劉 燕 王 曦 劉學鋒 李林海鄭常明 夏茂華 張成林*

(1.北京動物園，北京，100044；2.圈養(yǎng)野生動物技術北京市重點實驗室，北京，100044；3.國家林業(yè)局林產(chǎn)工業(yè)規(guī)劃設計院，北京，100010)

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)是我國特有的瀕危珍稀物種。根據(jù)全國第4次大熊貓調(diào)查的結(jié)果，野生大熊貓分布在秦嶺、岷山、鄧峽山、大相嶺、小相嶺、涼山6大山系，共有1 862只。圈養(yǎng)大熊貓種群數(shù)量達到375只。北京動物園作為國內(nèi)少數(shù)飼養(yǎng)有大熊貓的動物園之一，對大熊貓的飼養(yǎng)非常重視。

腸道菌群對大熊貓機體健康有重要影響[1-2]，其菌群多樣性也受到飲食結(jié)構(gòu)和生活地域的影響[3]。3只大熊貓F、D和E出生后(其中大熊貓D和大熊貓E是1對雙胞胎)，一直飼養(yǎng)于成都，于2014年10月回到北京動物園飼養(yǎng)。3只大熊貓剛回到北京動物園飼養(yǎng)后，即14月齡時，采集新鮮糞便，并于2月后，3只大熊貓在北京動物園熊貓館的生活已經(jīng)基本穩(wěn)定并已形成穩(wěn)定的腸內(nèi)菌群以后再次采集新鮮糞便，采用高通量測序技術對糞便內(nèi)細菌多樣性進行分析。本實驗的目的就是研究3只大熊貓在14月齡時從成都回到北京動物園飼養(yǎng)后，糞便菌群是否發(fā)生較大變化，探討其是否能很好地適應新的環(huán)境。

1 實驗方法

1.1 樣品采集

采集北京動物園3只亞成體圈養(yǎng)大熊貓糞便樣本19份，其中剛從成都回到北京動物園時(14月齡)的新鮮糞便樣本共10份(n=3)，編號為F14_1、F14_2、F14_3、F14_4、F14_5，D14_1、D14_2、D14_3，E14_1、E14_2；2個月后新鮮糞便(16月齡)樣本共9份(n=3)，編號為F16_1、F16_2、F16_3，D16_1、D16_2、D16_3、D16_4，E16_1、E16_2。

糞便采集時，戴無菌一次性手套用無菌棉簽，從新鮮糞便內(nèi)部采集10 g左右，用液氮保存后到回實驗室，放入-80℃冰箱保存待檢。

1.2 測序準備

1.2.1 基因組DNA抽提

用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit試劑盒提取大熊貓糞便中的基因組DNA。具體操作步驟按照說明書進行。然后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。合格后放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 16S rRNA基因擴增及測序

以大熊貓基因組DNA為模板，利用正向引物338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCA)，反向引物806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)，擴增16S rRNA基因的V3+V4區(qū)域。

PCR 擴增反應體系：5×FastPfu Buffer 4μL，2.5 mM dNTPs 2μL，上游引物(5μM)0.8μL，下游引物(5μM)0.8μL，F(xiàn)astPfu 聚合酶(5U/μL)0.4μL，模板DNA 10 ng，然后補ddH2O至20μL。PCR 儀為ABI GeneAmp?9700 型。PCR反應參數(shù)為：95℃3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s；共27個循環(huán)，72℃ 10 min，最后保持在10℃。每個樣本3個重復，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物3μl上樣電泳檢測。

1.2.3 擴增產(chǎn)物的純化和回收

合格樣本，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收純化PCR產(chǎn)物。

2 高通量測序

2.1 測序

擴增產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，利用Illumina MiSeq測序平臺進行高通量商業(yè)化測序。

2.2 數(shù)據(jù)分析

2.2.1 測序結(jié)果分析

經(jīng)MiSeq測序得到的PE reads，根據(jù)Overlap關系進行拼接，然后對序列質(zhì)量進行過濾和質(zhì)控。

2.2.2 物種組成分析

應用軟件Usearch(Version 7.0)在相似性為97%的條件下，對OUT的代表序列進行聚類分析和物種分類學分析。

2.2.3 Alpha多樣性分析

應用Mothur軟件(Version v.1.30.1)進行Chao、Coverage、Shannon、Simpson 4種常用指數(shù)的測定?；贠UT聚類分析的結(jié)果，再進行多樣性指數(shù)分析和測序深度檢測。

2.2.4 Beta多樣性分析

應用QIIME軟件(Version 1.9.1)進行分析。根據(jù)各個樣品OUT的種類及豐度，根據(jù)Bray_curtis距離進行作圖，R值越接近1表示組間差異越大于組內(nèi)差異，R值越小則表示組間和組內(nèi)沒有明顯差異?；谖锓N分類學分析的結(jié)果，在各個分類水平上，進行菌群結(jié)構(gòu)的分析；在上述分析的基礎上，對多樣本的群落組成和系統(tǒng)發(fā)育信息進行多元分析和差異顯著性檢驗等一系列深入的統(tǒng)計學以及可視化分析。

