王曉丹，白小燕，曾超，雷安亮，邱樹(shù)毅*

1(貴州大學(xué),貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng)，550025) 2(貴州珍酒釀酒有限責(zé)任公司，貴州 遵義，563003) 3(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)，550025) 4(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)，550025)

醬香型白酒是將高粱粉碎加大曲投入到深3 m的長(zhǎng)方形窖池，用泥土密封進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵經(jīng)過(guò)9個(gè)輪次，每輪次歷時(shí)1個(gè)月。糟醅在窖池中分為上中下3層，從窖池底部往上0.1～0.3 m為下層，從窖池頂部往下0.1～0.3 m為上層，其余為中層。同一輪次酒窖不同位置的發(fā)酵酒醅，所產(chǎn)酒的質(zhì)量跟風(fēng)格也有所差異，可分為醬香、醇甜和窖底香3個(gè)單型酒[1]。厭氧菌是一類(lèi)在無(wú)氧條件下比在有氧環(huán)境中生長(zhǎng)好的細(xì)菌，窖池的底部酒醅與窖底泥中的微生物進(jìn)行相互滲透和作用，逐漸形成了獨(dú)有的厭氧微生物體系，這個(gè)體系在發(fā)酵過(guò)程中必然發(fā)揮著重要的作用。這類(lèi)細(xì)菌缺乏完整的代謝酶體系，其能量代謝以無(wú)氧發(fā)酵的方式進(jìn)行，在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生乙醇、乳酸、己酸等[2]。在對(duì)濃香型白酒發(fā)酵的研究中發(fā)現(xiàn)，酒醅入窖發(fā)酵，窖泥中的厭氧細(xì)菌對(duì)酒醅的糖化、乙醇的產(chǎn)生等起作用，其代謝產(chǎn)生的窖香香氣是構(gòu)成濃香型白酒窖香濃郁的重要組成部分[3]；另外，從汾酒的窖泥底分離純化得到的菌株腸球菌科(Enterococcaceae)也是白酒釀造過(guò)程中酒醅中常見(jiàn)的微生物類(lèi)群[4]。對(duì)醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)分析及窖池底部的微生物類(lèi)群進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，微生物數(shù)量以細(xì)菌和真菌為主，酵母含量最低,且厭氧微生物逐漸成為主要優(yōu)勢(shì)種群[5-6]。通過(guò)對(duì)茅臺(tái)酒發(fā)酵窖池中的窖底泥及環(huán)境土樣中的微生物區(qū)系構(gòu)成進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)在將土壤馴化成窖底泥的過(guò)程中，乳桿菌科(Lactobacillaceae)、梭菌科(Clostridi-aceae)和胃瘤球菌科(Ruminococcaceae)等厭氧微生物逐漸成為主要優(yōu)勢(shì)種群[3]。

醬香型白酒經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)1年的生產(chǎn)周期，發(fā)酵環(huán)境中的厭氧微生物的代謝就必然會(huì)影響釀酒體系中的各項(xiàng)指標(biāo)和白酒的風(fēng)味。由此可見(jiàn)，研究醬香型白酒酒醅發(fā)酵過(guò)程中下層酒醅厭氧細(xì)菌的數(shù)量變化對(duì)生產(chǎn)過(guò)程的影響以及厭氧細(xì)菌的種類(lèi)是很有必要的。本文以整個(gè)發(fā)酵周期的窖池底部酒醅為研究對(duì)象，對(duì)厭氧細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行跟蹤，討論酒醅水分、酸度、還原糖和厭氧微生物數(shù)量的關(guān)系，并建立一種操作簡(jiǎn)便、有效的厭氧細(xì)菌分離篩選方法，為進(jìn)一步討論其功能與白酒釀造的關(guān)系提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品來(lái)源于貴州珍酒釀酒有限公司的生產(chǎn)車(chē)間23班7號(hào)窖池。對(duì)窖池下層酒醅進(jìn)行取樣，取樣時(shí)間為2014年11月～2015年9月。醬香型白酒釀酒工藝及取樣位置如圖1。

1.2 取樣

將具有丁基橡膠內(nèi)塞和塑料外塞的血清瓶經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后于烘箱中充分晾干。

