王香君，李夢茹，段杉

1(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，四川 南充，637000)2(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州，510642) 3(美國英狄士化學(xué)公司廣州代表處，廣東 廣州，511430)

自然界中僅有不到1%的微生物可培養(yǎng)，因此傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)微生物的平板計(jì)數(shù)法無法對環(huán)境中微生物作出準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。目前已有多種不依賴培養(yǎng)的微生物計(jì)數(shù)方法出現(xiàn)，主要包括用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)和通過測定微生物的核酸含量計(jì)數(shù)。采用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)須先用熒光染料對微生物細(xì)胞染色，然后用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，該法需要昂貴的儀器，且不同大小和類型的細(xì)胞產(chǎn)生的信號不同，進(jìn)樣速度的差異、共存的雜質(zhì)等產(chǎn)生的熒光信號等都會對計(jì)數(shù)結(jié)果產(chǎn)生影響。而通過測定環(huán)境中微生物的核酸(基因組DNA或RNA)濃度，以核酸濃度反映環(huán)境中微生物的數(shù)量的分子生物學(xué)方法，具有分析速度快、不依賴于培養(yǎng)等特點(diǎn)，克服了平板計(jì)數(shù)法的缺點(diǎn)。其中FQ-PCR技術(shù)通過PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA和真菌18S rDNA的基因序列來定量微生物，具有操作簡便、靈敏度和特異性高等優(yōu)點(diǎn)。

國內(nèi)外已有多篇關(guān)于采用FQ-PCR法測定微生物數(shù)量的報(bào)道，例如CASTILLO等[1]用FQ-PCR對大腸桿菌(Escherichiacoli)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線用于定量豬肉消化道中所有細(xì)菌，結(jié)果表明，F(xiàn)Q-PCR測出的細(xì)菌數(shù)比平板計(jì)數(shù)法高；YAMAMOTO等[2]和AL-GABR等[3]用FQ-PCR分別對土曲霉(Aspergillusterreus)和黑曲霉(Aspergillusniger)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別用于定量空氣和飲水中的所有真菌，發(fā)現(xiàn)用FQ-PCR得到的真菌數(shù)比平板計(jì)數(shù)法高1～2個(gè)數(shù)量級。然而，上述研究均未對所采用的引物的特異性、擴(kuò)增效率等進(jìn)行研究，其定量的準(zhǔn)確性及所用引物和擴(kuò)增條件是否能夠普遍適用于各種環(huán)境條件下的微生物定量尚存疑問。WU等[4]歸納了多對擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA和真菌18S rDNA通用引物，但這些細(xì)菌和真菌通用引物是否適用于FQ-PCR定量多種微生物尚待研究。

本研究選取多種常見的革蘭氏陽性及陰性細(xì)菌、絲狀真菌和酵母，以其DNA為模板，對國內(nèi)外報(bào)道的幾種常見細(xì)菌16S rDNA和真菌18S rDNA通用引物在FQ-PCR反應(yīng)中的特異性、擴(kuò)增效率進(jìn)行評估，確定最恰當(dāng)?shù)囊?，并?yōu)化擴(kuò)增條件，在此基礎(chǔ)上對發(fā)酵過程中魚露和蝦油的細(xì)菌和真菌數(shù)量的變化進(jìn)行測定。

1 材料與方法

1.1 原料和菌種

1.1.1 原料

制作魚露的原料來自陽江市海陵島，包括6種新鮮小雜魚，其所占質(zhì)量百分比分別是雙斑瓦鰈2.3%，短尾大眼鯛5.2%，翼紅娘魚5.4%，鲬6.3%，眶棘雙邊魚80.8%，用塑料袋密封包裝后存放在溫度為-20 ℃的冰箱中。

制作蝦油的原料南美白對蝦(PenaeusvannameiBoone)蝦頭和蝦殼由陽江市海達(dá)水產(chǎn)有限公司提供，用塑料袋密封包裝后存放在溫度為-20 ℃的冰箱中。

1.1.2 菌種

細(xì)菌：嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、假單胞菌(Pseudomonassp.)、不動桿菌(Acinetobactersp.)，菌株均來自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

