溶液，1.2 mL Gradient Buffer(GB緩沖液)混勻, 采用10 mL無菌注射器將混合液移至6 ml超高速離心管中，于超高速離心機(jī)(Beckman Coulter, OptimaTML-80 XP, 美國)離心形成浮力密度梯度區(qū)帶。離心后使用軟管連接精密注射泵(Harvard Apparatus Pump 11 Pico Plus，美國)與離心管，利用無菌水的水壓收集各層樣品，并采用折光儀(Reichert AR200，美國)測定各層級(jí)折光率。折光率與密度的換算公式如下：

n=0.0796ρ+1.2649

(1)

式中：n為液體折光率；ρ為液體密度，g·mL-1。

1.3.4 熒光定量PCR分析

對(duì)各層樣品的16S rDNA基因含量(拷貝數(shù))進(jìn)行熒光定量PCR分析。反應(yīng)體系總體積為20 μl，包括：10 μM引物Eu518F及Eu27F各0.8 μl，SYBR染液10 μl，DNA 2.0 μl，滅菌水6.4 μl。PCR反應(yīng)條件如下：95℃，預(yù)變性30 s；95℃，變性10 s，50℃，退火5 s，72℃，延伸40 s，共40個(gè)循環(huán)；融解95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s；冷卻37℃ 30 s。以16S rDNA基因的豐度(每層拷貝數(shù)與各層級(jí)拷貝數(shù)總和的比值)為縱坐標(biāo)，浮力密度為橫坐標(biāo)，可得16S rDNA基因在不同浮力密度中的分布規(guī)律圖。

1.4 DNA-SIP標(biāo)記條件的優(yōu)化

1.4.1 離心轉(zhuǎn)速對(duì)DNA-SIP標(biāo)記效果的影響

取底物投加量為30 mg葡萄糖，標(biāo)記時(shí)間為4天的樣品, 分別在45400 rpm和50300 rpm的轉(zhuǎn)速下于20℃離心40 h，考察超高速離心轉(zhuǎn)速對(duì)標(biāo)記效果的影響。

1.4.2 底物投加量對(duì)DNA-SIP標(biāo)記效果的影響

分別投加總量為30 mg和60 mg的葡萄糖，考察底物投機(jī)量對(duì)標(biāo)記效果的影響。30 mg葡萄糖一次性投加，停止產(chǎn)氣時(shí)(4 d)取樣。60 mg葡萄糖于第0和6天分別投加30 mg，取樣時(shí)間為第11天。

1.4.3 污泥固含量對(duì)DNA-SIP標(biāo)記效果的影響

取若干消化污泥，在20℃，14000 rpm條件離心10 min。利用上清液稀釋使得污泥固含量分別為0.1%，0.2%，0.4%，2.1% (w/w)。分批投加總量為100 mg的葡萄糖進(jìn)行標(biāo)記培養(yǎng)，即于第0，4和8天分別投加33.3 mg，取樣時(shí)間為第8和12天(取樣時(shí)底物投加總量分別為66.6 mg和100 mg)。樣品經(jīng)20℃，45400 rpm，40 h超離速離心分層后，考察污泥固含量對(duì)標(biāo)記效果的影響。

2 結(jié)果

2.1 離心條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)室前期小試發(fā)現(xiàn):經(jīng)13C-葡萄糖標(biāo)記的污泥中的12C-DNA與13C-DNA的浮力密度分別為1.70 g·mL-1及1.72～1.74 g·mL-1左右(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，本研究考察了文獻(xiàn)報(bào)道常用的兩個(gè)離心轉(zhuǎn)速(50300 rpm和45400 rpm)對(duì)污泥樣品的DNA-SIP標(biāo)記效果。表1顯示：不同轉(zhuǎn)速下形成的CsCl介質(zhì)中相鄰梯度區(qū)帶的浮力密度差有較大差異。由表1可知轉(zhuǎn)速為45400 rpm形成的浮力密度差較小。為確保兩種DNA離心后相隔一個(gè)區(qū)帶，能被有效分離，故后續(xù)離心條件設(shè)為20℃，45400 rpm，40 h。

表1 不同轉(zhuǎn)速條件下微生物DNA的分離效果 (g·mL-1)

2.2 底物投加量優(yōu)化

分別向污泥中投加總量為30 mg和60 mg的葡萄糖，產(chǎn)氣量如圖1所示。由圖可知：所有樣品的產(chǎn)氣量均在第1天迅速升高，微生物每消耗完30 mg葡萄糖大約需4～6 d，隨后逐漸停止產(chǎn)氣。且12C-葡萄糖與13C-葡萄糖的產(chǎn)氣趨勢及產(chǎn)氣量基本吻合，可作為對(duì)照進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，根據(jù)產(chǎn)氣結(jié)果，將30 mg和60 mg葡萄糖標(biāo)記樣品的取樣時(shí)間分別設(shè)置為第4天和第11天。

