王思寧 趙韓生 高志民

(國際竹藤中心 北京 100102 )

棕櫚藤是世界上最重要的非木材森林植物資源之一，屬于棕櫚科(Arecaceae)，是自然進(jìn)化中出現(xiàn)的攀爬植物的代表。近年來的研究表明，在棕櫚科省藤族省藤亞科中棕櫚藤植物可分為11屬，共有631種，其中省藤屬(NCBITaxonID:4711)和黃藤屬(NCBITaxonID:93268)種類最多，分別占藤種的約65%和20%。這2個(gè)屬也是最重要的棕櫚藤藤材來源，為工業(yè)生產(chǎn)提供了95%以上的藤條。全球有超過500萬人在經(jīng)濟(jì)上依賴棕櫚藤，藤工業(yè)產(chǎn)值每年約70億美元，包括國內(nèi)工業(yè)生產(chǎn)、國際貿(mào)易，以及藤編織的籃子、座椅和家具等。同時(shí)，對棕櫚藤遺傳育種的關(guān)注在持續(xù)增長，并且預(yù)計(jì)將來在幾年內(nèi)棕櫚藤的種植面積將逐漸超過天然棕櫚藤面積。

單葉省藤(Calamussimplicifolius)(NCBITaxonID:746888)是中國原產(chǎn)、種植面積最廣的藤種之一，莖長約50m，直徑約15mm。單葉省藤是海南島特有的棕櫚藤，可生產(chǎn)高品質(zhì)、中等直徑的藤條，用于捆扎和編織。黃藤(Daemonoropsjenkinsiana)(NCBITaxonID:1510057)，是常綠攀援棕櫚藤的代表，自然生長在海拔1000m以下的低地雨林，分布于孟加拉國、不丹、柬埔寨、印度、老撾、緬甸、尼泊爾、泰國、越南和中國的東南部。黃藤叢生生長，莖可達(dá)50m, 節(jié)間長40cm，直徑30mm。這2種產(chǎn)值最高的藤種現(xiàn)種植面積超過1000hm2，栽培在中國小于北緯23°30′的地區(qū)，例如海南島、廣東、廣西、云南、福建等華南地區(qū)。

單葉省藤和黃藤由于其藤條韌性強(qiáng)和耐久度好而具有廣泛的用途和巨大的開發(fā)潛力。需要應(yīng)用分子育種技術(shù)開展棕櫚藤育種，來滿足對棕櫚藤質(zhì)量和數(shù)量不斷增長的需求。然而，棕櫚藤遺傳背景不清，嚴(yán)重阻礙了對其分子生物學(xué)的研究和實(shí)際生產(chǎn)的應(yīng)用，更影響了相關(guān)物種之間比較基因組分析的深入開展。因此，我們使用最新的高通量測序技術(shù)，完成了單葉省藤和黃藤的測序和染色體水平基因組組裝。隨著這2個(gè)棕櫚藤基因組的完成，使許多比較基因組分析和其他下游分析成為可能，包括分子標(biāo)記的開發(fā)、功能基因的鑒定和分子輔助育種等。此外，高質(zhì)量的基因組將有助于對棕櫚藤生物性狀進(jìn)行基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析。本文選取并鑒定了棕櫚藤中改良藤條性能的一些重要候選基因——木質(zhì)素生物合成基因家族，為今后利用木質(zhì)素生物合成基因來改良藤條的品質(zhì)以及研究物種多樣性奠定了基礎(chǔ)。

1 材料方法與數(shù)據(jù)處理

1.1 DNA分離、文庫構(gòu)建和高通量測序

單葉省藤和黃藤材料取自中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所(北緯23°11′29″，東經(jīng)113°22′40″，海拔87m)，于2015年春季采集處于營養(yǎng)生長階段的幼嫩葉片組織用于總DNA提取。使用DNeasyPlantMiniKits(Qiagen)分離和提取總DNA。根據(jù)高分子量核DNA分離法純化基因組DNA獲得多個(gè)DNA文庫，并在IlluminaHiSeq4000和PacBioSequel平臺上進(jìn)行測序(原文表1)。即：在基于Illumina的方法上構(gòu)建了3個(gè)不同插入片段大小的文庫(270bp、500bp和800bp)，用于PE測序，以及4個(gè)不同插入片段大小的文庫(2kb、5kb、10kb和20kb)用于MP測序。另外，按照PacBio方法，構(gòu)建了5個(gè)插入片段大小為20kb的PacBioSequel文庫，進(jìn)行測序。通過對測序數(shù)據(jù)清理和預(yù)處理，最終得到約494.08Gb的單葉省藤高質(zhì)量數(shù)據(jù)(322.3GbPEreads,93.4GbMPreads,78.38GbPacBiodata)，覆蓋率為單葉省藤基因組的252倍， 約426.17Gb的黃藤高質(zhì)量數(shù)據(jù)(244.58GbPEreads,103.21GbMPreads,and78.38GbPacBiodata)，覆蓋率為黃藤基因組的266倍。