圖1 醬香型白酒生產(chǎn)工藝流程圖Fig.1 Maotai-flavor liquor production flow chart

然后于超凈臺(tái)內(nèi)充滿(mǎn)N2，迅速蓋上瓶?jī)?nèi)塞密封，用外塞旋緊固定。對(duì)釀造工藝過(guò)程中的下沙、糙沙及3～7輪次酒醅入窖發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行取樣，取樣對(duì)象為距離窖池底部0.1～0.2 m的下層酒醅。取樣時(shí)迅速打開(kāi)藍(lán)蓋瓶，快速對(duì)同區(qū)域3點(diǎn)進(jìn)行取樣，混合均勻，排除瓶?jī)?nèi)的空氣，利用冰塊保護(hù)。

1.3 培養(yǎng)基的配制

1.3.1 厭氧培養(yǎng)液

用于厭氧菌增菌培養(yǎng)。KH2PO40.176 g，K2HPO40.293 g，NaCl 0.443 g，(NH4)2SO40.45 g，CaCl 0.045 g，MgSO40.094 g，刃天青0.001 g，L-半胱氨酸0.5 g，L-抗壞血酸0.5 g，Na2CO34.0 g，牛膽鹽，1.0 g，蛋白胨1.0 g，瓊脂1.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.5～8.0。其中刃天青作為厭氧指示劑，它在氧化態(tài)時(shí)呈紫色，在無(wú)氧狀態(tài)時(shí)，即完全還原時(shí)呈無(wú)色[7]。

1.3.2 厭氧菌瓊脂培養(yǎng)基

用于厭氧菌分離培養(yǎng)。胰酪蛋白胨20.0 g，NaCl 5.0 g，L-胱氨酸0.4 g，葡萄糖10.0 g，硫代乙醇酸鈉2.0 g，甲醛合次硫酸氫鈉1.0 g，美藍(lán)0.002 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.5。其中L-半胱氨酸作為還原劑，除去溶解于厭氧培養(yǎng)液中的氧氣，用于厭氧菌的富集和液體培養(yǎng)[7]。

1.3.3 生理生化培養(yǎng)基[8-9]

革蘭氏染色：(1)草酸銨結(jié)晶紫染劑：溶液I(結(jié)晶紫2.0 g，體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精20.0 mL)與溶液II[(NH4)2C2O40.8 g，蒸餾水80.0 mL]分別配成并混合。(2)魯戈?duì)柕庖海篒21.0 g，KI 2.0 g，蒸餾水300.0 mL；I2和KI在研缽中充分研磨并溶于水，然后儲(chǔ)放在有色磨口玻璃瓶中，防止光解。(3)番紅復(fù)染劑：2.5%番紅，95%酒精溶液10.0 mL，蒸餾水100.0 mL。

甲基紅培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，葡糖糖5 g，K2HPO45 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

硫化氫試驗(yàn)培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，酵母膏3 g，蛋白胨10 g，F(xiàn)eSO40.2 g，NaS20.3 g，NaCl 5 g，瓊脂12 g，蒸餾水1 000 mL。

氧化酶試驗(yàn)培養(yǎng)基：厭氧培養(yǎng)液培養(yǎng)基。

吲哚試驗(yàn)培養(yǎng)基：蛋白胨液體培養(yǎng)基。

檸檬酸鹽試驗(yàn)培養(yǎng)基：NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g， (NH4)H2PO41 g，檸檬酸鈉5.0 g，K2HPO41 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，0.2%溴麝香草酚藍(lán)40 mL，pH 6.8。

V-P試驗(yàn)培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，葡萄糖5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

硝酸鹽還原試驗(yàn)培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基1 000 mL，KON31 g，pH 7.0～7.6

接觸酶試驗(yàn)培養(yǎng)基：厭氧菌瓊脂培養(yǎng)基。

耐鹽試驗(yàn)培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，NaCl(20，50，70，100 g/L)，pH 7.0～7.2。

淀粉水解試驗(yàn)培養(yǎng)基：牛肉膏2.0 g，蛋白胨17.5 g，淀粉1.5 g，瓊脂17.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