圖1 葡萄糖總量30 mg產(chǎn)氣情況

圖2 葡萄糖總量60 mg產(chǎn)氣情況

標(biāo)記后的污泥樣品經(jīng)超高速離心分層以后，利用定量PCR檢測每層的16S rDNA基因含量。獲得16S rDNA基因豐度在不同浮力密度中的分布規(guī)律，如圖3和圖4所示。由圖可知，在輕密度層1.69～1.71 g·mL-1的范圍內(nèi)，所有樣品均出現(xiàn)最高豐度，這表明污泥樣品12C-DNA在1.70 g·m-1左右的密度層被富集。在重密度層1.72～1.74 g·mL-1的范圍內(nèi)，投加有30 mg13C-葡萄糖的污泥樣品僅檢測到較低的16S rDNA基因拷貝數(shù)，表明該條件下13C-DNA富集程度不高。投加有60 mg13C-葡萄糖的樣品13C-DNA豐度明顯提高，兩個(gè)平行樣品的豐度分別達(dá)到了10.41%和6.05%，而12C-葡萄糖對(duì)照樣品中的豐度僅為1.0%，這表明60 mg的13C-葡萄糖可以富集到更多的13C-DNA，功能菌能被有效標(biāo)記。但圖3和圖4也顯示，在1.72～1.74 g·mL-1前后的密度層中也能檢測到一定數(shù)量的13C-DNA。因此，為了為提高重密度層中13C-DNA的豐度，減少非目標(biāo)微生物的影響，后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)進(jìn)一步加大底物投加量。

圖3 葡萄糖總量30 mg，培養(yǎng)時(shí)間4 d對(duì)DNA-SIP標(biāo)記效果的影響

圖4 葡萄糖總量60 mg，培養(yǎng)時(shí)間11 d對(duì)DNA-SIP標(biāo)記效果的影響

2.3 污泥固含量優(yōu)化

污泥固含量對(duì)DNA-SIP標(biāo)記效果的影響如圖5～圖8所示。由圖可知：在1.72～1.74 g·mL-1的密度范圍內(nèi)，污泥固含量為0.1%，0.2%和0.4%(w/w)的所有樣品的13C-DNA拷貝數(shù)明顯高于2.1%的樣品。

當(dāng)?shù)孜锿都恿繛?6.6 mg時(shí)(標(biāo)記8天的樣品)，13C-DNA主要存在于1.72 g·mL-1左右的密度層，且不同污泥固含量樣品的13C-DNA豐度差異較大。污泥固含量為0.1%，0.2%，0.4%和2.1%(w/w)的樣品中，13C-DNA豐度分別約為16.3%，10%，10%和8.2%。這表示在該底物濃度下污泥固含量越低，13C-DNA富集程度越高。而在更“重”的密度層1.74 g·mL-1附近，各污泥固含量的13C-DNA豐度均低于5%。

當(dāng)?shù)孜锿都恿繛?00 mg時(shí)(標(biāo)記12 d的樣品)，與第8天的標(biāo)記樣品相比，所有污泥樣品在1.72～1.74 g·mL-1密度層的13C-DNA豐度均有明顯提升。尤其在1.74 g·mL-1的密度層，除污泥固含量為2.1%的樣品外，其它樣品的13C-DNA豐度均從第8天的低于5%提升至15%左右。上述結(jié)果表明：當(dāng)?shù)孜锿都恿繌?6.6 mg增至100 mg時(shí)，可有效提高13C-DNA在重密度層的豐度，顯示出更好的標(biāo)記效果。此外，2.1%固含量的污泥樣品中的13C-DNA拷貝數(shù)在1.72～1.74 g·mL-1密度層仍然最低，表明即使投加更高濃度的底物，相對(duì)較低的污泥固含量仍更有利于13C-DNA的富集。但在污泥固含量為0.4%，0.2%，0.1%的樣品中，13C-DNA在1.74 g·mL-1密度層的豐度并未隨著污泥固含量的減少而增大(分別為16.3%，14.2%和14%)。這可能是底物投加量已超過污泥中微生物的代謝水平，大部分功能微生物已被標(biāo)記，若繼續(xù)增加底物投加量難以提高樣品的標(biāo)記效果。