作為與Illumina和PacBio文庫構(gòu)建測序，進(jìn)行了另一平行分析，即使用相同組織材料為單葉省藤和黃藤建立了2個(gè)高通量測序文庫。使用MboI限制性內(nèi)切酶在甲醛固定后消化DNA，然后用生物素標(biāo)記5個(gè)殘基。在原位連接平末端片段后，對分離出的DNA進(jìn)行反向交聯(lián)、純化和過濾，得到包含生物素標(biāo)記的片段。隨后，按此順序進(jìn)行DNA片段端修復(fù)、適配體連接和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。然后，根據(jù)BGISEQ-500的使用說明，對其進(jìn)行100PE的測序。在分別獲得了大約148Gb和154Gb的原始數(shù)據(jù)后，經(jīng)過低質(zhì)量數(shù)據(jù)的過濾和其他預(yù)處理，最終獲得約6.7Gb和13.1Gb的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，并使用HiC-Pro(version2.8.0devel)軟件分別對單葉省藤和黃藤進(jìn)行了評價(jià)和分析(原文表1)。

1.2 基因組調(diào)查

對給定物種基因組大小、雜合性等基因組特征的了解解，將有助于開發(fā)一套適合的測序方案和組裝策略。因此，本研究采用4種獨(dú)立的方法來估算基因組大小，即KmerSpectrumPlot.plinALLPATHS-LG(版本r52488)、GCE(GenomeCharacteristicsEstimation,released7Jan.2015)、JELLYFISH(版本2.0)和流式細(xì)胞術(shù)(原文表S1、S2，圖S1、S2)。在調(diào)研中，我們測序獲得單葉省藤約為98Gb，黃藤約為60Gb的二代原始測序數(shù)據(jù)作為調(diào)研數(shù)據(jù)。經(jīng)過數(shù)據(jù)預(yù)處理和組裝，結(jié)果顯示(原文表S1)，最終預(yù)測單葉省藤和黃藤基因組大小分別約為1.98Gb和1.61Gb，相關(guān)雜合度分別為1.32%～1.52%和1.19%～1.31%。因此，基因組分析結(jié)果表明，這2種棕櫚藤的基因組比較適用于Illumina和PacBio測序數(shù)據(jù)的聯(lián)合組裝。

