朱立賢，張一敏，毛衍偉，曹麗，梁榮蓉，韓明山，朱炳海，羅欣*

1(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安，271018) 2(內(nèi)蒙古科爾沁牛業(yè)有限公司，內(nèi)蒙古 通遼，028000) 3(陽信縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東 濱州，251800)

一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated proteinkinase，AMPK)屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，幾乎在所有真核生物中都有表達[1]，被稱為“中心代謝傳感器”、“能量檢查站”[2]和“細胞能荷調(diào)節(jié)器”[3]，在所有真核細胞能量平衡中均發(fā)揮關(guān)鍵作用。對其研究從醫(yī)學(xué)領(lǐng)域介導(dǎo)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]、調(diào)節(jié)營養(yǎng)成分代謝[5-6]等方面的研究逐步深入至動物宰后肌肉的生化進程[7-9]。AMPK活性與不同極限pH值牛肉的產(chǎn)生密切相關(guān)[9]。作者之一的張一敏報道AMPK活性在不同部位牛肉中差異顯著，牛柳中的AMPK活性顯著高于西冷，AMPK活性與pH值與肌糖原含量呈顯著正相關(guān)，AMPK可能通過調(diào)節(jié)糖酵解進程而影響牛肉品質(zhì)[10]。

肌肉轉(zhuǎn)化為食肉需要經(jīng)過一系列生化變化，能量代謝特別是糖酵解是其中的一個重要過程。屠宰后肌肉早期的能量代謝伴隨著pH值、溫度變化及蛋白質(zhì)變性等生化反應(yīng)，在很大程度上影響牛肉的品質(zhì)[11]。動物宰后早期pH值的變化速率與極限pH值是影響肉品最終品質(zhì)的關(guān)鍵因素[12]，宰后早期糖酵解促使乳酸不斷積累，是宰后肌肉pH值下降的主要原因[13-14]，因此糖酵解與宰后肌肉品質(zhì)密切相關(guān)。宰后早期環(huán)境溫度影響肌肉發(fā)生一系列生物化學(xué)變化，最終對肉的品質(zhì)造成不同的影響，然而其潛在的分子機制還遠未闡明。LI等[15]發(fā)現(xiàn)宰后不同溫度處理影響牛背最長肌的pH值下降速率、嫩度、顏色等品質(zhì)。而宰后早期不同溫度處理是否對牛肉AMPK活性、糖酵解過程產(chǎn)生影響尚不明確。

本研究對牛背最長肌(M.Longissimuslumborum)為研究對象， 探討不同溫度處理對牛肉中AMPK活性、糖酵解進程及肉品質(zhì)的影響，初步揭示AMPK是否參與糖酵解及牛肉品質(zhì)的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗設(shè)計

選用24月齡體重相近、性別相同的魯西黃?！廖鏖T塔爾雜交牛6頭。宰后30 min內(nèi)迅速取出背腰最長肌肉，修除皮下脂肪后，同一頭牛的每條背腰最長肌平均分割成2部分，放置在不同溫度(0、14 ℃)下至宰后10 h，每個肉塊平均分割成4部分真空包裝，在0 ℃下貯藏14 d，分別在成熟1、3、7、14 d測定各項肉品質(zhì)指標。在宰后2、4、6、8、10和24 h時間點測定24 h內(nèi)的溫度和pH值，并從不同溫度處理的每塊肉各取約10 g樣品，放入液氮中，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，用于測定AMPK活性和糖酵解指標。

1.2 儀器與試劑

MP-120便攜式pH計，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro System公司； UT-1901紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司； GL-20G-2冷凍離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；SPX-400智能型生化培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；蛋白轉(zhuǎn)印儀PS2A200，mersham。