真菌：釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、青霉(Penicilliumsp.)、曲霉(Aspergillussp.)，菌株均來自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

核酸蛋白檢測儀，德國Eppendorf公司；BioRad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，BIO-RAD公司。

ZR Fungal/Bacterial DNA Kit，ZYMO RESEARCH；Bester?SybrGreen qPCR Mastermix，DBI?Bioscience；引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(簡稱生工)合成(見表1和表2)。

1.3 研究方法

1.3.1 魚露樣品的制備

將小雜魚于室溫解凍后，與食鹽按3∶1的質(zhì)量比混勻，然后置于35 ℃的恒溫箱中發(fā)酵。發(fā)酵過程中定期補(bǔ)加蒸發(fā)的水分以保持鹽度恒定(25%，w/w)。定期取樣，對其微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)。

表1 細(xì)菌通用引物Table 1 Bacterial universal primers

1.3.2 蝦油樣品的制備

將蝦頭蝦殼于室溫解凍后，用攪碎機(jī)絞碎，加入原料質(zhì)量的5% NaCl混勻，裝入燒杯中，再放于45 ℃水浴鍋中，80 r/min保溫自溶4 h。自溶完畢后，取出用200目尼龍紗布過濾，得自溶液并測定其鹽度，再補(bǔ)加NaCl，使自溶液的NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到25%，并將自溶液放入35 ℃培養(yǎng)箱中，待其發(fā)酵成熟后，進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。

1.3.3 魚露和蝦油中微生物計(jì)數(shù)

分別采用平板計(jì)數(shù)法和FQ-PCR法對魚露和蝦油中微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.3.1 平板計(jì)數(shù)法

按GB 4789.2—2010方法稍作改進(jìn)，在細(xì)菌培養(yǎng)基(PCA固體培養(yǎng)基)的基礎(chǔ)上添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%和10%的NaCl，對能在0%和10%鹽度下生存的細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)；在真菌培養(yǎng)基(PDA固體培養(yǎng)基)基礎(chǔ)上添加0%和20% NaCl，對能在0%和20%鹽度下生存的真菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)菌和真菌數(shù)量的單位是lg CFU/mL。

1.3.3.2 FQ-PCR法

(1)各菌種DNA的提?。簩⑹人崛闂U菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、假單胞菌、不動桿菌、釀酒酵母、青霉、曲霉分別擴(kuò)大培養(yǎng)(嗜酸乳桿菌用MRS肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)，金黃色葡萄球菌用PCA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，假單胞菌用Pseudomonas液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，大腸桿菌用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，不動桿菌用MM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，釀酒酵母用麥芽汁液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，青霉用PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，曲霉用PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng))，再用ZR Fungal/Bacterial DNA 提取試劑盒(操作方法見說明書)提取各菌種DNA，通過核酸蛋白檢測儀測定DNA濃度，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)魚露和蝦油樣品中微生物總DNA的提?。簩l(fā)酵的魚露和蝦油在無菌條件下先用快速濾紙過濾掉粗顆粒后，分別用離心和過膜的方法分離菌體。離心條件為12 000 r/min離心3 min；過膜條件為用0.22 μm濾膜過濾菌體，然后用無菌水將濾膜上的菌體洗下來。用ZR Fungal/Bacterial DNA Kit分別提取上述2種方法獲得的菌體總DNA。所有DNA樣品均于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)引物的選擇：文獻(xiàn)報(bào)道有多對通用引物用于FQ-PCR定量細(xì)菌和真菌數(shù)量，它們擴(kuò)增不同的DNA片段，常用的細(xì)菌和真菌通用引物見表1和表2。

用表1細(xì)菌通用引物擴(kuò)增相同的DNA模板(大腸桿菌)和表2真菌通用引物擴(kuò)增相同的DNA模板(青霉)，并做2次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。FQ-PCR反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Green QPCR Mix 10 μL、上下游引物(10 μmol/μL)各0.4 μL、DNA 模板2 μL、加雙蒸水至20 μL。FQ-PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性2 min；40個(gè)循環(huán)：95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，在延伸階段收集熒光信號。DNA熔解曲線分析是從65 ℃以1 ℃/min的升溫速度上升到95 ℃。同時(shí)設(shè)計(jì)陰性對照(無DNA模板)排除DNA污染，每個(gè)引物做3次平行。

