張金玲，杜祎，高廣恒，趙曉華，張利群，朱思榮，史建國，畢春元

(山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

黃曲霉毒素是由黃曲霉菌屬的黃曲霉、特曲霉和寄生曲霉等產(chǎn)生的一類代謝產(chǎn)物，主要存在于霉變的玉米、花生中，天然污染產(chǎn)生的黃曲霉毒素以AFB1最為多見[1-3]。因AFB1具有極強(qiáng)的毒性和致癌性，國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761—2011[4]對玉米中黃曲霉毒素B1的限量指標(biāo)規(guī)定為20 μg/kg以內(nèi)。因此，研究食品中黃曲霉毒素的檢測方法具有重要意義。

目前，黃曲霉毒素B1的檢測方法主要有薄層層析法、免疫親和柱熒光光度法、高效液相色譜法及酶聯(lián)免疫吸附法等[5-12]。高效液相色譜法測定結(jié)果準(zhǔn)確，但是使用儀器昂貴，測定成本高；上述其他三種方法均不能對黃曲霉毒素B1進(jìn)行專一性測定，且人為操作對結(jié)果的影響較大，準(zhǔn)確率低。本研究采用醋酸纖維素載體膜制備固定化黃曲霉氧化酶酶膜，建立了流動注射酶電極生物傳感器分析方法，對玉米中黃曲霉毒素B1進(jìn)行測定，結(jié)果表明，該方法具有專一性好、準(zhǔn)確度高、測定成本低等特點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

SBA-黃曲霉毒素B1生物傳感分析儀(山東省科學(xué)院生物研究所)；玉米(高密某村購買),黃曲霉毒素氧化酶(山東省科學(xué)院生物研究所)；黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)；牛血清白蛋白、戊二醛(上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站進(jìn)口分裝)；“O”型空圈、SBA專用緩沖液(山東省科學(xué)院生物研究所)；醋酸纖維膜(孔徑0.2 mm，美國Nucleopore公司)；鉑金電極(山東省科學(xué)院生物研究所)；Waters e2695高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；其他試劑均為分析純。所用水為蒸餾水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 黃曲霉毒素氧化酶電極的制備

首先將“O”型空圈與醋酸纖維膜粘在一起做成載體膜，然后將黃曲霉毒素氧化酶與戊二醛交聯(lián)，固定化于載體膜上，獲得黃曲霉毒素氧化酶酶膜，進(jìn)一步將其安裝在鉑金電極上獲得黃曲霉毒素氧化酶電極。

2.2 反應(yīng)原理

將黃曲霉毒素氧化酶與H2O2電極組成電流型電化學(xué)酶電極。當(dāng)含有黃曲霉毒素的樣品經(jīng)流動注射系統(tǒng)流經(jīng)該電極時(shí)，會在電極上發(fā)生如下反應(yīng)：

過氧化氫在電極上產(chǎn)生電流：

此電流大小與黃曲霉毒素的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 溶液的配制

2.3.1 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液的配制

取適量黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品放入稱量瓶中，于104 ℃烘箱內(nèi)烘4 h，然后在干燥器內(nèi)冷卻；準(zhǔn)確稱取0.100 0 mg黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水在100 mL燒杯中溶解，并全部轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶，定容備用。

2.3.2 黃曲霉毒素B1待測樣品溶液的配制

取待測玉米樣品適量，打碎，過20目篩。準(zhǔn)確稱取20.0 g處理后玉米樣品于250 mL具塞錐形瓶中，加入70%甲醛水溶液100 mL，將瓶塞蓋緊，水封，震蕩10 min，超聲波萃取15 min，2 000 r/min離心5 min，取20 mL上清液備用。

2.4 黃曲霉毒素樣品的測定

2.4.1 儀器定標(biāo)

選擇具有流動注射功能的SBA-黃曲霉毒素B1生物傳感分析儀，在反應(yīng)池內(nèi)安裝黃曲霉毒素B1氧化酶電極，緩沖液為0.2 mol/L、pH=7.2的磷酸鹽溶液。接通電源后運(yùn)行儀器，系統(tǒng)自動清洗反應(yīng)池，隨后自動進(jìn)行定標(biāo)、測定操作。通過控制機(jī)械手吸取2.3.1所配制黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液對儀器進(jìn)行定標(biāo)，采用差分計(jì)數(shù)法，當(dāng)溶液流經(jīng)反應(yīng)池時(shí)開始計(jì)時(shí)，4 s為一個(gè)計(jì)時(shí)周期，計(jì)時(shí)結(jié)束后儀器自動記錄酶電極對標(biāo)準(zhǔn)液的響應(yīng)值；重復(fù)該過程直到儀器提示定標(biāo)通過。

2.4.2 酶電極對黃曲霉毒素B1測定的穩(wěn)定性

在SBA-黃曲霉毒素B1生物傳感分析儀的樣品盤內(nèi)，放入10只盛有2.3.1所配制黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液的樣品管進(jìn)行測試，計(jì)算酶電極對黃曲霉毒素B1測定的精密度。

2.4.3 酶電極對黃曲霉毒素B1測定的線性性

參照2.3.1的方法，分別準(zhǔn)確配制濃度為20、40、60、80、100 μg/L的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液，依次放入SBA-黃曲霉毒素生物傳感分析儀樣品盤1～5樣品管位測試，觀察儀器對黃曲霉毒素B1測定的線性情況。

