樊雙喜，鐘其頂，黃占斌，楊彤輝

1 (中國礦業(yè)大學(北京) 化學與環(huán)境工程學院，北京，100083) 2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015) 3(全國食品發(fā)酵標準化中心，北京，100015)

葡萄酒的品質主要取決于釀酒葡萄，由于葡萄種植具有比較明顯的區(qū)域性特征，葡萄產(chǎn)地的氣候和土壤等生態(tài)環(huán)境同樣也會影響葡萄酒質量[1]。地理標志是目前國際上通行的對酒類產(chǎn)品進行管理的辦法，用于突出某一葡萄酒產(chǎn)地的特點，防止假冒偽劣葡萄酒產(chǎn)品。經(jīng)過多年的發(fā)展，我國對昌黎、沙城以及昌吉實施了原產(chǎn)地域產(chǎn)品/地理標志產(chǎn)品保護[2]。然而，據(jù)報道，在中國葡萄酒行業(yè)存在許多利益驅動的虛假產(chǎn)地葡萄酒欺詐事件，例如通過舊瓶裝新酒、仿造酒標等手段冒充具有高價值產(chǎn)區(qū)的葡萄酒[3]，嚴重損害了中國葡萄酒市場的聲譽。因此，迫切需要開發(fā)能夠準確驗證葡萄酒原產(chǎn)地的技術[4]。

目前用于原產(chǎn)地葡萄酒分析的方法較多，例如氣相色譜(GC)與質譜(MS)聯(lián)用[5-6]、高效液相色譜法(HPLC)[7-8]、電感耦合等離子體質譜儀(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)[9-11]、近紅外線(near infra-red，NIR)和中紅外線(middle infra-red，MIR)光譜[12-14]、穩(wěn)定同位素[15-18]、核磁共振光譜(nuclear magnetic resonance，NMR)[19]，以及以上不同方法的組合[20-23]。利用葡萄酒特征組分(香氣、類黃酮、有機酸、氨基酸、多酚、無機元素、同位素等)和多元統(tǒng)計分析技術結合，能夠實現(xiàn)葡萄酒產(chǎn)地、品種和年份的判別。然而，特定特征組分檢測技術在當代的食品安全與質量檢測中具有一定的局限性，比如食品中蓄意摻假物質的手段層出不窮，尤其對于某些未知化學結構的添加物的樣品，無法通過對特定目標化合物的定向檢測達到區(qū)分的目的[24]。相對于目標檢測技術而言，非目標檢測技術經(jīng)過多年的發(fā)展，已經(jīng)在食品及原料的溯源分析、摻假檢測等相關領域進行了比較深入的研究。非目標檢測技術是以樣品的整體化學或生物學信息為基礎，通過分析化學、細胞和分子生物學等技術手段與多元統(tǒng)計學相結合來綜合評判與分析食品特征[25]，其中多元統(tǒng)計分析手段主要包括主成分分析(principal component analysis, PCA)、線性判別(linear discrimination analysis, LDA)、聚類分析(cluster analysis, CA)、偏最小二乘法 ( partial least squares, PLS)、正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)、K臨近算法(k-nearest neighbors, KNN)、神經(jīng)網(wǎng)絡(artificial neural networks, ANN)等。

非目標一維核磁共振氫譜(1H NMR)技術作為一種快速、簡單、無損檢測方法，在葡萄酒產(chǎn)地驗證以及特征分析領域顯得越來越重要[19,26]。本研究首次采用非目標指紋圖譜(1H NMR)結合PCA和LDA多元統(tǒng)計分析手段，初步建立了沙城、昌黎和昌吉三大特色原產(chǎn)地葡萄酒的驗證模型，探討了以非目標1H NMR技術實現(xiàn)葡萄酒原產(chǎn)地溯源的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所有葡萄酒樣品均由企業(yè)提供。2010～2015年，從沙城、昌黎和昌吉葡萄酒原產(chǎn)地不同葡萄酒企業(yè)共收集224個葡萄酒樣品，其中沙城101個(赤霞珠26個、玫瑰蜜9個、蛇龍珠15個、白玉霓 29個、龍眼 21個、霞多麗1個)，昌黎60個(赤霞珠49個、玫瑰蜜2個、蛇龍珠9個)，昌吉63個(赤霞珠44個、霞多麗6個、蛇龍珠9個、雷司令2個、味兒多和西拉各1個)。所有葡萄酒樣品均存放在4 ℃冰箱避光冷藏。葡萄酒樣品均為單一葡萄品種，沒有混合其他葡萄品種。所有收集的葡萄酒樣品均符合沙城、昌黎和昌吉葡萄酒地理標志產(chǎn)品國家標準的規(guī)定[2]。