1.3 利用Illumina和PacBio高通量測序數(shù)據(jù)聯(lián)合組裝基因組

在Illumina數(shù)據(jù)的預(yù)處理過程中，過濾掉了低質(zhì)量的讀長和接頭序列，獲得單葉省藤和黃藤的有效數(shù)據(jù)分別為416Gb和348Gb。對于PacBio數(shù)據(jù)，使用了MECAT(發(fā)布于2017年6月27日)軟件，得到單葉省藤和黃藤分別為52Gb和32Gb的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。隨后，使用FALCON(版本0.3)軟件進(jìn)行第1次contig組裝。如原文表S3所示，使用不同參數(shù)為單葉省藤基因組生成了2個(gè)組裝結(jié)果，一個(gè)ContigN50為67.2kb，基因組約為1.59Gb(約為預(yù)測基因組大小的80%)，另一個(gè)ContigN50為66.7kb，基因組約為1.53Gb(約為預(yù)測基因組大小的77%)。此外，獲得一個(gè)黃藤組裝結(jié)果ContigN50為81.5kb，基因組約為1.27Gb(約為預(yù)測基因組大小的79%)。通過以上結(jié)果顯示，僅用三代數(shù)據(jù)和MECAT軟件不能獲得對2種高質(zhì)量棕櫚藤基因組，可能是由于2種棕櫚藤的高雜度(單葉省藤1.32%～1.52%，黃藤1.19%～1.31%)、高比例重復(fù)序列(單葉省藤為54.15%，黃藤為70%；有關(guān)詳細(xì)信息請參閱原文中的后續(xù)分析)和使用了測序深度不足的三代數(shù)據(jù)(PacBio數(shù)據(jù)經(jīng)錯(cuò)誤校正后分別為26×和20×)造成的。因此結(jié)合以上結(jié)果，我們嘗試?yán)肐llumina和PacBio測序數(shù)據(jù)，對單葉省藤和黃藤進(jìn)行了聯(lián)合基因組組裝。首先，利用Platanus(版本1.2.4，是一種用于高雜合數(shù)據(jù)的全新基因組匯編器，可以通過構(gòu)建具有自動(dòng)優(yōu)化的k-mer大小的DeBruijn圖)將PE片段整合到contig序列中。其次，用DBG2OLC(2015年7月11日發(fā)布，參照以下參數(shù)：DBG2OLCContigscontig.faLD0K17KmerCovTh4MinOverlap25AdaptiveTh0.007RemoveChimera1fscaffold.fa.) 矯正PacBio測序數(shù)據(jù)并組裝scaffolds，以分別獲得單葉省藤和黃藤約1.92Gb和1.56Gb的初始組裝結(jié)果。再次，在進(jìn)行SSPACE分析前，參照DBG2OLC(原文表S4)進(jìn)行了平行分析，這一步驟有助于提高基因組組裝的質(zhì)量，減少SSPACE過程中的錯(cuò)誤。然后，使用SSPACE(版本3.0)和MP大片度測序數(shù)據(jù)延長scaffolds，并通過使用GapCloser(版本1.12)和PBJelly(2015年8月24日發(fā)布) 進(jìn)行補(bǔ)洞。最終，獲得了1.96Gb的單葉省藤組裝數(shù)據(jù)，包含5116個(gè)Contigs，ContigN50長度為107kb，ScaffoldN50長度為803kb，同時(shí)獲得了一個(gè)1.60Gb的黃藤組裝數(shù)據(jù)，包含ContigN50和ScaffoldN50長度分別為108kb和784kb(原文表2)。

隨后，通過3D-DNA分析流程(版本170123)對有效的高通量測序數(shù)據(jù)與上述裝配數(shù)據(jù)一起進(jìn)行處理，得到了一個(gè)合理的連接模式，準(zhǔn)確的染色體組裝結(jié)果。如原文圖2所示，使用Juicebox(版本1.5.2)顯示連接模式圖譜。原文表S5展示了單葉省藤12個(gè)最長的染色體水平Scaffold和黃藤13個(gè)最長的染色體水平Scaffold。預(yù)測染色體總長度分別占單葉省藤和黃藤基因組總長度的92.08%和92.01%，ScaffoldN50分別為169Mb和119Mb。

1.4 基因組評估

采用3種獨(dú)立的方法評估了單葉省藤和黃藤基因組組裝的準(zhǔn)確性和完整性。首先，對基因組中不確定堿基的百分比(Ns)和鳥嘌呤、胞嘧啶含量(GC)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示在每個(gè)基因組中低豐度的Ns(單葉省藤約為0.6%和黃藤約為0.7%)和總GC含量(單葉省藤為41.78%和黃藤為41.07%)與相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相似(單葉省藤為41.68%和黃藤為41.89%)。此外，利用BasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST)-like比對工具(版本1.0)(默認(rèn)參數(shù))進(jìn)行RNA測序(RNAseq)數(shù)據(jù)所組裝出來的功能基因序列與組裝得到的基因組序列比對，結(jié)果顯示，在一個(gè)大片段上90%以上的序列可以與基因組的組裝序列匹配(單葉省藤為92.89%和黃藤為81.81%)(原文表S6)。最后，利用BUSCO(版本3.0)對2種棕櫚藤基因組的完整性進(jìn)行了評估，這是一種從進(jìn)化的角度定量對單拷貝直系同源基因含量進(jìn)行計(jì)算，以評估基因組完整性的方法。BUSCO結(jié)果顯示，在單葉省藤基因組組裝結(jié)果中檢測到保守性為96.4%的BUSCO蛋白(基于embryophytaodb9庫文件)(包括3.8%的BUSCO蛋白片段)。同時(shí)，在黃藤基因組組裝結(jié)果中檢測到保守性為87.3%的BUSCO蛋白(包括4.0%的BUSCO蛋白片段)(原文表S7)。

