孫強(qiáng)，李小芳，馬祖兵，鄭宇，趙甜甜，宋佳文，龍家英

甘草為我國最常用的中藥材之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，享有“十方九草”的美稱，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳及調(diào)和諸藥等功效[1]。甘草黃酮是從甘草提取物中得到的一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗炎[2]、抗腫瘤[3-4]、美白祛斑[5]、抗氧化[6]以及保肝護(hù)肝[7]等多種藥理作用，因此對(duì)其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)極具意義。雖然甘草黃酮的藥理作用比較廣泛，但水溶性較差，導(dǎo)致其在體內(nèi)的生物利用度不高，進(jìn)而限制了臨床的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用[8]。

固體分散（Solid dispersion，SD）技術(shù)，是一種將難溶性藥物以分子、無定形或微晶狀態(tài)高度分散于載體材料中的新型制劑技術(shù)，其主要特點(diǎn)是藥物在載體中高度分散，因而在改善難溶性藥物成分的溶解度和溶出速率以及提高藥物的穩(wěn)定性方面都體現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[9-10]。因此，為了提高甘草黃酮在水中的溶解度和溶出速率，本實(shí)驗(yàn)采用溶劑-熔融法制備聚乙烯吡咯烷酮K30固體分散體（PVP K30-SD），考察其體外釋藥性能，并借助差式掃描量熱儀（DSC）和傅里葉紅外光譜（ FT-IR）對(duì)其進(jìn)行性質(zhì)表征，為進(jìn)一步制備理想的甘草黃酮制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料

DFD-700型恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司），UV-6100型紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司），F(xiàn)A224型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），RC-3型溶出度測(cè)試儀（山東博科科學(xué)儀器有限公司），KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），四川優(yōu)普超純水機(jī)（四川優(yōu)普超純技術(shù)有限公司），DZF-6050型真空干燥器（上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），HSC-1型差示掃描量熱儀（北京恒久科學(xué)儀器廠）。

甘草苷對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-16032801，純度98%）；甘草黃酮原料藥（西安小草植物科技有限公司，批號(hào)XC20160508，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)70.0%）；膠態(tài)二氧化硅（上海風(fēng)泓藥用輔料技術(shù)有限公司，藥用級(jí)）；泊洛沙姆188（F188，德國BSAF公司）；聚乙烯吡咯烷酮K30（PVPK30，成都市科龍化工試劑廠）、聚乙二醇4000（PEG4000，成都市科龍化工試劑廠）；聚乙二醇6000（PEG6000，廣東汕頭市西隴化工廠）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含有量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液及供試品溶液的制備 精密稱定甘草苷對(duì)照品適量，加入適量70%乙醇于10 mL 容量瓶中使溶解，定容至10 mL，搖勻，得202.0 mg﹒L-1甘草苷對(duì)照品溶液。稱取固體分散體0.5 g，加入適量70%乙醇于25 mL 容量瓶中，超聲20 min使溶解，定容至25 mL，得供試品溶液。

2.1.2 檢測(cè)波長的確定 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品及供試品溶液適量，加入10% KOH溶液 0.5 mL中，靜置顯色6 min后加70%乙醇定容至10 mL，搖勻，于200～400 nm進(jìn)行波長掃描。結(jié)果顯示在波長為335 nm處有最大吸收，故選擇其作為最大吸收波長。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[11]分別精密吸取202.0 mg﹒L-1對(duì)照品溶液 0. 3，0. 4，0. 5，0.6，0.7，0.8 mL于10 mL容量瓶中，補(bǔ)加70%乙醇至1 mL，加入10% KOH溶液 0.5 mL中，靜置顯色6 min后加70%乙醇定容至10 mL，以相應(yīng)的溶劑為空白，于波長335 nm 處測(cè)定吸光度A。以甘草苷對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y = 0.0355X+ 0.0449（R2 = 0.9943），結(jié)果表明在6.06 ～16.16 mg﹒L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 溶劑的選擇

分別精密稱取20 mg甘草黃酮LF、PVPK30各3份，分別溶于2 mL甲醇、丙酮、無水乙醇中，充分振搖使其充分溶解，觀察LF與載體PVP K30的溶解情況，結(jié)果分別見表1和表2。

表1 LF原料藥在溶劑中的溶解狀況

表2 PVP K30載體在溶劑中的溶解狀況

由表可知，甘草黃酮在甲醇中僅有少數(shù)未溶解，在丙酮和無水乙醇中完全溶解，在甲醇中的溶解度不如丙酮和無水乙醇；PVP K30在甲醇和無水乙醇中幾乎完全溶解，在丙酮中出現(xiàn)白色沉淀，因此，考慮到丙酮的揮發(fā)性及其毒性，本實(shí)驗(yàn)選擇無水乙醇為溶劑進(jìn)行制備。