3 結(jié)果

3.1 測序結(jié)果

19份大熊貓糞便樣品經(jīng)過測序，共獲得698 191條有效序列，平均每個樣品含有36 746條序列，每條序列的平均長度是445 bp。這些序列共分屬于9個門、16綱、27目、45科、75屬、103種、138個OUT。其中124個OUT為14月齡和16月齡共享OUT(圖1)；大熊貓F、D和E共享OUT為90個(圖2)。

圖1 14月齡組和16月齡組糞樣細菌OUT維恩圖Fig.1 Venn diagram showing the OTUs of fecal bacteriabetween 14 months and 16 months

圖2 大熊貓F、D和E糞樣細菌OUT維恩圖Fig.2 Venn diagram showing the OTUs of fecal bacteriaof panda F、D and E

3.2 物種組成分析

本次測定大熊貓糞便菌群主要屬于變形菌門(Proteobacteria)平均占55.5%，厚壁菌門(Firmicutes)平均占42.5%和藍菌門(Cyanobacteria)平均占1.68%。

在屬水平上，大腸志賀氏桿菌屬(Escherichiashigella)平均占50.1%，狹義梭菌屬(Clostridiumsensustricto)平均占13.8%，鏈球菌屬(Streptococcus)平均占11.7%，乳桿菌屬(Lactobacillus)平均占4.9%，未分類的藍細菌(Norank-c-Cyanobacteria)平均占1.7%。

14月齡和16月齡組間比較，發(fā)現(xiàn)乳球菌屬(Lactococcus)差異顯著(P<0.05)，16月齡高于14月齡。其他屬之間差異不顯著(P>0.05)(圖3)，大熊貓F、D和E之間差異不顯著(P>0.05)。

3.3 Alpha多樣性分析

19份樣品的序列覆蓋率Coverage均達到99.9%以上。14月齡和16月齡組間4種指數(shù)差異不顯著(P>0.05)。大熊貓F、D和E之間4種指數(shù)差異也都不顯著(P>0.05)(表1)。

表1 19份樣品多樣性指數(shù)

Tab.1 Diversity estimation of nineteen samples

續(xù)表1

圖3 14月齡和16月齡組間多物種差異檢驗柱形圖Fig.3 Wilcoxon rank-sum test bar plot between 14 months and 16 months

圖5 大熊貓糞便細菌PCoA聚類圖(百分數(shù)代表了樣品受主成分影響下的相似性距離)Fig.5 PCoA diagram reflecting clustering of fecal bacillus of panda(The percentages represented the similarity distance under influence of PC)

3.4 Beta多樣性分析

從圖4可以看出，其R值為0.074，說明組間和組內(nèi)沒有明顯差異，但也可以說明大熊貓F和D、F和E之間的細菌群落差異性大于D和E之間的細菌群落差異性。

同時，樣品進行了聚類分析并繪制了PCoA 聚類圖(圖5)?？梢钥闯?，除了樣品E14_2外，其他18個樣品聚集度非常高。無論是按照大熊貓個體分組，還是按照月份分組，樣品在圖上并沒有依據(jù)其組別而表現(xiàn)出明顯的組內(nèi)聚集。再次印證14月齡和16月齡之間、大熊貓F、D和E之間差異不顯著。

圖4 在屬水平大熊貓F、D和E組間距離盒狀圖Fig.4 Distance calculated on genus level of panda F、D and E

4 討論

高通量測序技術，是近幾年來才建立的一種研究菌群組成的全新技術[4-9]，與以往的研究方法相比較，能夠比較全面地反應出樣品中微生物的種類[10-11]。很多珍稀瀕危動物都通過該方法進行了腸道菌群分析。已有的研究表明人的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、擬桿菌門(Bacteroidetes division)、變形菌門[12-13]；老虎腸道優(yōu)勢細菌為厚壁菌門、梭桿菌門(Fusobacteria)、擬桿菌門[14]；健康成年川金絲猴(Rhinopithecusroxellana)糞樣菌群以厚壁菌門和擬桿菌門為主[15]；大熊貓腸道優(yōu)勢細菌為厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門[16]；本研究發(fā)現(xiàn)，3只亞成體大熊貓優(yōu)勢菌群與以往研究基本相似，主要是變形菌門和厚壁菌門，但是變形菌門比例略高于厚壁菌門。一般當環(huán)境因子改變后1個月即可形成穩(wěn)定菌群，為了結(jié)果更加準確，本實驗選擇2個月進行采樣。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3只大熊貓在剛剛回到北京動物園和飼養(yǎng)2個月后，糞便菌群基本沒有顯著差異，說明14月齡的大熊貓腸道菌群已經(jīng)基本穩(wěn)定，可以適應一定程度的環(huán)境改變。同時也說明，北京動物園提供的飼料基本滿足了其需要。乳球菌屬是唯一有顯著差異的屬，所占比例從剛回園的0.79%，2個月后上升為2.73%。乳球菌屬細菌比較常見，無致病性，是腸道內(nèi)正常菌群之一。目前經(jīng)常被用作輪狀病毒、HBV、HCV和腸道病毒等消化道病毒疫苗的新型疫苗載體[17-18]。本例中乳球菌屬比例的上升是大熊貓隨著年齡的增長，腸道菌群正常發(fā)育的表現(xiàn)，還是環(huán)境改變所造成的還值得探討。

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