1.2 儀器與試劑

疊氮化鈉(超級純，NaN3, Merck, Germany)；3-(三甲基硅基)氘代丙酸鈉(TSP)和KH2PO4(98%，Merck, Germany)；重水(D2O，98%，Merck, Germany)；NaOH和HCl(99%，Sigma-Aldrich，USA)；核磁共振波譜儀(400 MHz，Bruker，Germany)；pH計 (SevenCompactTMS210，Mettler-Toledo, Switzerland)；渦流振蕩器(Biosan Ltd, Latvia)；5 mm 帶帽NMR測試管(Wilmad Labglas Inc, USA)。

1.3 樣品前處理

采用重水(D2O)，疊氮化鈉(NaN3)，0.1% 3-(三甲基硅基)氘代丙酸鈉(TSP)，1 mol/L KH2PO4配制磷酸鹽緩沖液。采用H3PO4或KH2PO4準確調節(jié)磷酸鹽緩沖液的pH值至2.0。100 μL磷酸鹽緩沖液加入900 μL葡萄酒，采用渦流振蕩器振蕩30 s 混合均勻，然后用2 mol/L 的NaOH或HCl準確調整混合物的pH值至3.0±0.02。準確取600 μL的混合物轉移到5 mm NMR測試管，測試管之后采用一維核磁共振氫譜(1H NMR)技術進行檢測。

1.4 1H NMR實驗流程及儀器參數(shù)設置

一維核磁共振氫譜(1H NMR)檢測一般實驗流程包括調諧和匹配、溫度控制、鎖定、勻場、選擇序列、參數(shù)設置以及最后樣品檢測。其中調諧和匹配、溫度控制、鎖定及勻場過程均可實現(xiàn)高度自動化，操作簡單。儀器實驗條件設置：檢測溫度(300±0.2) K。采用5 mm1H/D 探頭，1H NMR的共振頻率為400.27 MHz，Bruker Top Spin 2.1軟件用于1H NMR圖譜數(shù)據(jù)的采集, 檢測信號時間3.984 6 s，延遲時間4.0 s，每次自由感應衰減掃描次數(shù)為16，空掃描次數(shù)為4，譜寬15.1 ppm，采樣點數(shù)為65 536 (64 K)，譜線加寬因子為0.3 Hz。以3-(三甲基硅基)氘代丙酸鈉(TSP，δ=0)作為內標，化學位移的單位(ppm)。標準的脈沖序列(NOESYGPPS) 用于乙醇 (δ=1.2 ppm和3.6 ppm)和水(δ=4.8 ppm)的信號抑制，有效地減弱了水峰和乙醇峰對檢測的干擾。樣品檢測前，需要等待5 min用來平衡溫度。

1.5 多元統(tǒng)計分析

采用MestReNova 9.1軟件(Mestrelab Research S.L., MestReNova (Mnova) NMR，USA) 首先對1H NMR圖譜進行傅里葉變換，基線矯正、調整相位。然后對1H NMR圖譜峰化學位移偏移進行校正對齊，最后對圖譜進行分段積分，其值作為之后多元統(tǒng)計分析的輸入變量。為了便于數(shù)據(jù)處理，同一產(chǎn)地葡萄酒樣品分為一組。多元統(tǒng)計分析包括無監(jiān)督主成分分析(PCA)和有監(jiān)督線性判別分析(LDA)。