(4)引物退火溫度的優(yōu)化：將(3)得到的最適的細(xì)菌和真菌通用引物進(jìn)行FQ-PCR反應(yīng)，DNA模板分別是大腸桿菌和青霉，將FQ-PCR擴(kuò)增程序的退火溫度分別設(shè)置為65、64.1、62.5、59.5、55.9、53、51和50 ℃，比較擴(kuò)增效果，每個(gè)溫度做3次平行，并做2次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

(5)單一細(xì)菌菌種和單一真菌菌種DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線：將嗜酸乳桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、假單胞菌、不動桿菌、釀酒酵母、青霉、曲霉的DNA分別用雙蒸水稀釋，使它們的DNA質(zhì)量濃度均在20～100 ng/μL之間，再進(jìn)行梯度稀釋，選擇合適的質(zhì)量濃度梯度，用(3)和(4)得到的FQ-PCR最佳反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，得到它們各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)做3次平行，每條標(biāo)曲做2次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

(6)混合細(xì)菌和混合真菌DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線：將嗜酸乳桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、假單胞菌、不動桿菌的DNA分別用雙蒸水稀釋，使它們的DNA質(zhì)量濃度均在20～100 ng /μL之間，再各取DNA稀釋液5 μL混勻，稱為“混合細(xì)菌”；將釀酒酵母、青霉、曲霉的DNA也分別用雙蒸水稀釋，使它們的DNA質(zhì)量濃度在20～100 ng /μL之間，再各取DNA稀釋液10 μL混勻，稱為“混合真菌”。并通過核酸蛋白檢測儀測定DNA質(zhì)量濃度后，將混合細(xì)菌和混合真菌分別進(jìn)行梯度稀釋，選擇合適的質(zhì)量濃度梯度，再用(3)和(4)得到的FQ-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，得到它們各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)做3次平行，每條標(biāo)準(zhǔn)曲線做2次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

(7)魚露和蝦油中細(xì)菌和真菌數(shù)量的測定：由(6)得到混合細(xì)菌和混合真菌DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)魚露和蝦油中細(xì)菌和真菌DNA擴(kuò)增曲線中的Cq值，再從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出DNA質(zhì)量濃度。由于NADKARNI等[8]和SASS等[9]報(bào)道，1個(gè)細(xì)菌細(xì)胞相當(dāng)于5 fg DNA；YAMAMOTO等[2]報(bào)道是1個(gè)真菌細(xì)胞相當(dāng)于17.5 fg DNA，因此細(xì)菌和真菌從DNA轉(zhuǎn)換成細(xì)胞數(shù)的換算數(shù)分別是5和17.5。FQ-PCR法測定魚露和蝦油中細(xì)菌和真菌數(shù)量的單位是lg個(gè)/mL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測定和分析結(jié)果采用SPSS 16.0和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果采取均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式。p<0.05認(rèn)為具有顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌和真菌FQ-PCR定量條件的確定

2.1.1 引物的選擇

用表1細(xì)菌通用引物擴(kuò)增相同的DNA模板(大腸桿菌)和表2真菌通用引物擴(kuò)增相同的DNA模板(青霉)，結(jié)果見圖1和圖2。

以不同引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA和真菌18S rDNA的不同區(qū)域，不合適的引物會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致FQ-PCR定量不準(zhǔn)確。因此引物的選擇標(biāo)準(zhǔn)是擴(kuò)增特異性高，不產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，不形成引物二聚體，同時(shí)要求得到的擴(kuò)增曲線光滑平穩(wěn)，熒光吸收圖譜的S形曲線形狀完好，以出現(xiàn)最小Cq值和最高熒光值為最佳。引物的特異性可通過分析擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線確定，特異性擴(kuò)增的熔解曲線只能有單峰，如出現(xiàn)明顯雙峰甚至多峰則屬非特異性擴(kuò)增；而陰性對照要求起峰Cq>35個(gè)循環(huán)[8]。