AMPKα antibody(#2532)Cell Signaling Technology(CST)；phosphor-AMPKα(Thr172) antibody(#2531)(CST)；Anti-β-Actin Antibody(CW 0097)、HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)，北京康為世紀生物科技有限公司；肌糖原測定試劑盒、乳酸測定試劑盒、丙酮酸激酶(PK)試劑盒，南京建成科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 pH值測定

使用pH計測定肉塊的pH值，探頭深度為2 cm，測定3次，取平均值。

1.3.2 AMPK活性測定

參考張一敏[10]的方法，取-80 ℃冷凍樣品100 mg在液氮中研磨，取40 mg樣品粉末，加入400 μL裂解液(1mmol/L蛋白酶抑制劑，50 mmol/L Tris，pH 7.4，150 mmol/L NaCl，1% Triton X-100，1% sodium vanadate )，在冰浴中勻漿裂解15 min，裂解后的樣品在4 ℃ 15 000g下離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移到另一個1.5 mL離心管中，用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度為5 μg/μL。然后進行SDS-PAGE分離蛋白，電泳條件為上層5%的濃縮膠，下層12%的分離膠，電泳時間3.5～4 h(20 mA)。將凝膠置于轉(zhuǎn)印緩沖液中(20 mmol/L Tris, 192 mmol/L 甘氨酸，15%甲醇)中浸泡20 min，使用蛋白轉(zhuǎn)印儀將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印到 PVDF膜上，轉(zhuǎn)印條件為恒壓60 V，轉(zhuǎn)移2 h，轉(zhuǎn)印后的PVDF膜用在室溫條件下于封閉液中封閉2 h，用TTBS清洗，將一抗稀釋至適當濃度加到膜上，4 ℃孵育4 h，然后在TTBS中洗3次，每次15 min，加入HRP標記的二抗，室溫孵育2 h，然后用TTBS 洗3次，每次15 min，最后采用ECL方法進行熒光顯影，利用蛋白凝膠成像儀器和Vision Works LS 7.1軟件進行凝膠成像和光密度分析。

1.3.3 糖原、乳酸含量及丙酮酸激酶活性測定

糖原、乳酸含量以及丙酮酸激酶活性采用南京建成試劑公司的試劑盒進行測定，試驗具體操作和結(jié)果計算參照各試劑盒的說明進行。

1.3.4 汁液損失測定

宰后10 h時肉塊稱質(zhì)量(m1)后真空包裝，分別在貯藏成熟1、3、7、14 d打開包裝取出肉塊，用濾紙吸干肉塊表面的汁液，稱質(zhì)量(m2)。

汁液損失率/%=[(m1-m2)/m1]×100

(1)

1.3.5 剪切力測定

參考LUO等[16]學(xué)者的方法，取測完汁液損失的肉塊放入75 ℃水浴中到肉塊中心溫度70 ℃保持20 min，取出肉塊放入0～4 ℃冰箱內(nèi)12 h。用直徑為1.27 cm的空心取樣器沿肌纖維方向取肉柱，每個樣品取6個以上肉柱，用質(zhì)構(gòu)分析儀的 HDP/BSW 探頭測定肉柱剪切力值，并通過Texture Expert V1.0 軟件加以控制。每個肉塊的剪切力值為各肉柱剪切力值的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應(yīng)用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采樣LSD法進行方差分析，差異顯著水平α為0.05，差異極顯著水平α為0.01。數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 宰后早期不同溫度處理對牛背最長肌pH值的影響

不同溫度處理組牛背最長肌的宰后初始pH值差異不顯著，而在宰后4～10 h同一時間點14 ℃處理組的pH值顯著低于0 ℃處理組(p<0.05)。在宰后24 h，2個溫度處理組的極限pH值差異不顯著，在5.6～5.7之間。結(jié)果表明不同的冷卻溫度能夠改變pH值的下降速率，但是不能夠改變其下降程度。

圖1 宰后早期不同溫度處理對牛背最長肌肉溫度和pH值的影響Fig.1 Effect of different temperature during the early post- mortem on pH of beef M. Longissimus lumborum注：a，b表示不同溫度處理組同一時間點差異顯著(p<0.05)，圖3、圖4同。

