侯東敏 王政昆 葉芳艷 朱萬龍

(云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動植物生態(tài)適應進化及保護重點實驗室，云南師范大學生命科學學院，昆明，650500)

在哺乳動物的繁殖行為中，尿液中化學信號發(fā)揮著極為重要的作用。與正常雄性小家鼠(Musmusculus)相比，免疫缺陷使雄鼠的某些性信息素成分(如E-βFarnesene，E，E-αFarnesene，1-hexadecanol)含量普遍降低，雄鼠尿液對雌鼠的吸引力顯著降低[1-2]；這說明小家鼠可以通過異性的尿液氣味來判斷其免疫能力，從而選擇高質量的配偶，以增加后代的適合度。雄性小鼠尿液中含有大量的氣味分子使雌性小鼠發(fā)情，如6-hydroxy-6-methyl-3-heptanone能夠誘導雌鼠來交配[1]。根田鼠(Microtusoeconomus)哺乳和非哺乳期雌性尿液的化學組成成分存在顯著差異，通過行為學研究發(fā)現(xiàn)，雄性能夠辨別這種差異，在選擇配偶時更偏向于處于哺乳期的雌性[3]。尿液揮發(fā)性成分的組成影響動物的行為反應[4-7]。

有研究表明，雌性動物個體尿液中化學信號與性吸引力有關[8]，雌性根田鼠在不同生理時期的尿液中的信息素成分會產生變化，哺乳期尿液中特有物質為2-iodide octane，非哺乳期尿液特有物質為2-iodide hexane、2，6，10-three methyl fourteen alkyl，這3種化合物能引發(fā)雄性個體對處于哺乳和非哺乳的雌性個體尿氣味的行為差異，從而影響雄性對配偶的選擇[7]。雌性小家鼠處于動情期時，個體尿液中含有特異的信號物質1-Iodo-2-methylundecane，能雄性個體動情[8]。可見，動物的尿液含有不同的揮發(fā)性化合物，刺激它們的性行為，從而影響配偶選擇和繁殖成功率。

北樹鼩(Tupaiabelangeri)亦稱中緬樹鼩，屬攀鼩目(Scandentia)樹鼩科(Tupaiidae)，分布于南亞、東南亞以及中國南部和西南部地區(qū)，為東洋界特有的晝行性小型哺乳動物。北樹鼩為雜食性動物，偏愛動物性食物，也喜甜食。北樹鼩在自然條件下采取一雄一雌或一雄多雌的繁殖方式。因北樹鼩體形小易控制、管理方便、容易飼養(yǎng)、成本低、繁殖快，且其在生物學特征、生理生化、新陳代謝以及基因組等方面與人類較為相近，故被認為是一種具有潛在應用價值的新型實驗模式動物，現(xiàn)已廣泛應用于多種疾病的研究。因野外繁殖率較高，但實驗室繁殖率較低，因此極大地阻礙了北樹鼩實驗動物模型化進程。根據(jù)本研究組之前的研究結果，我們假設雄性北樹鼩能夠辨別雌性北樹鼩不同生理狀態(tài)(發(fā)情期、懷孕期和哺乳期)的尿液，并推測雌性北樹鼩不同生理狀態(tài)(發(fā)情期、懷孕期和哺乳期)的揮發(fā)性成分組成存在差異，找出尿液中信息素，為研究尿液成分在北樹鼩配偶選擇中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物來源

本研究的實驗動物，北樹鼩捕自昆明祿勸縣灌叢(N25°26′～26°22′；E102°13′～102°575′)，海拔1 679 m。動物捕回后于云南師范大學生命科學學院實驗動物房(昆明)單籠室溫飼養(yǎng)，飼養(yǎng)籠規(guī)格為：120 mm×200 mm×300 mm，室溫控制在(25±1)℃，光周期12L∶12D，供以充足的飼料。用于尿液成分分析、氣味辨別的實驗。實驗室馴化1個月后，選擇60只北樹鼩為實驗對象(♀30和♂30)，一雌一雄配對，有20只雌性北樹鼩懷孕。其中10只作為懷孕期(交配后20 d)的對象，10只作為哺乳期的對象，此外選取了12只發(fā)情期的雌性北樹鼩。實驗開始前選取了6只雄性北樹鼩作為氣味辨別的研究對象。