PCA作為多元探索性數(shù)據(jù)降維分析的第一步，根據(jù)解釋1H NMR數(shù)據(jù)集內95%方差來確定主成分矩陣。主成分得分矩陣作為LDA的輸入變量，由于主成分之間相互正交，因此可以避免1H NMR數(shù)據(jù)集里的初始變量之間高度共線性問題。LDA可以實現(xiàn)因變量組間差異的最大化，組內樣品距離的最小化, 提高模型的有效性和解析能力[27]。PCA和 LDA數(shù)據(jù)分析均由R軟件3.2.3版本[28]處理完成。PCA和LDA分析采用的R軟件具體的數(shù)據(jù)包分別是mdatools[29]和 mass[30]。PCA和LDA分析之前，所有數(shù)據(jù)由R軟件采用帕累托(Pareto)方法進行標準化。應用帕累托方法即每個變量除以其標準差(SD)的平方根，這有利于降低數(shù)據(jù)矩陣中變量具有很大的數(shù)值的相對重要性而不增加基線噪聲[31-32]。

隨后采用重復雙隨機交叉驗證[33]和留一交叉驗證方法[34],對建立的PCA/LDA模型的有效性進行驗證，均由R軟件編程完成。

2 結果與分析

2.1 1H NMR數(shù)據(jù)質量控制

所有224個葡萄酒樣品采用核磁共振一維氫譜(1H NMR)進行測定。不同產(chǎn)地之間葡萄酒樣品記錄的氫譜看起來非常相似。由于采用標準的脈沖序列(NOESYGPPS)用于水(4.8 ppm)以及乙醇(1.2 ppm, 3.6 ppm)信號壓制，葡萄酒中微量成分的信號強度得到了明顯提高。將所有葡萄酒樣品的核磁共振氫譜疊加，發(fā)現(xiàn)一些氫譜出現(xiàn)了基線較大的偏移，可能是由于水和乙醇的抑制不當，pH調節(jié)不準確，系統(tǒng)誤差或其他原因造成[35]。因此，需要對這些葡萄酒樣品進行重復測定，以保證數(shù)據(jù)質量的可靠性。

2.2 1H NMR葡萄酒主要代謝物的歸屬

在保證圖譜數(shù)據(jù)質量的基礎上，對1H NMR圖譜的主要葡萄酒代謝物/成分(氨基酸、糖、有機酸、乙醇)進行了歸屬。通過葡萄酒加入相應的化學物質標品可以進一步驗證主要代謝物的歸屬是否正確。本研究提供了一個典型中國紅葡萄酒1H NMR圖譜，并且在圖譜上給出了葡萄酒主要代謝物/成分的共振信號(見圖1)。

2.3 1H NMR圖譜峰化學位移對齊以及數(shù)據(jù)降維

圖1 一個典型的標有主要葡萄酒代謝物的中國紅葡萄酒1H NMR圖譜(其中果糖、葡萄糖和甘油信號出現(xiàn)在3～4.2 ppm高度重疊區(qū)域)Fig.1 One typical 1H NMR spectrum of a Chinese red wine with given resonance signals of the major wine metabolites/ ingredients (highly overlapped signals of fructose,glucose as well as glycerol occur in the range of 3.0-4.2 ppm)

由于樣品pH值微小的變化會造成1H NMR圖譜峰化學位移偏移[31]，本研究葡萄酒氫譜一些典型峰信號出現(xiàn)的化學位移偏移如圖2所示。

圖2 葡萄酒樣品一維核磁共振疊加氫譜化學位移在(1.95～2.05)ppm及(3.73～3.76)ppm區(qū)域對齊前后[(A)-(B)、(C)-(D)]的比較Fig.2 Comparison of raw and aligned 1H NMR spectra of wine samples: Raw (A) and aligned (C)1H NMR spectra in the region (1.95-2.05) ppm; Raw (B) and aligned (D) 1H NMR spectra in the region 3.73-3.76 ppm