2.3 甘草黃酮固體分散體的制備

2.3.1 溶劑法 稱取處方量（1:3）的甘草黃酮原料藥LF與載體適量，分別溶解于適量無水乙醇中，將原料藥溶液緩慢加入載體溶液，充分?jǐn)嚢?，超?0 min使混勻。置于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中除去大部分溶劑，轉(zhuǎn)移至50 ℃恒溫水浴鍋中，繼續(xù)加熱至完全除去無水乙醇，所得產(chǎn)物在60 ℃條件下干燥12 h后，于干燥箱中平衡48 h，研磨，過80目篩，備用。

2.3.2 溶劑-熔融法 稱取處方量（1:3）的甘草黃酮原料藥LF與載體適量，將甘草黃酮溶解于適量無水乙醇中，充分?jǐn)嚢韬缶徛尤胫烈讶廴诘妮d體中，混合均勻，于80 ℃恒溫水浴鍋中繼續(xù)攪拌加熱至完全除去無水乙醇，迅速轉(zhuǎn)移至-20℃冰箱中保存12 h后，轉(zhuǎn)移至干燥箱中平衡48 h，研磨，過80目篩，備用。

采用上述兩種方法分別制備甘草黃酮固體分散體，各有利弊。采用溶劑法制備時(shí)，藥物在轉(zhuǎn)移過程中損失量大，工藝相對(duì)復(fù)雜，操作不便，同時(shí)也可能導(dǎo)致藥物的重結(jié)晶，從而降低藥物的分散性，影響主藥的溶解度。溶劑-熔融法方法簡(jiǎn)便，易于制備和操作。經(jīng)綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇溶劑-熔融法制備固體分散體。

2.4 溶出介質(zhì)的選擇

按《中國藥典》2015年版（第四部） 通則0931項(xiàng)下第二法（槳法）測(cè)定LF以及固體分散體的累積溶出度，分別以900 mL磷酸鹽緩沖液（PH6.8和PH7.4）為溶出介質(zhì)，設(shè)定轉(zhuǎn)速為（75±1）r﹒min-1，水浴溫度（37±0.5）℃。分別精密稱取原料藥LF和固體分散體適量，均勻分散于溶出介質(zhì)中，粉末剛接觸溶出介質(zhì)時(shí)開始計(jì)時(shí)，分別于10 、20 、30 、40、50 、60 、120 min時(shí)取樣4 mL，補(bǔ)充同溫同體積介質(zhì)，0.45 μm微孔濾膜過濾，續(xù)濾液按 “2.1.3” 項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算累積溶出度，結(jié)果見圖1。由圖可知，在PH7.4磷酸鹽緩沖液中，30 min時(shí)固體分散體的溶出度就達(dá)到了83.4%，而在PH6.8的磷酸鹽緩沖液，相同時(shí)間固體分散體的溶出度僅為64.2%，原因可能是甘草黃酮為弱酸性物質(zhì)，在堿性溶液中能更快更好的溶出，故將溶出介質(zhì)確定為PH 7.4的磷酸鹽緩沖液。

圖1 不同溶出介質(zhì)中LF-PVPK30固體分散體（1:5）的溶出曲線

2.5 載體種類的選擇

分別以PEG 4000、PEG 6000、F188、膠態(tài)二氧化硅以及PVP K30為載體，采用溶劑-熔融法以藥載比為1∶3制備甘草黃酮固體分散體。結(jié)果顯示，LF只在PVP K30中分散成型，而在PEG4000、PEG6000、F 188、膠態(tài)SiO2中無法分散，固體分散體難以制備成功。因此本實(shí)驗(yàn)選擇PVP K30為載體制備固體分散體。

2.6 藥物-載體比例的選擇

按“2.3.2”項(xiàng)下方法，分別制備藥載比為1:2、1:3、1:4、1:5、1:6的LF-PVPK30-SD，同時(shí)按“2.4”項(xiàng)下建立的累積溶出度測(cè)定方法，考察經(jīng)不同載體比例制備的LF-PVPK30-SD及其LF原料藥的體外釋藥行為，測(cè)定累積溶出度，繪制體外釋藥曲線，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，隨著藥物-載體質(zhì)量比例的增加，累積溶出度總體呈增大趨勢(shì)，在相同時(shí)間內(nèi)，當(dāng)藥物-載體質(zhì)量比例為1:5時(shí)，其體外累積溶出度顯著高于LF原料藥及其他比例固體分散體。因此，LFPVPK30固體分散體以藥載比1:5為最佳。