葡萄糖產(chǎn)酸試驗(yàn)培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 3 g，Na2HPO4·12H2O 2 g，0.2%溴麝香草酚藍(lán)溶液12 mL，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4，加入0.5%葡萄糖。

葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)培養(yǎng)基：厭氧培養(yǎng)液

1.4 厭氧細(xì)菌的培養(yǎng)計(jì)數(shù)

10 g酒醅于含90 mL無(wú)菌水的三角瓶中，在厭氧工作站中充分振蕩，靜置，取上清液1 mL于厭氧培養(yǎng)基的平板中，36 ℃，濕度60%，厭氧工作站中通入混合氣體：10% H2，10% CO2，80% N2，倒置培養(yǎng)3 d，采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。

1.5 酒醅理化指標(biāo)的檢測(cè)

水分測(cè)定見(jiàn)文獻(xiàn)[10]，酸度測(cè)定見(jiàn)文獻(xiàn)[11]，還原糖測(cè)定見(jiàn)文獻(xiàn)[12]。

1.6 厭氧細(xì)菌的分離篩選

1.6.1 厭氧菌的富集

在氮?dú)饬飨拢Q(chēng)取10 g酒醅加入滅完菌的90 mL生理鹽水(9 g/L NaCl+0.2 g/LL-半胱氨酸)于厭氧瓶中，迅速蓋緊瓶蓋，在37 ℃，180 r/min搖床上振蕩20 min，取出放入?yún)捬豕ぷ髡局校?.1 mL上清液加入滅菌后的厭氧培養(yǎng)液中進(jìn)行厭氧菌富集培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h，去除樣品中的好氧菌，使厭氧菌大量繁殖。

1.6.2 厭氧菌的分離和純化[13]

在厭氧工作站中將富集培養(yǎng)后的菌懸液分別稀釋到10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。每個(gè)稀釋度取0.2 mL涂平板，3個(gè)平行，在37 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d。長(zhǎng)出菌落后，選擇合適的梯度，根據(jù)菌落的大小、形態(tài)、顏色、透明度、是否隆起等形態(tài)學(xué)特征挑取不同的單菌落，劃線(xiàn)純化。

嚴(yán)格厭氧菌的篩選：在厭氧工作站中，將已純化的菌種接種到厭氧菌瓊脂上，分別放入37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱和37 ℃厭氧工作站中培養(yǎng)3 d，觀(guān)察。若在生化培養(yǎng)箱和厭氧工作箱中均生長(zhǎng)，則為兼性厭氧菌，在厭氧培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)而在生化培養(yǎng)箱中不生長(zhǎng)，則為嚴(yán)格厭氧菌。

1.7 形態(tài)學(xué)特征及生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

挑取少許細(xì)菌接種于厭氧培養(yǎng)基平板上，在35 ℃條件下培養(yǎng)3 d，根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》記錄菌落形態(tài)及掃描電子顯微鏡形態(tài)，并測(cè)定細(xì)菌大小，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。對(duì)分離的細(xì)菌做生理生化鑒定，方法參見(jiàn)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》及《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》。

掃描電子顯微鏡鏡檢方法：取培養(yǎng)3 d的菌懸液1 mL于離心管中，再加入1 mL 2.5%戊二醛，4 ℃固定20 h，用0.1 mol/L磷酸緩沖液(PBS)清洗2次；在26 ℃用30%、50%、70%、90%的叔丁醇/無(wú)水乙醇混合液各脫水5 min；抽干離心管中叔丁醇，真空冷凍干燥50 min；將樣品用導(dǎo)電膠粘在樣品臺(tái)上，離子濺射儀鍍金膜，掃描電鏡觀(guān)察并拍照[14]。