適當?shù)姆寤瘜W位移偏移校正對齊對隨后的多元變量分析至關重要?；瘜W位移偏移會引起化學計量學模型樣本錯誤的分組。為了解決這一問題，至今為止已經(jīng)報道了多種峰化學位移校正對齊方法[35]。MestReNova采用的是分段對齊的方法，該方法能夠允許用戶采用交互式頁面，靈活的選擇峰化學位移校正對齊的區(qū)域。每段的平均圖譜作為參考圖譜進行對齊，依次進行下去，直到得到滿意的1H NMR圖譜。圖2-A和圖2-B采用分段對齊后的圖譜分別如圖2-C和圖2-D所示。由圖2可知，分段對齊方法較好的解決了1H NMR圖譜峰化學位移的偏移問題。在MestReNova完成1H NMR圖譜整個峰化學位移對齊以及分段積分之后，整個1H NMR圖譜被細分為多個區(qū)域，每個區(qū)域所有點的積分值累加起來可以抽象的代表整個原始圖譜[36]，這些代表性的區(qū)域積分值作為接下來建模的輸入變量，從而實現(xiàn)對每1H NMR圖譜約60 000個高共線性數(shù)據(jù)點的有效降維。

選取了0.01, 0.015, 0.02, 0.025, 0.03, 0.035 和0.04 ppm作為每個分段積分的區(qū)域寬度取值，結果表明0.02 ppm能夠保持足夠的數(shù)據(jù)分辨率和最大限度地減少圖譜信息的損失。由于1H NMR中的水和乙醇信號的區(qū)域與本研究調查的問題無關，所以這些區(qū)域被排除在外。分段積分的有效區(qū)域是在0.8～9.5 ppm(其中不包含被特定脈沖序列壓制極度變形的水峰δ(H2O)=4.65～5.10 ppm) 和乙醇峰(δ(CH3)=1.05～1.21 ppm,δ(CH2)=3.60～3.72 ppm)，分段積分后能夠獲得大約400個分段積分值，這些分段積分值作為之后多元統(tǒng)計分析的輸入變量。

2.4 變質葡萄酒的識別

在化學計量學數(shù)據(jù)分析之前，對所有的葡萄酒樣品進行是否變質篩查。葡萄酒樣品會由于不恰當?shù)膬Υ鏃l件以及超過葡萄酒本身的貨架期而導致變質或腐敗[36]。通過疊加所有葡萄酒樣品的核磁共振氫譜，結果發(fā)現(xiàn)一些葡萄酒樣品圖譜在2.07 ppm處的乙酸信號峰的絕對積分值明顯高于其他大多數(shù)葡萄酒樣品。因此，對這些葡萄酒樣品需要仔細檢查以發(fā)現(xiàn)潛在的變質。根據(jù)GB15037—2006規(guī)定，葡萄酒的揮發(fā)性酸的最大值為1.2 g/L。基于外部標準的PULCON(pulse-length-based concentration)[37]方法對所有葡萄酒樣品中的乙酸含量進行定量。24個葡萄酒樣品(10個赤霞珠，2個玫瑰蜜，9個蛇龍珠，3個霞多麗)乙酸含量已經(jīng)超過1.2 g/L，因此在做進一步的統(tǒng)計分析之前需要排除這些樣品。

然而GODELMANN等[37]直接刪除乙酸信號峰建模，在本研究中則是保留了乙酸信號峰(乙酸含量低于1.2 g/L)，與PAPOTTI等[38]有關于葡萄酒產(chǎn)地研究的1H NMR圖譜前處理相一致。本研究很好地保持了非目標指紋圖譜方法特點，而不是預先忽略乙酸或其他腐敗參數(shù)對結果的影響。盡管乙酸與葡萄產(chǎn)地幾乎沒有關聯(lián)，并且在隨后建立的產(chǎn)地PCA/LDA模型時發(fā)現(xiàn)，乙酸信號峰區(qū)域并沒有對產(chǎn)地的區(qū)別能力有重要貢獻。