2.4.4 酶電極對黃曲霉毒素B1測定的加標(biāo)回收率

參照2.3.2的方法配制玉米樣品待測溶液，在SBA-黃曲霉毒素生物傳感分析儀樣品盤1～5位樣品管內(nèi)分別加入500 mL待測樣品，然后依次加入500 mL濃度為20、40、60、80、100 μg/L的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液測試，觀察儀器對黃曲霉毒素B1測定的加標(biāo)回收情況。

2.4.5 酶電極法對玉米中黃曲霉毒素B1的檢測

根據(jù)2.3.2的方法制備玉米待測樣品，放入樣品盤1～3位，用2.3.1所配制的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液對SBA-黃曲霉毒素B1生物傳感分析儀進(jìn)行定標(biāo)，記錄測定結(jié)果。

2.4.6 高效液相色譜法對玉米中黃曲霉毒素B1的檢測

3 結(jié)果與分析

3.1 酶電極對黃曲霉毒素B1測定的穩(wěn)定性

在SBA-黃曲霉毒素生物傳感分析儀的反應(yīng)池內(nèi)安裝黃曲霉毒素氧化酶電極，緩沖液為0.2 mol/L、pH=7.2的磷酸鹽溶液。接通電源后運(yùn)行儀器并定標(biāo)，在樣品盤內(nèi)放入10只盛有2.3.1所配制的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液的樣品管進(jìn)行測試，酶電極對黃曲霉毒素的測定結(jié)果見表1。

表1 黃曲霉毒素B1氧化酶電極對黃曲霉毒素B1的測定結(jié)果Table 1 Determination of aflatoxin B1 by aflatoxin B1 oxidase electrode

由表1可見，黃曲霉毒素氧化酶電極對黃曲霉毒素B1具有很好的穩(wěn)定性，精密度為1.20%。

3.2 酶電極對黃曲霉毒素B1測定的線性性

參照2.3.1的方法分別準(zhǔn)確配制濃度為20、40、60、80、100 μg/L的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液，依次放入SBA-黃曲霉毒素生物傳感分析儀樣品盤1～5樣品管位測試，酶電極對黃曲霉毒素B1的測定結(jié)果見圖1。

圖1 黃曲霉毒素氧化酶電極對黃曲霉毒素B1的響應(yīng)Fig. 1 Response of aflatoxin oxidase electrode to aflatoxin B1

由圖1可見，黃曲霉毒素氧化酶電極對黃曲霉毒素B1的響應(yīng)在0 ～100 μg/L呈現(xiàn)很好的線性性，線性方程為y=1.008 9x-0.942 9，R2=0.999 6。

3.3 酶電極對黃曲霉毒素B1測定的加標(biāo)回收率

參照2.3.2的方法配制玉米樣品待測溶液，在SBA-黃曲霉毒素生物傳感分析儀樣品盤1～5位樣品管內(nèi)分別加入500 mL待測樣品，然后依次加入500 mL濃度為20、40、60、80、100 μg/L的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液測試，酶電極對黃曲霉毒素的測定結(jié)果見表2。

表2 黃曲霉毒素B1氧化酶電極對黃曲霉毒素B1的測定結(jié)果Table 2 Experimental results of recovery rate of aflatoxin B1 by standard addition

由表2可見，黃曲霉毒素氧化酶電極對黃曲霉毒素B1的加標(biāo)回收率為96%～102.4%。

3.4 酶電極法對玉米中黃曲霉毒素B1的檢測

根據(jù)2.3.2的方法制備玉米待測樣品，放入樣品盤1～3位，用2.3.1所配制的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液對SBA-黃曲霉毒素B1生物傳感分析儀進(jìn)行定標(biāo)，測定結(jié)果如表3所示。

表3 對玉米中黃曲霉毒素B1含量的測定結(jié)果Table 3 Determination of aflatoxin B1 content in corn

3.5 高效液相色譜法對玉米中黃曲霉毒素B1的檢測

在2.4.6條件下測定2.4.5所測定的同一種玉米樣品中黃曲霉毒素B1含量，測定結(jié)果如圖2、3所示。

圖2 高效液相色譜法測定黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品圖譜Fig.2 Determination of aflatoxin B1 standard by HPLC

圖3 高效液相色譜法測定玉米樣品中黃曲霉毒素B1的圖譜Fig.3 Determination of aflatoxin B1 in corn by HPLC

由圖2～3可以看出，高效液相色譜測定玉米樣品中黃曲霉毒素B1含量為13.781 μg/L，比酶電極法測定結(jié)果高。酶電極法是對黃曲霉毒素B1進(jìn)行專一性測定，而高效液相色譜法無法避免假陽性帶來的影響，因此測定結(jié)果偏高。

4 結(jié)論

本文提供了一種采用酶電極法測定玉米中黃曲霉毒素B1含量的快速分析方法，該方法測試了線性、精密度和回收率等指標(biāo)，分析方法線性良好，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 6，精確度為1.20%，加標(biāo)回收率在96%～102.4%之間。同時(shí)采用高效液相色譜法進(jìn)行同種樣品測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酶電極法可以避免假陽性對黃曲霉毒素B1測定結(jié)果的影響，適用于玉米中黃曲霉毒素B1的檢測。

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