2.2 宰后早期不同溫度處理對牛背最長肌AMPK活性的影響

以p-AMPK(α)蘇氨酸172位點(Thr172)磷酸化蛋白水平表征的AMPK活性如圖2所示。在宰后2、4 h時0 ℃和14 ℃處理的牛背最長肌AMPK活性，差異極顯著(p<0.01)。在宰后2 h，14 ℃的AMPK活性達到最高，在宰后4 h時，0 ℃的AMPK活性達到了最大活性值。在宰后4 h后，2個溫度處理組牛肉中AMPK活性均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。對于同一部位肉來說，溫度僅能夠影響其達到最大活性的時間點，但是不影響AMPK的最大活性值，溫度對宰后能量代謝的影響可能通過影響AMPK活性而起作用。

圖2 宰后早期0 ℃和14 ℃溫度處理牛背最長肌的AMPK活性Fig.2 The AMPK activity of beef M. Longissimus lumborum at 0 ℃ and 14 ℃ during the early post-mortem注：a，b表示不同溫度處理組同一時間點差異極顯著(p<0.01)。圖5、圖6同。

2.3 宰后早期不同溫度處理對牛背最長肌糖原含量的影響

如圖3所示，隨著宰后時間的延長，2個溫度處理組牛背最長肌糖原含量均呈現(xiàn)下降的趨，宰后6 h、8、10 h時14 ℃處理組的糖原含量顯著低于0 ℃處理組(p<0.05)，宰后冷卻溫度越高，糖原分解速率越快。宰后24 h時2個溫度處理組牛背最長肌糖原含量差異不顯著(p>0.05)。結(jié)果表明溫度能夠改變糖原分解速率，但不能改變其分解程度。

圖3 宰后早期0 ℃和14 ℃處理牛背最長肌的糖原含量Fig.3 The glycogen content of beef M. Longissimus lumborum at 0 ℃ and 14 ℃ during the early post-mortem

2.4 宰后早期不同溫度處理對牛背最長肌乳酸含量的影響

如圖4所示，2個溫度處理組牛背最長肌的乳酸含量隨著宰后時間的延長均逐漸積累增加，宰后6、8、10 h時14 ℃處理組的糖原含量顯著高于0 ℃處理組(p<0.05)，與糖原含量的結(jié)果呈負相關(guān)。宰后24 h時2個溫度處理組樣品的乳酸含量差異不顯著(p>0.05)。結(jié)果表明宰后早期不同溫度處理能夠影響牛肉中乳酸產(chǎn)生的速率。

圖4 宰后早期0 ℃和14 ℃處理牛背最長肌的乳酸含量Fig.4 The lactate content of beef M. Longissimus lumborum at 0 ℃ and 14 ℃ during the early post-mortem

2.5 宰后早期不同溫度處理對牛背最長肌丙酮酸激酶活性的影響

2個溫度處理組牛背最長肌丙酮酸激酶活性變化如圖5所示。在宰后4、6 h時不同溫度處理組丙酮酸激酶活性差異顯著(p<0.05)。不同溫度處理丙酮酸激酶活性達到最大活性時間點不同，14 ℃處理組丙酮酸激酶活性在宰后4 h達到最大活性，0 ℃的在宰后6 h達到最大活性值，最大活性值不顯著(p>0.05)。

圖5 宰后早期0 ℃和14 ℃處理牛背最長肌的酮酸激酶活性Fig.5 The pyruvate kinase activity of beef M. Longissimus lumborum at 0 ℃ and 14 ℃ during the early post-mortem