2.5 探索性數(shù)據(jù)分析

主成分分析同時也稱主分量分析，利用降維的思想，通過線性變換把多指標轉為少數(shù)幾個綜合指標，且綜合指標不相關，這些新的綜合指標按照方差依次遞減的順序排列[39]。

將1H NMR譜圖進行峰對齊、分段積分等數(shù)據(jù)預處理操作后，將紅、白葡萄酒數(shù)據(jù)導入R數(shù)據(jù)分析軟件中，通過主成分分析，將紅葡萄酒和白葡萄酒進行區(qū)分。由主成分分析可得圖3。

圖3 沙城(SC)、昌黎(CL)和昌吉(CJ)葡萄酒樣品主成分1(PC1)和主成分2(PC2)得分圖Fig.3 The score plot of principal component 1 (PC1) and principal component 2 (PC2) for the wine samples of Shacheng, Changli and Changji

圖3初步反映了昌吉、昌黎和沙城葡萄酒樣品在PC1(Comp 1)和PC2(Comp 2)組成的二維坐標體系中的無監(jiān)督的分組情況，同時也可以得到PCA模型前兩個主成分解釋數(shù)據(jù)的方差累積貢獻率約為80%，PC1占總變量的71.28%。PC2占總變量的8.23%。同時根據(jù)Kaiser準則，方差累積貢獻率超過80%，表明PCA模型具有顯著的實際意義。通過對圖3進一步觀察發(fā)現(xiàn)，昌黎葡萄酒樣品聚集的較為分散，昌吉和沙城兩個產(chǎn)地的葡萄酒樣品區(qū)域仍然會有較大程度的重疊，結果表明PCA模型無法實現(xiàn)對葡萄酒產(chǎn)地進行區(qū)分。

2.6 線性判別分析(LDA)

為了解決PCA無法區(qū)分來自昌黎、 沙城以及昌吉產(chǎn)地的葡萄酒樣品，引入了LDA方法進行數(shù)據(jù)分析。由于1H NMR圖譜原始數(shù)據(jù)既有對分類起作用的差異變量，同時又包含了大量對分類無作用的變量，變量之間也存在高度共線性問題[40]。為了解決這一難題，本研究采用PCA所得的解釋1H NMR數(shù)據(jù)集內95.8%方差確定的相互獨立的10個主成分，作為LDA的輸入變量。通過PCA/LDA建立的線性判別函數(shù)能夠使這樣具有高維(多變量)、小樣本數(shù)據(jù)分類可視化效果最大化。由PCA/LDA線性判別函數(shù)1和2得分圖4可以看出，城葡萄酒樣品組內的離散的程度減少，組間的區(qū)分更加清晰，表明PCA/LDA模型能夠很好地對沙城、昌黎以及昌吉產(chǎn)地葡萄酒進行有效的區(qū)分。

圖4 PCA/LDA模型對昌黎(C)、昌吉(X)和沙城(S)葡萄酒樣品線性判別函數(shù)(LD 1)和線性判別函數(shù)(LD 2)得分圖Fig.4 The score plot of linear discriminant function 1 and linear discriminant function 2 of PCA/LDA for the wine samples of Changli (C), Changji (X) and Shacheng (S)

2.7 PCA/LDA模型有效性驗證

在實際數(shù)據(jù)分析過程中PCA/LDA模型通常容易產(chǎn)生過擬合現(xiàn)象，從而得到較好的分類判別效果的假象。多元統(tǒng)計模型的驗證對于任何指紋圖譜的方法的評估和評價至關重要[41]。為此本研究分別采用了內部留一交叉驗證方法和外部重復雙隨機交叉驗證來評價PCA/LDA模型分類結果的可靠性。圖5直觀解釋了兩種驗證方法的關鍵步驟。