圖2 不同藥載比LF-PVPK30-SD的溶出曲線

2.7 固體分散體的物相表征鑒別

2.7.1 差示掃描量熱法（DSC） 采用DSC對(duì)原料藥LF、PVP K30、LF-PVPK30-SD及物理混合物進(jìn)行分析，以空鋁坩堝為參考池，升溫速度為10 ℃﹒min-1，升溫范圍為50～650 ℃，樣品量約10 mg。結(jié)果見圖3。由圖可知，甘草黃酮原料藥LF在478.9 ℃處出現(xiàn)明顯熔融吸熱峰，PVP K30在462.2 ℃存在放熱峰，且在524.8 ℃ 前后存在一段較寬的吸熱峰，為結(jié)晶峰；LF-PVPK30物理混合物在478.9 ℃附近出現(xiàn)與原料藥相關(guān)吸熱峰的同時(shí)，也于462.2 ℃附近出現(xiàn)了與載體PVPK30相似的特征峰；說明LF原料藥與PVPK30載體之間未發(fā)生本質(zhì)上的作用，原料藥的晶型未發(fā)生改變；而LF-PVPK30-SD中未出現(xiàn)LF原料藥的吸收峰，表明LF原料藥可能以無定型狀態(tài)分散于PVPK30載體中。

圖3 PVPK30（A），LF-PVPK30-SD （ B ） ，LF（C）以及物理混合物（D）的DSC

2.7.2 傅里葉紅外光譜分析（ FT-IR） 分別對(duì)甘草黃酮原料藥LF（E）、PVPK30（F）、LF-PVPK30-SD（G）及物理混合物（ H ）進(jìn)行紅外光譜分析，以KBr進(jìn)行壓片，掃描范圍 4000 ～ 400 cm-1，并以透光率T為縱坐標(biāo)，波數(shù)為橫坐標(biāo)繪制紅外光譜圖，結(jié)果見圖4。由圖可知，甘草黃酮原料藥的光譜曲線在波數(shù)為2854 cm-1處產(chǎn)生飽和碳鏈甲基、亞甲基的伸縮振動(dòng)，在1608 cm-1處出現(xiàn)C=C發(fā)生偏移的特征吸收峰，醚鍵的吸收峰出現(xiàn)于波數(shù)1274 cm-1處，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]。PVPK30分別在波數(shù)為3453 cm-1以及1662cm-1處出現(xiàn)-OH和C=0的伸縮振動(dòng)；物理混合物中，原料藥LF及其PVPK30的特征峰仍清晰可見，表明其FT-IR圖為二者的簡(jiǎn)單疊加，但可能受到互相的干擾，特征吸收峰發(fā)生了微小的偏移；在LFPVPK30-SD中，原料藥在1274 cm-1處的特征峰遷移至1289 cm-1處，且吸收峰強(qiáng)度變大。由此推斷，LFPVPK30-SD中LF原料藥與PVPK30分子之間可能發(fā)生了相互作用，形成氫鍵。

圖4 LF（E），PVPK30（F），LF-PVPK30-SD（G）及物理混合物 （H）的FT-IR

3 討論

本研究考慮從PEG 4000、PEG 6000、F188、膠態(tài)SiO2、PVP K30五種載體中篩選出制備甘草黃酮固體分散體的最佳載體，結(jié)果甘草黃酮僅易在PVP K30中高度分散，而藥物在其余四種載體中始終難以分散，所制備的固體分散物在干燥箱中無法干燥成固體，從而難以制備成型。在制備固體分散體時(shí)，采用溶劑法制備，由于藥物量少，藥物在轉(zhuǎn)移過程中損失量大，且有機(jī)溶劑用量大而難以除盡，故選擇溶劑-熔融法進(jìn)行制備。

體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以 PVP K30 為載體，藥載比為1:5制備的固體分散體的體外溶出度較原料藥顯著提高，分析甘草黃酮在固體分散體中溶解度增加的原因可能為PVPK30為無定型的高分子化合物，在溶液中以網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)存在，而藥物最初是均勻分散于無水乙醇中，遇到PVPK30的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)便較易進(jìn)入，使藥物形成具有較高能量的非結(jié)晶型狀態(tài)，進(jìn)而增加了藥物的溶出速率。另外，PVPK30不僅可以使藥物在其中呈高度分散狀態(tài)存在，而且對(duì)藥物具有良好的潤濕性。最后，PVP k30 具有一定的抑晶作用，可防止固體分散體在存放過程中出現(xiàn)再結(jié)晶現(xiàn)象，從而保持藥物較高的溶出度，并且隨著PVPK30 用量的增大，更多藥物分子與 PVP K30結(jié)合，使非結(jié)合型的藥物分子減少，藥物溶出速率增大[13]。本文將甘草黃酮制備成固體分散體，為甘草黃酮的臨床開發(fā)和應(yīng)用提供了一定的參考意義。