圖1 細(xì)菌通用引物的擴(kuò)增曲線和熔解曲線Fig.1 Amplification curve and melting curve analysis of PCR products of bacterial universal primers

圖2 真菌通用引物的的擴(kuò)增曲線和熔解曲線Fig.2 Amplification curve and melting curve analysis of PCR products of fungal universal primers

由圖1可知，引物P11P-P13P和338F-518R的擴(kuò)增曲線的平臺期不完整；引物63F-335R和515F-806R比較，63F-335R的Cq值較小和熒光值較高，擴(kuò)增曲線呈平穩(wěn)光滑的S形，且熔解曲線只有單峰，CASTILLO等[1]選擇引物63F-335R用FQ-PCR成功定量了豬肉消化道中的細(xì)菌，因此選用63F-335R作為FQ-PCR測定細(xì)菌數(shù)量的引物。由圖2可知，真菌引物NS1-NS2和NS5-NS6出現(xiàn)明顯雙峰，引物P1-P2和0817F-1536R出現(xiàn)微弱雙峰，而引物0817F-1196R熔解曲線只有單峰，同時(shí)擴(kuò)增曲線也是呈平穩(wěn)光滑的S形完整曲線，擴(kuò)增效果較好，因此選用0817F-1196R為FQ-PCR定量測定真菌數(shù)量的引物。

2.1.2 引物的退火溫度

為確定引物63F-335R和0817F-1196R的退火溫度，由生工合成的表1和表2中引物的參考熔解溫度Tm范圍為55～70 ℃，而文獻(xiàn)報(bào)道引物的退火溫度要低于熔解溫度Tm5 ℃左右，因此將FQ-PCR擴(kuò)增程序的退火溫度分別設(shè)置為65、64.1、62.5、59.5、55.9、53、51和50 ℃，擴(kuò)增結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 引物63F-335R溫度梯度的擴(kuò)增曲線和熔解曲線Fig.3 Amplification curve and melting curve analysis of annealing temperature produced by FQ-PCR with primer 63F-335R

圖4 引物0817F-1196R溫度梯度的擴(kuò)增曲線和熔解曲線Fig.4 Amplification curve and melting curve analysis of annealing temperature produced by FQ-PCR with primer 0817F-1196R

引物退火溫度以引物得到的熔解曲線中熔解峰有最高的峰值、最窄的峰型以及擴(kuò)增曲線有最小的Cq值為最佳。圖3顯示，引物63F-335R在59.5 ℃得到的熔解峰峰值較高、峰型較窄，同時(shí)通過結(jié)合CASTILLO[1]關(guān)于引物63F-335R的退火溫度為60 ℃的報(bào)道，確定引物63F-335R的退火溫度為60 ℃。報(bào)道中顯示的引物0817F-1196R的退火溫度有所不同，退火溫度范圍為48～58 ℃。圖4顯示引物0817F-1196R在59.5 ℃得到的熔解峰峰值較高、峰型較窄、Cq值最小，由于適當(dāng)提高退火溫度有利于提高FQ-PCR反應(yīng)的特異性，因此選擇與59.5 ℃最接近的60 ℃為引物0817F-1196R的退火溫度。

2.2 細(xì)菌和真菌的FQ-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

線性擴(kuò)增要符合如下標(biāo)準(zhǔn)：FQ-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)R2>0.98；PCR擴(kuò)增效率(E)在90%～120%范圍內(nèi)[10-11]。RODRIGUEZ等[12]報(bào)道，F(xiàn)Q-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)R2越接近1、擴(kuò)增效率越接近100%、斜率越接近-3.322，結(jié)果可信度越高。

2.2.1 單一細(xì)菌菌種DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用引物63F-335R和60 ℃退火溫度分別對嗜酸乳桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、假單胞菌、不動桿菌的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。

圖5 幾種細(xì)菌菌種DNA擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curves constructed after FQ-PCR amplification of serial dilutions of DNA of many bacterial strains