發(fā)情期的判定標準為：雌性生殖孔正常開放，食量下降，焦躁不安，活動量明顯增加，喜歡做“后空翻”運動，有些母樹鼩甚至會主動追爬公樹鼩[9]，處于發(fā)情周期、非孕期和非哺乳期。為保證實驗的準確性，在進行行為學實驗前，隨機選擇3只發(fā)情期雄性個體為被試對象，進行左右偏好測試。安裝好Y-型迷宮，將雄北樹鼩分別作為被試動物放于適應箱內，刺激源為空箱，發(fā)現(xiàn)動物沒有左右偏好，再進行本實驗。刺激源為雌性北樹鼩不同繁殖期(發(fā)情期、懷孕期(交配后20 d)、哺乳期)的尿液，實驗時間為每天9：00～16：00，同時收集不同繁殖期雌性尿液用于GS-MS分析尿液揮發(fā)性成分。

1.2 氣味辨別

Y-型迷宮底面及兩側面以鍍錫鐵皮(厚16 mm)制作，頂面端面由透明亞克力板制作，由適應箱、選擇臂及刺激源箱組成，行為觀察室內裝有15 W的白熾燈照明及實時監(jiān)測紅外相機。由適應箱、選擇臂及刺激源箱組成，行為觀察室內裝有15 W的白熾燈照明及實時監(jiān)測紅外相機。

實驗時，依次安置好刺激源、被試鼠、有機玻璃蓋，隨后開啟鼓風機電源，在2個選擇臂內形成氣流速度約1 m/s的氣流；被試動物適應15～20 min后，打開適應箱的前門，正式觀察記錄10 min；觀察者站在適應箱一端，通過迷宮上方透過有機玻璃蓋觀察鼠的活動，并用秒表記錄被試鼠分別花費在2個觀察臂內的時間；在同一組實驗中，同一刺激源于左右刺激源內各放置1次，來保證刺激放置的隨機性。每次測試持續(xù)10 min，用秒表記錄被試動物在每個迷宮臂內的時間。每次實驗結束后，用清水和75%酒精清洗迷宮內側，并用熱風吹干，待用于下一次測試。刺激源為發(fā)情期和懷孕期組合，哺乳期和懷孕期組合，哺乳和發(fā)情組合。實驗后，用清水和75% 酒精將迷宮進行擦洗，以待下次實驗使用。

1.3 尿液樣品的采集與處理

分別收集發(fā)情期、懷孕期、哺乳期雌性個體的尿液，取樣時間為9：00和17：00。采樣采用12 mL樣品瓶(寧波哈邁，HM-1266A，棕色螺紋樣品瓶)，每瓶收集鮮尿液5～10 mL。動物裝入代謝籠內，將三角漏斗擦拭干凈并墊入一層薄薄的脫脂棉，然后將新的頂空分析樣品瓶拴在漏斗接口處，后將代謝籠放在漏斗上待收集鮮尿液；待收集到尿液后(若被糞便或食物殘渣等污染的尿液應丟棄)，將瓶子取下并立即蓋好并擰緊樣品瓶蓋，樣品瓶蓋是具帶聚四氟乙烯(PTFE)涂層的隔墊，并將聚四氟乙烯涂層朝下，避免可能產生的污染；取下代謝籠，將三角漏斗里面的糞便和余下的尿液處理干凈，換一層新棉花重復以上步驟即可；樣品瓶上標記所采個體編號，并于記錄本上詳細記錄每個編號所對應動物的呼名、性別、年齡、發(fā)情階段、采樣日期及時間等信息。每只個體每次采樣2份，收集好的尿液立刻密封并迅速置于-20℃冰箱貯存(確定好樣品后使用生料帶(聚四氟乙烯，PTFE)對樣品瓶進行密封，保存時盡量保持樣品處于直立狀態(tài))。尿液樣品采集工作在1周左右完成。之后將尿液樣品送至蘇州帕糯米克生物科技有限公司(江蘇省蘇州市)進行測定。

取5 mL的樣品置于20 mL頂空瓶中，壓緊瓶蓋，于55℃水浴鍋中水浴40 min，繼而使固相微萃取頭頂空吸附20 min，然后進樣，利用HS-SPME萃取頭在250℃下不分流解吸10 min后，收回萃取頭并拔出萃取針，在使用萃取針前在250℃老化10 min，冷卻到室溫后依次用甲醇、乙醚、正己烷、去離子水清洗，再用于GC-MS分析。