2.6 宰后早期不同溫度處理下牛背最長肌的貯藏汁液損失

如表1所示，在宰后1 d時14 ℃處理組牛背最長肌的汁液損失顯著低于0 ℃處理組(p<0.05)，在宰后3、7、14 d時2個處理組的牛肉汁液損失差異不顯著，但14 ℃處理組有降低的趨勢。成熟時間對宰后早期同一溫度處理牛肉的貯藏汁液損失有顯著的影響(p<0.05)，隨著成熟時間的延長，貯藏汁液損失增加。肌肉的貯藏汁液損失與僵直過程中肌纖維收縮與其收縮程度有關(guān)[17]，僵直期間肌肉纖維收縮與溫度密切相關(guān)，僵直前期肌肉在14～20 ℃下放置所發(fā)生的收縮量最小，大約只有10%，在0～10 ℃低溫下發(fā)生收縮的程度能達到正常肌節(jié)長度的50%[18]，這可能是14 ℃處理組牛肉汁液損失顯著低于0 ℃處理組的原因。

表1 宰后早期不同溫度處理下牛背最長肌的貯藏汁液損失Table1 The purge loss of beef M. Longissimus lumborumat different temperature

注：a，b表示不同溫度處理組肉在同一宰后貯藏時間汁液損失差異顯著(p<0.05)。

2.7 不同溫度處理下牛背最長肌的剪切力值

如圖6所示，宰后早期不同溫度對牛背最長肌剪切力值的影響差異顯著(p<0.05)，在宰后1、3、7、14 d時14 ℃處理組牛背最長肌的剪切力值顯著低于0 ℃處理組(p<0.05)。

圖6 宰后早期不同溫度對牛背最長肌剪切力值Fig.6 The shearing force of beef M. Longissimus lumborum at different temperature during the early post-mortem

隨著成熟時間的延長，剪切力值均降低，但是肉的成熟速率和成熟程度不同。成熟至14 d，14 ℃處理組的嫩度改善在34%左右，0 ℃處理組嫩度改善在23%左右。

3 討論

宰后早期環(huán)境溫度影響胴體或者肌肉發(fā)生一系列生物化學(xué)變化，能量代謝特別是糖酵解是這些變化中的一個重要過程，在無氧條件下葡萄糖被分解生成丙酮酸，丙酮酸又進一步被還原為乳酸[11-12]，乳酸的積累導(dǎo)致了肌肉pH值的下降。而pH值的降低程度和降低速率則是影響宰后肌肉品質(zhì)的重要因素。AMPK能感知機體細胞能量代謝狀態(tài)的改變，有學(xué)者[19-20]研究發(fā)現(xiàn)，AMPK可以調(diào)節(jié)小鼠宰后骨骼肌的糖酵解。本實驗結(jié)果表明宰后早期不同溫度處理能夠影響牛背最長肌宰后糖酵解速率，表現(xiàn)在pH值下降速率、糖原分解速率以及乳酸積累速率，同時還能夠影響AMPK和丙酮酸激酶的活性變化。這與李澤[21]的研究結(jié)果相一致，保存在15 ℃的羊肉比0 ℃和4 ℃的具有更高的AMPK活性值，肌糖原和pH值下降快，乳酸蓄積多。朱學(xué)伸[22]報道宰后高溫處理火雞胸肌1 h時AMPK酶被激活，20 ℃處理組的AMPK磷酸化水平高于0 ℃處理組。宰后綿羊肌肉AMPK活性較高時糖酵解速度較快[23]。張一敏[10]報道AMPK的活性在不同部位牛肉中差異顯著，AMPK 活性較高的牛柳中丙酮酸激酶達到最大活性的時間早于西冷。丙酮酸激酶作為糖酵解途徑的限速酶之一，其活性的提高能夠提高糖酵解速率。DU[24]報道AMPK基因敲除小鼠宰后24 h背最長肌中丙酮酸激酶活性顯著低于對照組，AMPK參與丙酮酸激酶的激活。本研究中2個溫度處理組AMPK達到最大活性的時間不同，14 ℃處理組相較于0 ℃處理組的AMPK較早的達到最大活性，其丙酮酸激酶也較早的達到最大活性，說明在宰后牛肉中AMPK可能通過介導(dǎo)丙酮酸激酶的活性而調(diào)節(jié)糖酵解速率。