1.8 分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)細(xì)菌DNA提取試劑盒方法提取已分離的厭氧細(xì)菌DNA。采用細(xì)菌16S rDNA通用引物27f (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，對(duì)應(yīng)于Escherichiacoli16S rDNA(8-27位)和1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，對(duì)應(yīng)于E.coli16S rDNA的(1 510～1 492位) 進(jìn)行擴(kuò)增，該對(duì)引物幾乎能擴(kuò)增出近乎細(xì)菌DNA全長(zhǎng)的16S rDNA序列，長(zhǎng)度約1 450 bp左右。PCR反應(yīng)體系為25.0 μL：在25.0 μL Mix 12.5 μL，10 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，細(xì)菌DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL[14]。PCR擴(kuò)增條件為，94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性0.5 min，55 ℃退火0.5 min, 72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃保持10 min。取2 μL PCR產(chǎn)物于1% 瓊脂糖凝膠50 V電泳20 min左右。在凝膠成像儀下觀(guān)察。若有條帶，剩余PCR產(chǎn)物送上海生物公司有限公司測(cè)序。

1.9 DNA序列分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，經(jīng)過(guò)Blast比對(duì)后，下載每株細(xì)菌相似性大于99%的幾株細(xì)菌序列，并下載芽孢桿菌科各屬模式菌株系列，以Escherichiacoli為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。用MEGA5.05進(jìn)行序列比對(duì)，并手工校正，用鄰接法(NJ)[16]，經(jīng)1 000次bootstrap進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果及分析

2.1 厭氧細(xì)菌數(shù)量變化

窖池下層酒醅中厭氧細(xì)菌數(shù)量變化如圖2。厭氧細(xì)菌數(shù)量在104～105之間波動(dòng)變化。糧食第1次入窖(下沙階段)窖池厭氧微生物的數(shù)量最多，達(dá)到2.2×105CFU/g;在糧食第2次入窖(糙沙階段),微生物數(shù)量明顯下降，直至7次取樣下降了100倍。通過(guò)對(duì)醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，微生物數(shù)量以細(xì)菌和真菌為主,酵母含量最低,且厭氧微生物逐漸成為主要優(yōu)勢(shì)種群[2]。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，窖池內(nèi)酒醅含氧量、酒醅質(zhì)地疏松情況、水分含量等發(fā)生變化，不利于厭氧細(xì)菌的繁殖，在糙沙階段以后厭氧菌數(shù)量明顯減少。在濃香型白酒生產(chǎn)中，窖底泥存在大量的厭氧細(xì)菌和厭氧芽孢細(xì)菌，同時(shí)厭氧菌缺乏超氧化物歧化酶等而極易受到氧氣的毒害，長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中甚至?xí)劳觯契锏膮捬跫?xì)菌主要是來(lái)源于窖底[17]。

酒醅的發(fā)酵過(guò)程是多種微生物和酶系共同作用的一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程。水分、酸度、糖分等因素對(duì)微生物代謝具有極大的影響，從而影響微生物數(shù)量。酒醅水分多少關(guān)系著微生物的代謝，影響發(fā)酵的程度，最終決定酒的產(chǎn)量和質(zhì)量。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，水分逐漸上升(圖2-B)，厭氧細(xì)菌數(shù)下降。這是因?yàn)殡S著發(fā)酵的進(jìn)行，生成乙醇的同時(shí)，水分含量也會(huì)不斷增加，糖化發(fā)酵作用快，升酸快，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致厭氧細(xì)菌數(shù)量減小[18]。

圖2 酒醅厭氧細(xì)菌數(shù)量(A)，水分含量(B)，酸度(C)和還原糖含量(D)的變化Fig.2 The change of anaerobic bacteria quantity(A), water content(B),acidity(C) and reducing sugar content(D) in fermented grains

酒醅發(fā)酵需要適宜的酸度。適宜的酸度可以抑制部分有害雜菌的生長(zhǎng)繁殖，起到以酸制酸的作用。而酸度過(guò)高又會(huì)抑制有益微生物的生長(zhǎng)繁殖，影響酒醅正常發(fā)酵，導(dǎo)致產(chǎn)量和質(zhì)量的下降[19]。醬香型白酒窖池下層酒醅酸度變化見(jiàn)圖2-C，酸度變化與厭氧細(xì)菌數(shù)量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，隨著酸度的上升厭氧細(xì)菌數(shù)量遞減。這可能是由于隨著總酸量的增多，窖池環(huán)境的改變，不適合許多微生物生存，導(dǎo)致細(xì)菌多樣性指數(shù)下降[20]。