圖5 PCA/LDA模型驗證方法Fig.5 The validation methods of PCA/LDA model

第一步采用內部留一交叉驗證的方法評價PCA/LDA模型的性能。廣泛運用的留一交叉驗證方法的原理是：假設數(shù)據(jù)集有N個樣本，隨機選取N-1個樣本作為訓練樣本，剩下的1個樣本作為測試樣本。這樣每個樣品將會被模型預測1次，因此得到的N個分類結果可以用來保守的衡量模型的分類性能。表1總結了采用內部交叉驗證的PCA/LDA模型的昌黎、沙城和昌吉葡萄酒整個數(shù)據(jù)集分類結果。

表1 內部留一交叉驗證的PCA/LDA模型對沙城、昌黎和昌吉葡萄酒整個數(shù)據(jù)集分類結果Table 1 Classification results of PCA/LDA models usinginternal leave one-out cross validation (LOOCV) forthe wines from Shacheng, Changli and Changji (entire data sets)

重復雙隨機交叉驗證主要的原理是首先將原始完整數(shù)據(jù)集采用隨機分層抽樣方式(注：本研究隨機分層重復抽樣100次)，將原始數(shù)據(jù)集分為兩部分:(1)80%數(shù)據(jù)作為訓練集用于建模；(2)20%數(shù)據(jù)作為外部驗證集用于預測。由于對整個數(shù)據(jù)集隨機外部驗證集抽樣100次，于是就得到了100個不同的外部驗證集。對這100個外部驗證集樣本正確分類率的平均值、標準偏差、中位數(shù)以及中位數(shù)的絕對標準偏差進行統(tǒng)計分析(見表2)，用這4項指標評估模型的有效性。正確分類率的平均值及中位數(shù)這2個指標數(shù)值越接近1、標準偏差以及中位數(shù)絕對標準偏差值越小，表明建立的模型正確分類能力越強。從表2可以看出，模型外部驗證集昌黎和昌吉葡萄酒樣本正確分類率的平均值和中位數(shù)均大于0.7，沙城葡萄酒樣本正確分類率的平均值和中位數(shù)均高于0.9，平均值及中位數(shù)相對應的標準偏差均較小，且3個產(chǎn)地正確分類率的平均值與中間值統(tǒng)計學上無顯著性差異(p>0.05), 以上結果表明重復雙隨機交叉驗證能夠充分表明建立的PCA/LDA模型的有效性。

表2 重復雙隨機交叉驗證外部驗證集正確分類率的平均值、標準偏差、中位數(shù)以及中間值絕對偏差Table 2 The mean, the standard deviation (SD), themedian and the median absolute deviation (MAD) ofcorrect classification rate for the external validation set ofrepeated double random cross validation

3 結論

本文探討了非目標1H NMR指紋圖譜技術結合多元統(tǒng)計分析手段對昌黎、沙城和昌吉葡萄酒產(chǎn)地驗證技術的可行性。研究結果表明，PCA/LDA模型能夠實現(xiàn)葡萄酒產(chǎn)地比較好的區(qū)分，進一步表明1H NMR指紋圖譜技術可以作為一項非常有效的驗證葡萄酒產(chǎn)地真實性手段。建立的相關非目標1H NMR指紋圖數(shù)據(jù)庫能夠推動我國葡萄酒產(chǎn)地真實性溯原制度的建立與完善，進一步保障葡萄酒市場穩(wěn)定健康發(fā)展，維護消費者的合法權益。

然而，本研究依然存在一些缺陷，例如，昌黎、沙城和昌吉收集的大多數(shù)是赤霞珠葡萄酒樣品；同時由于各大產(chǎn)地種植的葡萄品種及規(guī)模不一樣，造成了每個葡萄酒產(chǎn)地收集到的葡萄酒樣品品種及數(shù)量差別較大，這對建立產(chǎn)地識別模型提出了挑戰(zhàn)。在未來的研究中，應該收集更多具有代表性的，如不同品種、不同年份、不同產(chǎn)地且來源真實可靠的葡萄酒樣品，以保障建立一個更加真實可靠的非目標1H NMR指紋圖數(shù)據(jù)庫。

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