宰后僵直前期的冷卻溫度能夠影響胴體肌肉的生化過程，從而對肉品品質(zhì)有著重要的影響[25]。不同的冷卻程序即不同的溫度處理能夠影響肌肉的溫度-pH窗口，對肉的嫩度、保水性起到最終的決定作用[26]。本研究中不同溫度處理能夠影響牛背最長肌的糖酵解速度和肉品質(zhì)，14 ℃處理組牛肉的嫩度及保水性顯著高于0 ℃處理組，成熟至14 d，14 ℃處理組的嫩度改善在34%左右，且剪切力值最低，嫩度較好，0 ℃處理組嫩度改善在23%左右，且剪切力值最高，嫩度較差。酶的活性極易受溫度的影響，溫度較低，AMPK活性不易被激活，糖酵解進程緩慢，pH值下降慢。若pH值降低到6.2之前胴體的溫度降低到12 ℃以下，便容易發(fā)生冷收縮[27]，肉的嫩度和保水性變差。溫度在14～20 ℃時肌肉進入僵直，收縮量最小[18]，牛肉的收縮程度與肉的嫩度密切相關(guān)。因此調(diào)節(jié)宰后合理的冷卻程序，調(diào)控宰后代謝，對于生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的牛肉有著重要作用。

4 結(jié)論

不同的冷卻溫度能夠改變牛背最長肌的pH值的下降速率、糖酵解速率及肉品質(zhì)，宰后早期14 ℃處理組的pH值下降速率、糖原分解速率、乳酸積累速率及肉的嫩度顯著高于0 ℃處理組。14 ℃處理組相較于0 ℃處理組的AMPK較早地達到最大活性，其丙酮酸激酶也較早地達到最大活性，說明在宰后牛肉中AMPK通過介導(dǎo)丙酮酸激酶的活性而調(diào)節(jié)糖酵解速率進而影響肉品質(zhì)。

[1] DIEGO M S, MICHAEL J S, JEREMY C P, et al. The complement of protein kinases of the microsporidium Encephalitozoon cuniculi in relation to those of Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe[J]. BMC Genomics, 2007, 8(1):309.

[2] HARDIE D G. AMP-activated protein kinase: a key system mediating metabolic responses to exercise[J]. Medicine & Science in Sports & Exercise, 2004, 36(1):28.

[3] HARDIE D G. AMP-activated protein kinase—an energy sensor that regulates all aspects of cell function[J]. Genes & Development, 2011, 25(18):1 895-1 908.

[4] FRIEDRICHSEN M, MORTENSEN B, PEHM?LLER C, et al. Exercise-induced AMPK activity in skeletal muscle: role in glucose uptake and insulin sensitivity[J]. Molecular & Cellular Endocrinology, 2013, 366(2):204.

[5] BARNES B R, MARKLUND S, STEILER T L, et al. The 5′-AMP-activated protein kinase gamma3 isoform has a key role in carbohydrate and lipid metabolism in glycolytic skeletal muscle.[J]. Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(37):38 441-38 447.

[6] UNDERWOOD K R, TONG J, ZHU M J, et al. Relationship between kinase phosphorylation, muscle fiber typing, and glycogen accumulation in longissimus muscle of beef cattle with high and low intramuscular fat[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2007, 55(23):9 698-9 703.

[7] SHEN Q W, MEANS W J, THOMPSON S A, et al. Pre-slaughter transport, AMP-activated protein kinase, glycolysis, and quality of pork loin[J]. Meat Science, 2006, 74(2):388.

[8] ZHU X, RUUSUNEN M, GUSELLA M, et al. High early post-mortem temperature induces activation of AMP-activated protein kinase and development of pale, soft and exudative characteristics in turkey muscles[J]. Meat Science, 2013, 93(3):600-606.