1.4 尿液揮發(fā)性成分的GC-MS測定

利用氣相色譜和質譜聯(lián)用GS-MS測定北樹鼩的尿液成分的揮發(fā)性化學組成。GC-MS色譜條件：色譜柱為DB-5毛細管柱子(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為He，流速1 mL/min，不分流；進樣溫度為240℃，柱箱溫度為50℃；升溫程序為起始溫度為50℃，保持2 min，以4℃/min，升至240℃，保持5 min。質譜條件：EI電離源，能量70 eV，倍增電壓1 400 V；離子源溫度200℃，接口溫度250℃，四級桿溫度150℃，掃描范圍40～450 m/z，間隔0.3 s。然后將采集到的質譜圖利用計算機譜庫進行檢索，鑒定樣品中的揮發(fā)性成分。檢測出的物質通過NIST(National Institute of Standards and Technology)質譜庫進行檢索，再結合物質保留時間來對物質進行推定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS13.0軟件包進行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)分布和方差齊次性檢驗，符合參數(shù)檢驗條件。中緬樹鼩在Y型迷宮中行為學統(tǒng)計分析均使用獨立樣本t檢驗(Independent-SamplesTTest)。數(shù)值均以平均值±標準誤(Mean±SE)表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 雄性北樹鼩對雌性北樹鼩不同繁殖期的尿液響應

使用處于發(fā)情期或哺乳期雌性北樹鼩尿液和懷孕期北樹鼩的尿液作為氣味刺激源時，雄性北樹鼩均極顯著偏好發(fā)情期(t=-6.13，P<0.01)或哺乳期(t=-3.70，P<0.01)雌性北樹鼩尿液的氣味；用處于發(fā)情期和哺乳期雌性北樹鼩的尿液作為氣味刺激源時，被試雄性北樹鼩沒有表現(xiàn)出(t=-0.48，P>0.05，表1)氣味偏好。

表1 Y型迷宮中雄性北樹鼩對雌性不同繁殖期尿液氣味的辨別

Tab.1 Preference of male Tupaia belangeri to femaleurine odour from different period in Y-maze

注：數(shù)值為平均值±標準誤差，ns：差異不顯著(P> 0.05)，P<0.01，差異極顯著

Note：Data are means±SE，ns：non-significant(P>0.05)，P<0.01 indicates very significant difference between two groups

2.2 發(fā)情期、懷孕期和哺乳期雌性尿液揮發(fā)性成分

經(jīng)GC-MS分析發(fā)情期、懷孕期、哺乳期北樹鼩尿液的揮發(fā)性成分組成見表2。發(fā)情期雌性尿液揮發(fā)性成分有59種，其中醇19種，酮8種，醛6種，烯烴3種等。懷孕期雌性尿液揮發(fā)性成分有83種，其中醇23種，酮7種，醛3種，酚類3種，雜環(huán)類4種等。哺乳期雌性尿液揮發(fā)性成分有69種，其中醇22種，酮11種，醛2種，酚類3種，雜環(huán)類4種等。發(fā)情期、懷孕期、哺乳期雌性尿液揮發(fā)性成分的結果表明，3種不同生理時期的雌性尿液中的揮發(fā)性成分大部分相同，都是醇類和酮類化合物為主體等。

在3種不同生理時期的尿液中也有表達特異性的揮發(fā)性成分：與懷孕期和哺乳期相比，發(fā)情期雌性尿液中特有的揮發(fā)性成分為Butandl，3-methyl-、Hexadecane、1，3，6，10-Dodecatetraene、3，7，11-trimethyl-、(Z，E)-、Cyclooctane；與發(fā)情期和哺乳期相比，懷孕期雌性尿液中特有的揮發(fā)性成分為Acetone、Disulfide、dimethyl、2，3-Hexanedione、(R)-(-)-2-Pentanol、2，4-Dithiapentane、2-Buten-1-ol、3-methyl-、2-Nonanol、Benzaldehyde、2-methyl-、6-Octen-1-ol、7-methyl-3-methylene-、2，6-Octadien-1-ol、3，7-dimethyl-、(Z)-、Cyclohexadecanone、Dibutyl phthalate；與發(fā)情期和懷孕期相比，哺乳期雌性尿液中特有的揮發(fā)性成分為o-Xylene、2，5-Octanedione、α-Methyl-α-[4-methyl-3-pentenyl]oxiranemethanol、4-(3，4-Methylenedioxyphenyl)-2-butanone、3-Cydohexene-1-d、4-methyl-1-(1-methylethyl)-、(R)-、Cyclohexanone、2-methyl-5-(1-methylethenyl)-、Benzoic acid、2-ethylhexyl ester、2-6-10-Dodecatrien-1-ol、3，7，11-trimethyl-。

表2 發(fā)情期、懷孕期、哺乳期北樹鼩尿液的揮發(fā)性成分組成

Tab.2 Compounds identified in urine of the T.Belangeri in estrus，pregnancy and lactation