圖5 污泥固含量2.1%(w/w)對(duì)DNA-SIP標(biāo)記效果的影響

圖6 污泥固含量0.4%(w/w)對(duì)DNA-SIP標(biāo)記效果的影響

圖7 污泥固含量0.2%(w/w)對(duì)DNA-SIP標(biāo)記效果的影響

圖8 污泥固含量0.1%(w/w)對(duì)DNA-SIP標(biāo)記效果的影響

3 討論

DNA-SIP具有鑒定不同環(huán)境中“真正”功能微生物的優(yōu)勢。合適的標(biāo)記及離心條件可以避免底物的二級(jí)利用，確保DNA的標(biāo)記及富集效果，是決定該技術(shù)成功的關(guān)鍵。但標(biāo)記效果受到多因素的影響：如環(huán)境樣品性質(zhì)、微生物種類、底物結(jié)構(gòu)、標(biāo)記時(shí)間、離心轉(zhuǎn)速及時(shí)間等，DNA-SIP的培養(yǎng)條件及離心條件難以標(biāo)準(zhǔn)化[6]。鑒于利用DNA-SIP識(shí)別厭氧消化功能微生物的研究相對(duì)較少，本研究考察了不同條件(離心轉(zhuǎn)速、底物投加量和污泥固含量)對(duì)厭氧污泥中葡萄糖利用菌的標(biāo)記效果的影響。

利用超高速密度梯度離心技術(shù)可有效地將環(huán)境總DNA中的12C-DNA與13C-DNA有效分離。本研究發(fā)現(xiàn)45400 rpm的轉(zhuǎn)速比 50300 rpm有更好的13C-DNA富集效果。據(jù)報(bào)道，DNA在CsCl介質(zhì)中的浮力密度與微生物的GC含量成正比[7]。但無論哪種轉(zhuǎn)速條件，重浮力密度層仍然同時(shí)含有12C-DNA與13C-DNA。Lueders[8]等發(fā)現(xiàn)，即使采用純菌的12C-DNA進(jìn)行超高速離心，重密度層中仍能檢測到0.7%的12C-DNA。因此，這說明目標(biāo)微生物很難100%被標(biāo)記，DNA-SIP實(shí)驗(yàn)必須設(shè)計(jì)12C底物的對(duì)照樣品。

研究表明，當(dāng)13C-DNA豐度接近20%時(shí)，更容易從環(huán)境樣品總DNA中分離出13C-DNA[9]。而13C-DNA的生成伴隨著微生物細(xì)胞對(duì)底物的同化利用，這表明13C-DNA豐度與底物投加量和微生物種群數(shù)量(本文為污泥固含量)存在直接聯(lián)系。底物投加量優(yōu)化結(jié)果顯示：在1.72～1.74 g·mL-1的密度范圍內(nèi)，投加30 mg13C-葡萄糖的污泥樣品的13C-DNA豐度較低。目前尚無標(biāo)準(zhǔn)方法來確定底物投加量，但底物濃度過低難以標(biāo)記到目標(biāo)微生物，因?yàn)閮H有1/3的底物被微生物用于合成自身物質(zhì)[10]。此外，加入體系的底物被微生物同化之前會(huì)有一個(gè)稀釋過程，這使得微生物會(huì)暫時(shí)利用其他碳源或中間代謝產(chǎn)物，這一特性降低了13C-DNA的比例，進(jìn)一步增加了計(jì)算底物投加量的難度[9]。雖然分批投加60 mg13C-葡萄糖可以將13C-DNA豐度提高到10.41%，但仍含有較多的非目標(biāo)微生物。因此，在后續(xù)考察污泥固含量的研究中，將13C-葡萄糖投加量提高到了100 mg，此時(shí)污泥中13C-DNA豐度最高可達(dá)16.3%。上述結(jié)果表明，高的底物投加量有助于提高13C-DNA豐度。但底物投加量過高，一方面會(huì)增加DNA-SIP的成本；另一方面會(huì)使樣品脫離原始狀態(tài)，群落代謝過程受到影響，產(chǎn)生微生物富集偏差，不符合DNA-SIP原位鑒定的宗旨。因此，在滿足13C-DNA的標(biāo)記效果及分離效果的基礎(chǔ)上，采用最少的13C底物是理想的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)[11]。污泥固含量研究結(jié)果顯示：當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí)(不高于污泥最高代謝水平)，污泥固含量越低，13C-DNA富集程度越高。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)底物量與微生物種群數(shù)量需要有合適的比例，才能獲得最高的標(biāo)記13C-DNA。不同研究報(bào)道中的微生物菌群生態(tài)位、生理代謝差異極大，因此，非常有必要對(duì)這兩個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。

4 結(jié)論

選擇合適的標(biāo)記及離心條件以獲得足夠的13C-DNA，是利用DNA-SIP技術(shù)成功富集功能微生物的關(guān)鍵。本研究以13C-葡萄糖為底物，選取離心轉(zhuǎn)速，底物投加量和污泥固含量3個(gè)重要因素，考察了它們對(duì)厭氧消化污泥中葡萄糖利用菌的DNA-SIP標(biāo)記效果的影響。結(jié)果顯示，相對(duì)低的轉(zhuǎn)速、高底物投加量及低污泥固含量可以獲得較高的13C-DNA豐度。但底物量不能一味增加，需同時(shí)考慮微生物的代謝水平、與環(huán)境條件的一致性等因素，在盡量減少成本的基礎(chǔ)上以避免微生物的富集偏差。