酒醅中還原糖濃度的變化，影響著微生物的代謝，微妙反映了糖化與發(fā)酵的平衡關(guān)系[19]。這可能是由于發(fā)酵初期微生物將淀粉分解為還原糖，細(xì)菌大量繁殖；但隨著發(fā)酵的進(jìn)行還原糖最終被消耗，細(xì)菌數(shù)量不斷減少[20](圖2-C)。

2.2 厭氧細(xì)菌的分離篩選鑒定

2.2.1 酒醅中厭氧細(xì)菌的分離與純化

通過(guò)對(duì)酒醅菌懸液的富集，厭氧分離純化培養(yǎng)，從酒醅樣品中分離得到4株嚴(yán)格厭氧細(xì)菌,分別編號(hào)為JP1，JP2，JP3，JP4。形態(tài)描述(表1)及電子顯微鏡鏡檢見(jiàn)圖3。

表1 厭氧細(xì)菌菌落形態(tài)描述Table 1 The morphologicalcolony description of anaerobic bacteria

觀(guān)察細(xì)菌顯微結(jié)構(gòu)特征如下：

JP1：桿菌，0.6～8.0 μm，孢子橢圓或卵圓。

JP2：直或微彎的桿菌，0.6～7.0 μm，端圓，單個(gè)、成對(duì)、短鏈；與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》上描述的丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)具有較高相似度。

JP3：桿菌，0.5～4.4 μm，孢子卵圓，無(wú)附屬絲；與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》上描述的近端梭菌(Clostridiumsubterminate)具有較高相似度。

圖3 掃描電子顯微鏡形態(tài)觀(guān)察Fig.3 SEM observation of the morphological characteristics

JP4：直到微彎的桿菌，0.6～8.0 μm，孢子卵圓、端生。細(xì)菌的生理生化鑒定與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》上描述的煎盤(pán)梭菌(Clostridiumsartagoforme)具有較高相似度。

2.2.2 厭氧細(xì)菌的鑒定

試驗(yàn)對(duì)4株已純化的厭氧細(xì)菌進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果見(jiàn)表2。甲基紅實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性，說(shuō)明細(xì)菌能利用葡萄糖；硫化氫實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性，能分解含硫氨基酸；氧化酶實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性，細(xì)菌具有氧化酶；吲哚實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性，細(xì)菌具有色氨酸酶；檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)均呈陽(yáng)性，細(xì)菌能利用檸檬酸鹽；V-P實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性，細(xì)菌能利用葡萄糖；硝酸鹽還原反應(yīng)呈陽(yáng)性，細(xì)菌能還原硝酸鹽；接觸酶實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性，細(xì)菌具有過(guò)氧化氫酶；耐鹽試驗(yàn)均呈陽(yáng)性，細(xì)菌能耐鹽；淀粉水解實(shí)驗(yàn)均呈陽(yáng)性，細(xì)菌能水解淀粉；產(chǎn)酸、產(chǎn)氣呈陽(yáng)性，細(xì)菌能產(chǎn)生酸性物質(zhì)，能產(chǎn)生氣體；以上呈陰性則相反。JP1、JP2、JP3、JP4這些細(xì)菌均為革蘭氏陽(yáng)性，都能利用檸檬酸鹽，都能耐鹽，都能水解淀粉。JP1能利用葡萄糖，不能分解含硫氨基酸，具有氧化酶，不能還原硝酸鹽，具有過(guò)氧化氫酶，能產(chǎn)生酸性物質(zhì)，能產(chǎn)生氣體。參見(jiàn)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，該菌與解木聚糖梭菌(Clotridiumxylanolyticum)具有較高相似度。JP2能利用葡萄糖，不能分解含硫氨基酸，不能還原硝酸鹽，能產(chǎn)生酸性物質(zhì)，不能產(chǎn)生氣體。參見(jiàn)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，該菌與丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)具有較高相似度。JP3不能利用葡萄糖，能分解含硫氨基酸，具有色氨酸酶，能還原硝酸鹽，具有過(guò)氧化氫酶，能產(chǎn)生酸性物質(zhì)，能產(chǎn)生氣體。參見(jiàn)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，該菌與近端梭菌(Clostridiumsubterminate)具有較高相似度。JP4能利用葡萄糖，不能分解含硫氨基酸，不能還原硝酸鹽，具有過(guò)氧化氫酶，不能產(chǎn)生酸性物質(zhì)，能產(chǎn)生氣體。參見(jiàn)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，該菌與煎盤(pán)梭菌(Clostridiumsartagoforme)具有較高相似度。