續(xù)表2

續(xù)表2

注：+表示物質的存在

Note：+Material existence

3 討論

3.1 雄性北樹鼩對不同繁殖期雌性尿液的辨別

哺乳動物的尿液包含著生殖狀態(tài)的信息[10-14]，例如，根田鼠哺乳和非哺乳期雌性尿液的化學成分存在顯著差異，通過行為學研究發(fā)現(xiàn)，雄性能夠辨別這種差異，在選擇配偶時更偏向于處于哺乳期的雌性[3]，動情期牛的尿液對雄牛的性吸引作用明顯[8]。在我們的研究同樣發(fā)現(xiàn)，雄性北樹鼩能依據(jù)尿液氣味辨別發(fā)情期、懷孕期、哺乳期的雌性，這說明尿液能編碼雌性北樹鼩的繁殖狀態(tài)信息。

在繁殖季節(jié)，雌雄個體會交流彼此的動情狀態(tài)和排卵信息，這是動物生存和繁衍的重要保障，因此，大多數(shù)雌性哺乳動物隨著生理周期的變化產生不同的氣味，向雄性傳遞繁殖狀態(tài)的信息。尿液是哺乳動物中最重要的氣味源之一，處于不同生理周期的動物，氣味的組成成分也隨之變化[15]。大量的研究表明，很多嚙齒類動物都有自己的發(fā)情周期，與非發(fā)情雌性尿液氣味相比，雄性更偏好發(fā)情期間雌性尿液氣味[16]。同樣地，與其他生理周期相比，雄性更偏好動情期雌性個體氣味[15]。

以上研究都表明不同生理時期雌性個體尿液中信息素成分存在差異。我們的行為學研究也表明，雄性北樹鼩對發(fā)情期、懷孕期和哺乳雌性個體尿氣味的行為響應不同，可見這3個生理時期的尿液信息素成分必然有所不同，因此我們用GC-MS技術分析了發(fā)情期、懷孕期和哺乳雌性個體尿氣味的揮發(fā)性成分，試圖找出引起雄性個體行為差異的信息素。

3.2 不同繁殖期雌性尿液揮發(fā)性成分的比較

GC-MS分析結果表明，3種不同生理時期雌性個體尿液中可揮發(fā)性成分大部分是相同，主要是醇類和酮類化合物，同時含有一定量的支鏈烷烴和雜環(huán)化合物。本研究發(fā)現(xiàn)，尿液中揮發(fā)性成分中醇類化合物含量最多，而烷烴和酚類等其他化合物含量較少，這3種生理時期雌性的尿液中都含有大量醇類化合物，因此推斷此類化合物可能是尿液中的機體代謝終產物。在其他的一些哺乳動物尿液中也發(fā)現(xiàn)了身體儲備物質的新陳代謝產物—酮類化合物，同樣在3種來源的非繁殖期北樹鼩尿液也存在。該結果表明這些儲備物質的代謝途徑受系統(tǒng)發(fā)育控制。

研究表明哺乳期與非哺乳期雌性尿液中部分揮發(fā)性化學成分不同。動情期尿液特有Butanal、3-methyl-、1，3，6，10-Dodecatetraene、3，7，11-trimethyl-、(Z，E)-、Cyclooctane；懷孕期尿液特有物質Acetone、Disulfide、dimethyl、(R)-(-)-2-Pentanol、2，4-Dithiapentane、3-methyl-、2-Nonanol、Benzaldehyde、2-methyl-、6-Octen-1-ol、7-methyl-3-methylene-、2，6-Octadien-1-ol、3，7-dimethyl-、(Z)-、Cyclohexadecanone、Dibutyl phthalate；哺乳期雌性尿液中特有的揮發(fā)性成分為O-Xylene、2，5-Octanedione、α-Methyl-α-[4-methyl-3-pentenyl]oxiranemethanol、4-(3，4-Meth-ylenedioxyphenyl)-2-butanone、3-Cyclohexcn-1-op、4-methyl-1-(1-methylethyl)-、(R)-、Cyclohexanone，2-methyl-5-(1-methylethenyl)-、Benzoic acid，2-ethylhexyl ester。Benzoic acid，2-ethylhexyl ester、-2，6，10-Dodecatrien-1-ol、3，7，11-trimetlyl-具有驅趕其他個體的功能。然而這些特有化合物在研究尿樣中出現(xiàn)的頻率和含量都很低，可能是由于實驗動物的個體差異所致。發(fā)情期尿液特有物質Hexadecane；懷孕期特有物質2，3-Hexanedione、2-Buten-1-ol，3-methyl-；哺乳期特有物質Cyclohexanone、2-methyl-5-(1-methylethenyl)-在研究的尿樣中出現(xiàn)頻率和含量都很高，另外，在其他哺乳動物的研究中以往的研究表明烷烴類化合物在動物性別吸引中具有重要作用[17]，因此這4種物質可能是性信息素，能引起雄性中緬樹鼩對3種不同時期尿液的行為差異。體內荷爾蒙有規(guī)律的變化能引起動物的生理周期的變化，因此不同生理時期體內荷爾蒙能引起3種時期尿液存在揮發(fā)性成分的變化。