1.5 重復(fù)注釋

本研究在蛋白質(zhì)編碼基因模型預(yù)測之前，完成了單葉省藤和黃藤基因組中轉(zhuǎn)座因子(TEs)和串聯(lián)重復(fù)序列的鑒定。采用2種獨(dú)立的方法來預(yù)測序列重復(fù)：同源注釋和從頭預(yù)測(denovo)法。同源注釋結(jié)果顯示，利用RepeatMasker(版本4.0.5)和RepeatProteinMasker(版本4.0.5)對Repbase文庫(發(fā)布于2017年12月01日)進(jìn)行搜索，查找轉(zhuǎn)座因子序列。從頭預(yù)測結(jié)果顯示，利用Repeat-Modeler(版本1.0.8)和LTRFINDER方法在去除污染和多拷貝基因后，可以構(gòu)建一個(gè)重復(fù)序列文庫。然后，使用RepeatMasker對基因組序列進(jìn)行了分類，并與重復(fù)序列文庫進(jìn)行了對比。此外，串聯(lián)重復(fù)序列由TandemRepeatFinder(版本4.09)識別，其參數(shù)為：Match=2,Mismatch=7,Delta=7,PM=80,PI=10,Minscore=50andMaxPeriod=2000。最終結(jié)果表明，長末端重復(fù)序列(longterminalrepeat,LTR)是最豐富的重復(fù)序列類型，2種非LTR逆轉(zhuǎn)座子(短穿插核元件和長穿插核元件)在2種棕櫚藤基因組中占比例最少(原文表S8)。TEs在單葉省藤和黃藤基因組中分別占54.15%和70%。TEs序列分歧度結(jié)果表明，從頭預(yù)測的重復(fù)序列比Repbase預(yù)測的重復(fù)序列更多(原文圖3)。

1.6 RNA樣本收集、文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組組裝

分別選取單葉省藤和黃藤3個(gè)不同發(fā)育階段的纖鞭樣本，每個(gè)樣本3個(gè)生物學(xué)重復(fù)(原文表S9)。為保證與2種棕櫚藤基因組研究的一致性，RNA取樣的位置和DNA取樣的位置一致。利用RNA提取試劑盒(TaKaRa, 日本)提取各樣本的總RNA，并使用NanoDrop2000分光光度計(jì)測定RNA的質(zhì)量和濃度。使用RecombinantDNaseI于37℃孵育30min去除殘余DNA，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega, 美國)合成cDNA第一條鏈，操作參照相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行。然后，使用BGISEQ-500平臺對文庫池中的短100PE片段測序。在對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，使用SOAPnuke(版本1.5.6)對匹配序列和低質(zhì)量的讀長序列進(jìn)行過濾，過濾參數(shù)為：-n0.001-l20-q0.4-q2。所有樣本均使用Trinity(版本2.0.6)按以下參數(shù)組裝：(1)grouppairsdistance500, (2)mincontiglength200, (3)minkmercov2, (4)minglue2, (5)bflyopts-V5, (6)edge-thr=0.1, (7)stderr,and(8)SSlibtypeRF。然后，對Trinity的輸出結(jié)果進(jìn)行聚類分析，使用TGI聚類工具(版本v2.0.6)生成一組非冗余集合，參數(shù)如下：(1)aminimumof95%identitybetweenthecontigs, (2)aminimumof35overlappingbases, (3)aminimumscoreof35,and(4)amaximumof20unmatchedoverhangingbasesatthesequenceends。最后，根據(jù)序列相似度將整合的轉(zhuǎn)錄本分為2類：成簇轉(zhuǎn)錄本和單一轉(zhuǎn)錄本。在成簇轉(zhuǎn)錄本中，轉(zhuǎn)錄本之間的序列相似區(qū)都超過了70%，由這些轉(zhuǎn)錄本被剪接成同源基因或旁系同源基因。此外，所有鑒定的基因?qū)⒈挥糜诤罄m(xù)的功能分析。

