樊 梅，鄧 俊，王宋平（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)一科，四川瀘州646000）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種具有氣流受限特征、可以預(yù)防和干預(yù)的疾病，其氣流受限不完全可逆、呈進(jìn)行性發(fā)展，與肺臟對(duì)吸入煙草煙霧等有害氣體或顆粒的異常炎性反應(yīng)有關(guān)，主要累及肺臟，造成患者肺功能受損以致呼吸衰竭及相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生，嚴(yán)重影響患者的生命健康及生活質(zhì)量[1]。氣道重塑是造成COPD不可逆氣流受限的主要病理基礎(chǔ)，由于慢性炎癥導(dǎo)致氣道壁損傷和修復(fù)的反復(fù)發(fā)生而形成[2]。骨橋蛋白（OPN）是一種多功能磷酸化糖蛋白，作為一種新型的細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，廣泛參與骨代謝、心血管病變、免疫應(yīng)答、腫瘤形成與轉(zhuǎn)移等過程[3]。近年來，OPN在炎癥、損傷修復(fù)、氣道重塑過程中的作用逐漸引起人們的重視。SIMOES等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在哮喘模型中OPN可誘導(dǎo)基底膜增厚，促進(jìn)氣道重塑。因此，OPN是否也同樣參與了COPD的氣道重塑過程，值得進(jìn)一步探討。近年來研究證實(shí)，阿奇霉素具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抑制氣道黏液分泌等作用，但阿奇霉素是否具有抑制COPD氣道重塑的作用尚鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察骨橋蛋白在COPD大鼠氣道重塑中的作用及阿奇霉素的干預(yù)效應(yīng)，為應(yīng)用阿奇霉素治療COPD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料 脂多糖（美國(guó)Sigma公司），阿奇霉素（歐意藥業(yè)有限公司），天下秀牌香煙（焦油量：10 mg，煙堿量：1.0 mg，一氧化碳量：11 mg，四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司）；大鼠OPN酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（伊萊瑞特生物科技有限公司），二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），10×乙二胺四乙酸（EDTA）修復(fù)液（Aspen公司），牛血清清蛋白（BSA，Roche瑞士羅氏公司）、兔抗鼠OPN抗體（Abcam公司）等。

1.2 方法

1.2.1 建立COPD大鼠模型 將18只健康雄性SD大鼠（購(gòu)自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心），體重180～200 g，隨機(jī)分為對(duì)照組（C組）、COPD模型組（M組）、阿奇霉素藥物干預(yù)組（A組），每組6只。M組：采用熏香煙加氣管內(nèi)滴注脂多糖的方法建立COPD模型：第1、14天，經(jīng)氣管滴注脂多糖200μg（0.2 mg/0.2 mL），其余時(shí)間每天予以熏香煙2次（2次間隔時(shí)間6 h以上），每次8支，每次1 h，共6周；第15天開始于煙熏前1 h予以生理鹽水2 mL灌胃。A組：造模方法同模型組，于15 d起每天熏煙前1 h予以阿奇霉素灌胃（50 mg/kg），給藥4周。C組：正常飼養(yǎng)，第15天開始予以等量生理鹽水灌胃。各組大鼠飼養(yǎng)條件均相同。

1.2.2 體重記錄 每周日清晨稱量大鼠空腹時(shí)體重，稱量2次，求平均值并記錄。

1.2.3 標(biāo)本處理 6周后處死所有大鼠，經(jīng)心臟取血后立即以2 500 r/min離心15 min，分離血清，-80℃保存。取新鮮右肺中葉組織4%多聚甲醛固定后制作病理標(biāo)本，蘇木精?伊紅（HE）染色觀察肺組織病理改變和氣道重塑指標(biāo)：200倍鏡下，每個(gè)標(biāo)本選取3個(gè)視野進(jìn)行觀察，選擇直徑在 300～700 μm 的氣道，利用 Image?pro?plus 6.0圖像分析軟件測(cè)量支氣管的管壁面積、氣管總面積、管壁厚度和氣管外徑長(zhǎng)度，然后計(jì)算管壁面積和氣管總面積比值（MA%）、管壁厚度與氣管外徑長(zhǎng)度比值（MT%）。Masson染色觀察氣道壁膠原沉積情況。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)血清OPN水平 采用雙抗體夾心ELISA法，按照操作說明書將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成以下濃度：100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125、1.563、0.000 ng/mL，設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔，各組樣品設(shè)2個(gè)復(fù)孔，空白孔加樣品稀釋液100μL為調(diào)零孔，其余孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μL，37℃反應(yīng)90 min，每個(gè)孔中加入生物素化抗大鼠OPN抗體100μL，37℃反應(yīng)1 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，每孔加酶結(jié)合物工作液100μL，37℃溫育30 min，洗滌5次，每孔加入90μLTMB顯色液，37℃避光孵育15 min，最后加終止液50μL，此時(shí)溶液為黃色，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的光密度（OD）值。