在哺乳動物中，雌性個體通過信息素向雄性個體傳遞繁殖信息。雌性根田鼠在不同生理時期尿液中的信息素成分會發(fā)生改變，哺乳期尿液中特有物質為2-iodide octane，非哺乳期尿液特有物質為2-iodide hexane、2，6，10-three methyl fourteen alkyl，這3種化合物引起雄性個體對哺乳和非哺乳雌性尿氣味的行為差異，對雄性個體吸引強度不同，從而影響雄性的配偶選擇[7]。雌性小家鼠處于動情期時，尿液含有特異的信號物質為1-Iodo-2-methylundecane，能雄性個體動情[8]。1-iodoundecane是動情期牛的尿液中特有的信號物質，能顯著吸引公牛[17]。在我們的研究中，3種生理時期尿液都特有物質。綜上所述，不同生理時期動物的尿液成分會發(fā)生變化，信息素成分會發(fā)生改變，對雄性個體吸引強度不同，從而影響雄性的配偶選擇。本實驗室明確雌性北樹鼩不同生理期尿液成分，篩選出候選性信息素成分，在后續(xù)研究中，我們會改變不同生理時期尿液的成分驗證其功能。

尿液中的化學信號在哺乳動物繁殖行為發(fā)揮重要作用。與正常雄性小家鼠相比，免疫缺陷使雄鼠的某些性信息素成分(如E-β Farnesene，E，E-α-Farnesene，1-hexadecanol)含量普遍降低，雄鼠尿液對雌鼠的吸引力顯著降低[2]；這說明小鼠可以借助異性尿液氣味評估其免疫能力，選擇高質量的配偶，提高后代的適合度。雄性小鼠尿液中含有大量使雌性小鼠發(fā)情的氣味分子，如6-hydroxy-6-methyl-3-heptanone能夠誘導雌鼠來交配[1]。根田鼠哺乳和非哺乳期雌性尿液的化學成分存在顯著差異，通過行為學研究發(fā)現(xiàn)，雄性能夠辨別這種差異，在配偶選擇中更偏好于哺乳期雌性[7]。

雌性個體不同生理時期尿液中的信息素成分會發(fā)生改變，根田鼠哺乳期尿液中特有物質為2-iodide octane，非哺乳期尿液特有物質為2-iodide hexane、2，6，10-three methyl fourteen alkyl，對雄性個體吸引強度不同，這3種化合物引起雄性個體對哺乳和非哺乳雌性尿氣味的行為差異，從而影響雄性的配偶選擇[7]。雌性小家鼠處于動情期時，尿液中含有個體尿液中特異的信號物質1-Iodo-2-methylundecane，能雄性個體動情[8]。

綜上所述，在我們的研究中，如上述的根田鼠和雌性小家鼠一樣，北樹鼩能夠依據(jù)尿液辨別不同繁殖期的雌性樹鼩，尿液在北樹鼩的繁殖中發(fā)揮著重要作用。同時，不同繁殖期的雌性樹鼩尿液的化學成分存在較大差異，各繁殖期的特有物質可能是引起雄性樹鼩不同的行為反應。本章實驗旨在明確雌性北樹鼩不同生理狀態(tài)(發(fā)情期、懷孕期和哺乳期)尿液的揮發(fā)性成分組成，發(fā)情期尿液特有物質Hexadecane；懷孕期特有物質2，3-Hexanedione、2-Buten-1-ol，3-methyl-；哺乳期特有物質Cyclohexanone，2-methyl-5-(1-methylethenyl)-，這些物質可能是雌性信息素。為研究尿液成分在北樹鼩配偶選擇中的作用奠定基礎，篩選出候選雌性信息素，最終為實現(xiàn)北樹鼩的規(guī)?；B(yǎng)殖和管理提供一定的科學依據(jù)。

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