圖5顯示，每種細(xì)菌DNA的擴(kuò)增符合線性擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線都有良好的線性關(guān)系，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，說明引物63F-335R適合對細(xì)菌進(jìn)行FQ-PCR定量分析。

2.2.2 單一真菌菌種DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用引物0817F-1196R和60 ℃退火溫度分別擴(kuò)增釀酒酵母、青霉、曲霉的DNA，獲得各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6。

圖6 幾種真菌菌種DNA擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curves constructed after FQ-PCR amplification of serial dilutions of DNA of many fungal strains

圖6顯示，釀酒酵母、青霉、曲霉的DNA擴(kuò)增效果良好綜合圖5和圖6結(jié)果顯示，細(xì)菌通用引物63F-335R和真菌通用引物0817F-1196R對單一菌種的擴(kuò)增效果較好。

2.2.3 混合細(xì)菌和混合真菌DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線

將混合細(xì)菌和混合真菌DNA分別進(jìn)行FQ-PCR擴(kuò)增，得到它們的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖7和圖8。

圖7 混合細(xì)菌DNA的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Amplification curve and standard curve constructed after FQ-PCR amplification of serial dilutions of mixed bacterial DNA注：標(biāo)準(zhǔn)曲線中混合細(xì)菌DNA濃度從大到小分別為 7×107、7×106、7×105、7×104、7×103 fg/μL。

圖7和圖8顯示，混合細(xì)菌和混合真菌DNA的擴(kuò)增效果良好，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線都有很好的線性關(guān)系，沒有非特異擴(kuò)增。

圖8 混合真菌DNA的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 Amplification curve and standard curve constructed after FQ-PCR amplification of serial dilutions of mixed fungal DNA 注：標(biāo)準(zhǔn)曲線中混合真菌DNA質(zhì)量濃度從大到小分別為9×105、9×104、9×103、9×102、9×101 fg/μL。

由圖5和圖6可知，不同的細(xì)菌和真菌DNA擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)R2、擴(kuò)增效率和斜率都有所差異，通過SPSS分析可知，本文G+中嗜酸乳桿菌和金黃色葡萄球菌DNA擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與G-(大腸桿菌、假單胞菌、不動桿菌)均有顯著差異(p<0.05)，而G+和G-組內(nèi)的細(xì)菌之間沒有顯著差異，真菌中酵母與霉菌(青霉、曲霉)均存在顯著差異(p<0.05)。魚露和蝦油等自然發(fā)酵產(chǎn)品中多種細(xì)菌和真菌共存，且在發(fā)酵不同階段各種細(xì)菌、真菌的組成和數(shù)量會有波動。以僅含有一種細(xì)菌或真菌的DNA為模板擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線為標(biāo)準(zhǔn)可能比用混菌的DNA為模板的要低，而用混合菌株做標(biāo)準(zhǔn)曲線更趨近于真實(shí)情況，而本研究混合細(xì)菌和混合真菌即使在低濃度模板擴(kuò)增都能得到良好的線性關(guān)系，試驗(yàn)重復(fù)性好，靈敏度高，因此本文選擇混合細(xì)菌和混合真菌DNA擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線去測定魚露和蝦油中細(xì)菌和真菌數(shù)量。細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.155x+33.220、R2=0.999；真菌標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.395x+32.671、R2=0.998。

本研究結(jié)果表明并非所有細(xì)菌和真菌通用引物都可用于FQ-PCR定量微生物，不合適的引物會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增、擴(kuò)增曲線不完整等結(jié)果，影響定量。而細(xì)菌通用引物63F-335R和真菌通用引物0817F-1196R無論對單一菌種或混合菌種，所得FQ-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)R2均>0.98，擴(kuò)增效率E均在90%～120%范圍內(nèi)，均符合線性擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)，可用于FQ-PCR定量。因此可以將FQ-PCR用于魚露、蝦油中微生物的定量研究。