1.2.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)OPN表達(dá)情況 按試劑盒說明書將OPN一抗稀釋為1：150，陰性對(duì)照組用PBS替代一抗，具體步驟為：石蠟切片脫蠟至水后，置于EDTA緩沖液中抗原修復(fù)，3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，5%BSA封閉，滴加OPN一抗，4℃過夜，加入二抗、DAB溶液，顯微鏡控制顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水干燥、二甲苯透明、中性樹膠封固，最后光鏡下觀察，每張切片選擇3個(gè)視野。采用平均陽性染色面積百分比法分析免疫組織化學(xué)切片結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，方差齊數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，多組間兩兩間比較采用SNK?q檢驗(yàn)。兩變量間采用Pearson法分析相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況及體重變化 實(shí)驗(yàn)前2周各組大鼠精神狀態(tài)、進(jìn)食量、毛發(fā)色澤、對(duì)外界刺激反應(yīng)均無明顯變化。隨后M、A組大鼠逐漸出現(xiàn)間斷咳嗽、呼吸急促、進(jìn)食量減少、活動(dòng)量減少、精神萎靡、毛發(fā)枯黃、脫落，但A組上述改變較M組輕。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，三組大鼠體重比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；6周后，M組大鼠體重增加值[（91.67±24.47）g]比C組大鼠體重增加值[（168.17±31.10）g]、A組大鼠體重增加值[（127.50±3.33）g]均低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠肺組織病理改變 C組大鼠氣道結(jié)構(gòu)正常，周圍無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，M組大鼠氣道平滑肌增生，黏液腺體增生，氣道內(nèi)管黏液栓形成，氣道周圍膠原沉積增多，管壁增厚，管腔狹窄，氣道纖毛倒伏、脫落，周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；肺泡腔不規(guī)則擴(kuò)張，肺泡間隔斷裂，肺大泡形成；A組上述改變較M組輕。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理改變

2.3 各組大鼠氣道重塑指標(biāo)比較 M、A組氣道重塑指標(biāo)MT%、MA%較C組明顯升高，但A組MT%、MA%低于M組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠氣道重塑指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠氣道重塑指標(biāo)比較（±s）

注：與 C 組比較，aP＜0.05；與 M 組比較，bP＜0.05

組別C組M組A組n6 6 6 MT%21.21±1.26 38.53±0.74a 28.15±1.32ab MA%13.87±0.38 29.06±1.31a 20.41±0.78ab

2.4 各組大鼠血清OPN水平比較 M組大鼠血清OPN水平[（44.63±2.01）ng/mL]較C組[（18.49±1.74）ng/mL]升高，A組血清OPN水平[（30.16±2.12）ng/mL]較M組降低，但較C組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.5 各組大鼠肺組織OPN蛋白表達(dá)比較 OPN蛋白主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞，以及氣道及肺血管周圍的炎癥細(xì)胞，以細(xì)胞質(zhì)著色為主，陽性產(chǎn)物為棕黃色沉淀，見圖2。C、M、A三組的OPN平均陽性染色面積百分比分別為（27.41±1.34）%、（60.33±2.33）%、（41.45±3.17）%，M 組OPN蛋白表達(dá)明顯高于C組，A組OPN蛋白表達(dá)明顯低于M組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 各組大鼠肺組織OPN蛋白的表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)法，200×）

2.6 血清OPN水平、肺組織OPN蛋白表達(dá)與氣道重塑的相關(guān)性分析 血清OPN水平、肺組織OPN蛋白表達(dá)與氣道重塑指標(biāo) MA%[相關(guān)系數(shù)（r）＝0.967、0.980，P＜0.01]、MT%（r＝0.984、0.981，P＜0.01）均呈正相關(guān)，見圖 3。