[9] APAOBLAZA A, GALAZ A, STROBEL P, et al. Glycolytic potential and activity of adenosine monophosphate kinase (AMPK), glycogen phosphorylase (GP) and glycogen debranching enzyme (GDE) in steer carcasses with normal (5.9) 24h pH determined in M. longissimus dorsi.[J]. Meat Science, 2015, 101:83-89.

[10] 張一敏, 朱立賢, 曹麗,等. 肉牛宰后初期一磷酸腺苷活化蛋白激酶活性在不同部位肉中的差異表達及與牛肉品質(zhì)關(guān)系[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2016, 42(6):73-79.

[11] WARNER R D, GREENWOOD P L, PETHICK D W, et al. Genetic and environmental effects on meat quality.[J]. Meat Science, 2010, 86(1):171-183.

[12] SCHEFFLER T L, GERRARD D E. Mechanisms controlling pork quality development: The biochemistry controlling postmortem energy metabolism[J]. Meat Science, 2007, 77(1):7.

[13] RYU Y C, CHOI Y M, KIM B C. Variations in metabolite contents and protein denaturation of the longissimus dorsi muscle in various porcine quality classifications and metabolic rates[J]. Meat Science, 2005, 71(3):522.

[14] P?S? A R, PUOLANNE E. Carbohydrate metabolism in meat animals.[J]. Meat Science, 2005, 70(3):423-34.

[15] LI K, ZHANG Y, MAO Y, et al. Effect of very fast chilling and aging time on ultra-structure and meat quality characteristics of Chinese Yellow cattle M. Longissimus lumborum[J]. Meat Science, 2012, 92(4):795-804.

[16] LUO X, ZHU Y, ZHOU G. Electron microscopy of contractile bands in low voltage electrical stimulation beef.[J]. Meat Science, 2008, 80(3):948-951.

[17] REES M P, TROUT G R, WARNER R D. Tenderness of pork m. longissimus thoracis et lumborum after accelerated boning. Part I. Effect of temperature conditioning.[J]. Meat Science, 2002, 61(2):215-224.

[18] LONERGAN E H, ZHANG W, LONERGAN S M. Biochemistry of postmortem muscle — Lessons on mechanisms of meat tenderization[J]. Meat Science,2010, 86(1):184-195.

[19] SHEN Q W, DU M. Role of AMP-activated protein kinase in the glycolysis of postmortem muscle[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture, 2005, 85(14):2 401-2 406.

[20] SHEN Q W, GERRARD D E, DU M. Compound C, an inhibitor of AMP-activated protein kinase, inhibits glycolysis in mouse longissimus dorsi postmortem[J]. Meat Science, 2008, 78(3):323-330.

[21] 李澤, 靳燁, 馬霞. 不同貯藏溫度下宰后羊肉的肉質(zhì)變化及其影響因素[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2010, 26(s1):338-342.

[22] 朱學(xué)伸. 家禽“類PSE肉”的品質(zhì)特性及其改善因素研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

[23] 李澤, 馬霞, 靳燁. 不同年齡和部位羊肉中AMPK活性與糖酵解的差異[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2010，36(1):184-186.

[24] DU M, SHEN Q W, ZHU M J. Role of beta-adrenoceptor signaling and AMP-activated protein kinase in glycolysis of postmortem skeletal muscle[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2005, 53(53):3 235-3 239.

[25] TROY D J, KERRY J P, JOO S T, et al. Consumer perception and the role of science in the meat industry[J]. Meat Science, 2010, 86(1):214-226.

[26] SIMMONS N J, DALY C C, MUDFORD C R, et al. Integrated technologies to enhance meat quality-An Australasian perspective[J]. Meat Science, 2006, 74(1):172-179.

[27] TORNBERG E. Biophysical aspects of meat tenderness[J]. Meat Science, 1996, 43(S1):175-191.