1.7 基因建模與預(yù)測

使用3種獨(dú)立的方法對完整的蛋白質(zhì)編碼基因模型進(jìn)行了綜合預(yù)測，包括從頭預(yù)測、同源蛋白預(yù)測和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)預(yù)測。使用AUGUSTUS(版本3.3)的默認(rèn)參數(shù)對重復(fù)區(qū)段進(jìn)行第一次注釋，該程序是一個(gè)基于自我調(diào)試模型的從頭預(yù)測軟件。通過進(jìn)行多次調(diào)試優(yōu)化數(shù)據(jù)，在單葉省藤和黃藤中分別預(yù)測獲得了85246和87613個(gè)基因模型。在基于同源性的預(yù)測中，以油棕(Elaeisguineensis)、長葉刺葵(Phoenixdactylifera)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、水稻(Oryzasativa)、粟(Setariaitalica)、高粱(Sorghumbicolor)和玉米(Zeamays)等7個(gè)物種作為參考基因組。從ENSEMBL數(shù)據(jù)庫下載它們的蛋白序列并應(yīng)用TBLASTN(版本2.2.26)對單葉省藤和黃藤中E-value不小于1e-5的組裝序列進(jìn)行比對。然后，由GeneWise(版本2.0)生成拼接結(jié)果。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)預(yù)測結(jié)果顯示，使用HISAT2(版本2.0.2)來識別外顯子-內(nèi)含子剪接位置，并進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組序列與基因組序列的比對。使用Cufflinks(版本2.2.1)分別在單葉省藤和黃藤中分別鑒定了56024和58134個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因模型(原文表S10)。最后，使用MAKER(版本2)整合了上述3個(gè)獨(dú)立預(yù)測的數(shù)據(jù)結(jié)果，隨著相同基因序列在單葉省藤和黃藤基因組中的出現(xiàn)，最終共分別鑒定出51235和53342個(gè)完整的蛋白編碼基因模型。

1.8 基因注釋和基因功能預(yù)測

使用2種獨(dú)立的方法對預(yù)測的基因集合進(jìn)行評估：基因功能評估和BUSCO完整性評估。在基因功能評估中，比照基因在近緣物種中同源蛋白序列和預(yù)測的蛋白集合，評估了預(yù)測的注釋和蛋白質(zhì)序列的一致性。參照NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(2018年3月13日發(fā)布)、SWISS-PROT(2018年1月1日發(fā)布)、GeneOntology(GO)(2013年10月30日發(fā)布)、KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes(KEGG)(數(shù)據(jù)集v81)和InterPro(數(shù)據(jù)集v.53)等5個(gè)權(quán)威蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋比對，結(jié)果表明(原文表S11)在單葉省藤和黃藤預(yù)測的基因模型中分別有5.34%和2.89%的基因?yàn)槲醋⑨尩幕颉４送?，BUSCO的評估顯示，在單葉省藤和黃藤中分別有88.7%和91.3%的保守BUSCO蛋白(embryophytaodb9)存在。在這些保守的BUSCO蛋白中，分別有76.2%和81.2%是完整的。此外，tRNA，rRNA，miRNA和snRNA4種非編碼RNA也被預(yù)測出來(原文表S12)。

1.9 基因家族結(jié)構(gòu)和棕櫚藤特異性基因家族分析

本研究中，通過逐一序列比對的方法來預(yù)測基因組水平的直系同源基因。這種方法因速度快而常用于處理大數(shù)據(jù)量分析。采用BLAST-based的OrthoMCL(版本2.0.9)來識別單葉省藤和黃藤中E-value≤1e-5且匹配系數(shù)≥80的同源基因。Markovchain聚類(默認(rèn)膨脹參數(shù))也共同用于與其他8個(gè)物種的全面BLASTP分析，包括無油樟(Amborellatrichopoda)、油棕、擬南芥、二穗短柄草、水稻、紫萍(Spirodelapolyrhiza)、長葉刺葵和高粱。在所有10個(gè)物種中鑒定得到30936個(gè)基因家族，其中單葉省藤和黃藤基因組中分別檢測到44700和44537個(gè)同源基因。10個(gè)物種中共有的基因家族近6132個(gè)(占19.8%)，在單葉省藤和黃藤基因組中別檢測到的2366和2707個(gè)特有的基因家族(原文圖4b)。此外，家族分析結(jié)果顯示其中637個(gè)基因家族是棕櫚藤所特有的。這些特異的基因家族大多富集在膜組成成分、轉(zhuǎn)錄因子活性相關(guān)的基因簇上(原文表S13)，且聚集在植物與病原體相互作用、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的KEGG通路中(原文表S14)。

1.10 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化和分化時(shí)間分析

利用獲得的962個(gè)種間高度保守的單拷貝直系同源基因，進(jìn)行棕櫚藤和其他物種的進(jìn)化關(guān)系分析。首先，通過MUSCLE(版本3.8.31)進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的多序列比對；在此基礎(chǔ)上，基于蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了DNA編碼序列(CDS)比對。隨后，將所有比對的CDS序列連接起來，使用Perl腳本為每個(gè)物種生成一個(gè)超級基因。然后，提取了每個(gè)密碼子第2個(gè)位置上(相位1)的核苷酸使用RAxML(版本8.2.3)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，模型為“GTRGAMMA”。結(jié)果表明，4種棕櫚科植物分布在一支上，由2個(gè)獨(dú)立的子分支組成，其中一個(gè)分支上包含單葉省藤和黃藤，另一個(gè)分支上包含油棕和長葉刺葵(原文圖4a)。