表2 厭氧細(xì)菌生理生化鑒定Table 2 The physiological and biochemical identification of anaerobic bacteria

注：+表示陽(yáng)性；-表示陰性。

2.2.3 16S rDNA測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析

基于細(xì)菌16S DNA對(duì)4株細(xì)菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖4。

圖4 厭氧細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 The phylogenetic tree of anaerobic bacteria

結(jié)合表1、表2、圖3、圖4的結(jié)論，最終將JP1鑒定為解木聚糖梭菌(Clotridiumxylanolyticum)，JP2鑒定為丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)，JP3鑒定為近端梭菌(Clostridiumsubterminate)，JP4鑒定為煎盤(pán)梭菌(Clostridiumsartagoforme)。在采用PCR-DGGE技術(shù)探索濃香型白酒不同窖齡窖泥細(xì)菌類(lèi)群也有發(fā)現(xiàn)Clostridiumbutyricum和Clostridiumsartagoforme[21]。C.butyricum一般存在于人或動(dòng)物的腸道中的嚴(yán)格厭氧菌，能促進(jìn)有益的雙歧桿菌、乳酸菌、擬桿菌的增殖作用，也能有效地抑制引起疾病的細(xì)菌的繁殖[22]。早在1990年在采用甲烷菌、己酸菌二元發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)窖泥時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C.xylanolyticum與C.subterminate具有互利共生的關(guān)系，在窖泥反應(yīng)中，2株菌的數(shù)量都有所增加[23]，可以提高瀘型曲酒的質(zhì)量。目前，利用己酸菌培窖的微生物技術(shù)已經(jīng)在全國(guó)范圍內(nèi)推廣[24]，瀘州老窖酒曲的中試驗(yàn)結(jié)果表明，利用窖泥甲烷菌與己酸菌二元發(fā)酵能夠提高酒體中己酸乙酯的含量[25]，若以100 mL酒體中含有己酸乙酯180 mg計(jì)，其優(yōu)質(zhì)品率可達(dá)到總出酒量的80.9%?？梢?jiàn)，在白酒釀造體系中，厭氧微生物能有效提高白酒質(zhì)量，提高總出酒量的優(yōu)質(zhì)率。

厭氧微生物的培養(yǎng)的一個(gè)關(guān)鍵性問(wèn)題就是厭氧條件是否合格,只有厭氧條件合格才能提高厭氧菌的分離率[26]。目前厭氧微生物的培養(yǎng)技術(shù)主要有平板厭氧技術(shù)(主要包括平皿夾層厭氧法、平板培養(yǎng)瓶厭氧技術(shù))[10]、亨蓋特(Hungate)滾管技術(shù)[27]、厭氧手套箱技術(shù)[28-29]。本實(shí)驗(yàn)在A(yíng)G300厭氧工作站中操作完成，該工作站操作簡(jiǎn)單，能夠克服厭氧環(huán)境難以形成的問(wèn)題，操作及其培養(yǎng)都在厭氧手套箱中，能夠直接通過(guò)手與儀器接觸進(jìn)行操作，較傳統(tǒng)方法更容易培養(yǎng)出嚴(yán)格厭氧菌。該方法適用于傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中厭氧細(xì)菌的分離純化。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)窖池底部厭氧細(xì)菌數(shù)量的計(jì)數(shù)，菌量從105下降到103，隨著發(fā)酵過(guò)程中水分、還原糖、酸度的變化，厭氧微生物的變化明顯。采用AG300厭氧工作站培養(yǎng)技術(shù)完成了醬香型白酒底層酒醅中厭氧微生物的分離純化，共篩選到嚴(yán)格厭氧菌4株。分別鑒定為解木聚糖梭菌(Clotridiumxylanolyticum)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、近端梭菌(Clostridiumsubterminate)和煎盤(pán)梭菌(Clostridiumsartagoforme)。

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