2.3 FQ-PCR計(jì)數(shù)法及平板計(jì)數(shù)法的結(jié)果比較

采用FQ-PCR法用上述條件測定了蝦油中的細(xì)菌數(shù)量以及魚露發(fā)酵過程中細(xì)菌和真菌數(shù)量的變化，同時(shí)與平板計(jì)數(shù)法的結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果見圖9。

圖9 平板計(jì)數(shù)法和FQ-PCR法定量魚露和蝦油中細(xì)菌和真菌的結(jié)果比較以及魚露發(fā)酵過程中細(xì)菌和真菌數(shù)量的變化Fig.9 Comparison of the results of bacterial and fungal populations in fish sauce and shrimp sauce determined by plate count method and FQ-PCR method, and detection of the change of bacterial and fungal populations in fish sauce during fermentation

圖9顯示，經(jīng) SPSS軟件方差分析，F(xiàn)Q-PCR法和平板計(jì)數(shù)法比較，有極顯著性差異(p<0.01)，F(xiàn)Q-PCR法比平板計(jì)數(shù)法檢測出的魚露和蝦油的細(xì)菌總數(shù)和真菌總數(shù)高1～2個(gè)數(shù)量級，這與NADKARNI[8]和YAMAMOTO[2]的研究結(jié)果一致。用過膜方法和離心方法分離魚露和蝦油中細(xì)菌，結(jié)果顯示兩種方法分離的細(xì)菌數(shù)量有顯著性差異(p<0.05)，且過膜方法的結(jié)果略高，推測可能是由于魚露及蝦油的鹽分較高，密度較大，離心不能將微生物完全沉淀下來，用過膜的方法得到的結(jié)果較準(zhǔn)確。蝦油中細(xì)菌的平板計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，10%鹽度培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)比0%鹽度培養(yǎng)基的低1～2個(gè)數(shù)量級，因此沒有將10%鹽度的結(jié)果列出。在魚露的真菌培養(yǎng)中，在0%鹽度PDA培養(yǎng)基上基本無真菌生長，在20%鹽度的培養(yǎng)基上經(jīng)過一周左右時(shí)間有極少數(shù)真菌生長，因此沒有將魚露真菌培養(yǎng)的結(jié)果列出。

在魚露發(fā)酵過程中，用FQ-PCR方法檢測到魚露發(fā)酵過程中真菌數(shù)量雖略有增加，但一直在50 個(gè)/mL以下；而在平板計(jì)數(shù)法中，0%鹽度PDA培養(yǎng)基上基本無真菌生長，在20%鹽度的培養(yǎng)基上經(jīng)過1周左右時(shí)間有極少數(shù)真菌生長，推測可能是魚露含有25%的鹽度，在這種環(huán)境下生存的真菌難以在無鹽的培養(yǎng)基上生長。國外研究在魚露發(fā)酵過程中用平板計(jì)數(shù)法也幾乎檢測不到真菌，與本研究的結(jié)果一致[13-14]。用FQ-PCR方法檢測到魚露發(fā)酵過程中細(xì)菌數(shù)量在3.16×104～3.16×105個(gè)/mL范圍內(nèi)變動，數(shù)量遠(yuǎn)高于真菌數(shù)。這說明在魚露發(fā)酵過程中真菌作用較小。許多文獻(xiàn)報(bào)道一些耐鹽或嗜鹽的乳酸菌是發(fā)酵魚產(chǎn)品中的優(yōu)勢菌群。

FQ-PCR的結(jié)果能很好地反映魚露發(fā)酵過程中細(xì)菌數(shù)量的變化規(guī)律，魚露發(fā)酵初期細(xì)菌數(shù)較高，可能是魚體表面及胃腸道、魚鰓等部位有一些不耐鹽的微生物尚未死亡，但是隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，這些不耐鹽的微生物逐漸死亡，而在發(fā)酵過程中耐鹽和嗜鹽微生物逐漸成為優(yōu)勢菌，后期逐漸趨于穩(wěn)定。

3 結(jié)論

研究表明，F(xiàn)Q-PCR法可以有效定量魚露和蝦油中細(xì)菌和真菌數(shù)量，且測得的數(shù)據(jù)比平板計(jì)數(shù)法高1～2個(gè)數(shù)量級。

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