此外，使用了PAML(版本4.5)的MCMCTree程序并按照參數(shù)“-nsample200000-burnin40000”估計(jì)單葉省藤和黃藤與其他8個(gè)物種的分化時(shí)間。時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)參考物種發(fā)生分化的時(shí)間推算得出的。結(jié)果表明，單葉省藤和黃藤之間的分化時(shí)間約在1930萬年前，而棕櫚科的油棕和長葉刺葵的分化時(shí)間約在4080萬年前(原文圖4c)。

1.11 木質(zhì)素生物合成通路基因家族全基因組鑒定分析

木質(zhì)素是一種由木質(zhì)素單體組成的復(fù)雜芳香族聚合物，與纖維素和半纖維素基相互作用共同構(gòu)成次生細(xì)胞壁。木質(zhì)素通常由3種木質(zhì)素單體對-羥基苯基(p-hydroxyphenyl，H)、香草醛(vanillin，G)和丁香醛(syringaldehyde，S)組成。本研究利用擬南芥、二穗短柄草、水稻、高梁、毛竹(Phyllostachysedulis)、毛果楊(Populustrichocarpa)、單葉省藤和黃藤等8個(gè)物種的基因組進(jìn)行木質(zhì)素生物合成通路13個(gè)基因家族的全基因鑒定。多數(shù)基因組序列(擬南芥、二穗短柄草、水稻、高梁和毛果楊)從ENSEMBL數(shù)據(jù)庫下載獲得，從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫(BambooGenomeDatabase)中下載了毛竹的基因組序列。在前人研究的基礎(chǔ)上，收集得到了經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的140個(gè)木質(zhì)素生物合成通路基因(原文表S15)，這些基因作為查詢序列進(jìn)行進(jìn)一步的基因功能鑒定。如上所述，在全基因組基因鑒定過程中使用了BLAST比對和保守結(jié)構(gòu)域分析方法。簡單地說，使用已知基因的編碼序列，對所有基因組序列(包括兩種棕櫚藤的基因組序列)進(jìn)行了目標(biāo)蛋白的BLAST比對(版本2.2.26)，選取E-value<1e-10，相似度>40%且序列的覆蓋率>95%的序列。隨后，利用Pfam-A.hmm數(shù)據(jù)庫(2017年3月31日發(fā)布)對已過濾的序列進(jìn)行hmmsearch(版本3.1b2)分析，通過人工校正的方法去除結(jié)果中結(jié)構(gòu)域不完整的序列。結(jié)果表明，單葉省藤和黃藤中木質(zhì)素相關(guān)基因數(shù)量均有明顯增多(原文表3)。單葉省藤和黃藤中每個(gè)木質(zhì)素生物合成通路基因家族平均成員數(shù)量分別約為15和13個(gè)，總數(shù)分別為193和172個(gè)。在2種棕櫚藤中過氧化物酶基因家族是最常見的基因，單葉省藤的苯丙氨酸解氨酶基因和黃藤中的香豆酸3-羥化酶基因與肉桂酸4-羥化酶基因是最不常見的。棕櫚藤中木質(zhì)素生物合成基因的數(shù)目擴(kuò)增可能是由于全基因組復(fù)制(WGD)事件造成的，因?yàn)槿蚪M復(fù)制可以提供更多的基因拷貝，從而促進(jìn)具有新功能基因的進(jìn)化。

2 結(jié)論

本研究采用多種類型的測序數(shù)據(jù)，首次完成了單葉省藤和黃藤染色體水平基因組的組裝，2種棕櫚藤的基因組作為重要的參考基因組，將有助于促進(jìn)其他藤種的從頭基因組測序組裝和重測序研究，同時(shí)通過與不同物種進(jìn)行比較研究，為物種進(jìn)化研究提供證據(jù)。借助兩種棕櫚藤高質(zhì)量基因組數(shù)據(jù)，使木質(zhì)素生物合成通路關(guān)鍵基因的鑒定更加便捷，這些候選基因?qū)ψ貦疤俚纳L發(fā)育非常重要。本研究為進(jìn)一步對棕櫚藤及相關(guān)物種基因組的研究奠定了基礎(chǔ)。