圖3 血清OPN水平、肺組織OPN蛋白表達(dá)與氣道重塑的相關(guān)性分析

3 討 論

氣道重塑主要發(fā)生于直徑小于2 mm的小支氣管和細(xì)支氣管，是COPD患者發(fā)生不可逆氣流受限的病理基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，M、A組大鼠均出現(xiàn)了氣道重塑，氣道重塑發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前認(rèn)為氣道重塑主要涉及炎癥和非炎癥機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者氣道內(nèi)和管壁均存在大量巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)，且氣流受限程度與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度呈正相關(guān)。炎癥細(xì)胞可通過釋放多種炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子、酶、活性氧等使局部組織損傷，介導(dǎo)組織異常修復(fù)，最終導(dǎo)致氣道重塑[2]。近年來，非炎癥機(jī)制也在COPD氣道重塑中起著重要作用，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）?基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑失衡、α1?抗胰蛋白酶水平異常、氧化應(yīng)激反應(yīng)及一些細(xì)胞因子的異常表達(dá)，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子?β1（TGF?β1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子?2、表皮生長(zhǎng)因子等均能促進(jìn)氣道重塑[5?6]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，M組大鼠氣道重塑最顯著，其血清OPN水平、肺組織OPN蛋白表達(dá)均高于C、A組，且大鼠氣道重塑指標(biāo)與血清OPN水平、肺組織OPN蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，證明OPN可能是介導(dǎo)氣道重塑的因素之一。近年來研究表明，COPD患者體內(nèi)的OPN水平與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[7]。OPN主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等，正常情況下，組織OPN表達(dá)很少，僅發(fā)揮生理功能，但低氧、炎癥、損傷等刺激均可誘導(dǎo)OPN表達(dá)增加。OPN作為一種炎癥趨化因子可促進(jìn)中性粒細(xì)胞增殖和分化[8]，而中性粒細(xì)胞可通過釋放中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶降解膠原和彈性纖維組織，引起肺泡及氣道結(jié)構(gòu)破壞，中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶還可誘導(dǎo)TGF?β的釋放，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)成分如纖黏蛋白、蛋白多糖、膠原的合成，引起細(xì)胞外基質(zhì)沉積，從而造成氣道管壁變厚、管腔狹窄。OPN還能調(diào)節(jié)肺巨噬細(xì)胞的增殖、遷移、聚集，巨噬細(xì)胞可通過釋放MMPs，造成蛋白酶/抗蛋白酶失衡，降解細(xì)胞外基質(zhì)，使肺組織彈性纖維斷裂，造成肺泡和氣道結(jié)構(gòu)破壞，此外，細(xì)胞外基質(zhì)降解后，更有利于炎癥細(xì)胞在肺組織聚集、遷移，進(jìn)一步加重肺組織損傷。研究發(fā)現(xiàn)，OPN基因敲除裸鼠白細(xì)胞介素?12（IL?12）分泌較野生鼠明顯減少，氣道中炎性細(xì)胞及黏液分泌也減少，若給OPN基因敲除鼠注入重組OPN后則出現(xiàn)上述相反的情況，證實(shí)OPN可通過調(diào)節(jié)IL?12的分泌介導(dǎo)氣道炎癥及黏液分泌[9]。另外，OPN自身還可激活轉(zhuǎn)錄因子核因子κB和AP?1，從而潛在地調(diào)節(jié)多種炎性基因的表達(dá)[10]。

阿奇霉素是15元環(huán)半合成大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，以往研究表明，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素被有效用于治療慢性氣道炎癥性疾病，如彌漫性泛細(xì)支氣管炎，囊性纖維化、哮喘、支氣管擴(kuò)張等[11?12]。近年來，阿奇霉素在 COPD中的療效也得到廣泛肯定。韓利等[13]研究表明，對(duì)于Ⅲ、Ⅳ級(jí)COPD穩(wěn)定期患者，長(zhǎng)期小劑量阿奇霉素聯(lián)合布地奈德/福莫特羅較單一予以布地奈德/福莫特羅更能明顯改善患者肺功能，顯著改善相關(guān)臨床癥狀，并降低急性加重次數(shù)。既往對(duì)于阿奇霉素治療COPD的研究多集中于改善氣道炎癥、氣道黏液分泌等方面的研究，而對(duì)于治療COPD氣道重塑研究較少。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與M組比較，A大鼠氣道平滑肌和黏液腺體增生減少，氣道周圍炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，氣道周圍膠原沉積減少，氣道重塑指標(biāo)降低，且血清OPN水平、肺組織OPN蛋白表達(dá)水平明顯低于M組，證實(shí)阿奇霉素可減輕COPD氣道重塑，其機(jī)制可能與抑制OPN的表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了COPD氣道重塑的發(fā)病機(jī)制，為臨床應(yīng)用阿奇霉素治療COPD提供了新的理論依據(jù)。

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