孫怡然，萬偉建，段超，劉東國，柳艷云，段學(xué)輝

(南昌大學(xué) 食品學(xué)院食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌，330047)

還原型谷胱甘肽，即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸(glutathione,GSH)，是生物體內(nèi)最豐富的非蛋白巰基化合物[1]。在生物體中，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和谷胱甘肽合成酶(GS)利用ATP能量，能將前體氨基酸谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸催化合成GSH[2-3]。谷胱甘肽具有抗氧化、維持細(xì)胞酶活的穩(wěn)定、參與DNA和蛋白質(zhì)的合成、抵御內(nèi)毒素以及自由基對(duì)細(xì)胞的損害等功能[4-7]，在食品中添加GSH，可以提高食品的營養(yǎng)價(jià)值，加強(qiáng)風(fēng)味，防止食品的色澤變化[8]；在醫(yī)藥領(lǐng)域中，GSH可以緩解輻射、化療等對(duì)機(jī)體造成的副作用，同時(shí)對(duì)肝病的治療也具有一定的效果[9-10]；在化妝品領(lǐng)域中，GSH可以提高細(xì)胞的抗氧化能力，降低色素的積累[11]。然而，眾多研究顯示酵母細(xì)胞難以過量連續(xù)合成GSH，其關(guān)鍵原因之一是GSH不能有效分泌到胞外，細(xì)胞內(nèi)積累一定濃度的GSH會(huì)對(duì)合成限速酶谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性產(chǎn)生反饋抑制，限制了細(xì)胞內(nèi)GSH的過量連續(xù)合成[12]。

有研究利用物理、化學(xué)方法對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行處理，提高細(xì)胞的通透性，從改變細(xì)胞的傳質(zhì)能力來提高胞內(nèi)產(chǎn)物的合成水平。段學(xué)輝[13]等采用氣流干燥、超聲、及低濃度甲苯處理釀酒酵母，改善細(xì)胞透性，增強(qiáng)了胞內(nèi)酶的催化合成活性。LI[14]等采用細(xì)胞滲透處理結(jié)合兩步法反應(yīng)，明顯地提高了細(xì)胞催化合成GSH的產(chǎn)量。張帥帥[15]等利用40%的乙醇對(duì)乳酸克魯維酵母透性化處理，用于催化合成低聚半乳糖，其產(chǎn)量達(dá)到98.93 g/L。說明提高細(xì)胞的通透性有助于產(chǎn)物的合成。另外，有機(jī)分子肉桂醛、檸檬醛在細(xì)胞生長(zhǎng)過程中對(duì)細(xì)胞膜真菌麥角甾醇的合成產(chǎn)生影響，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的合成[16-17]；而且肉桂醛對(duì)β(1,3)-葡聚糖以及幾丁質(zhì)的合成具有抑制作用，影響細(xì)胞壁的合成[18]。汪琨[19]等利用去氫木香內(nèi)酯處理釀酒酵母，發(fā)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞內(nèi)β-葡聚糖合酶具有一定的抑制作用。一些抗生素如卡泊芬凈、尼可霉素以及兩性霉素B也有類似的效果[20-21]。

本研究選擇在酵母生長(zhǎng)培養(yǎng)液中添加一定濃度的有機(jī)小分子化合物肉桂醛或檸檬醛，對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)控，影響酵母細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的合成，導(dǎo)致生長(zhǎng)酵母的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生一定變化；并通過考察控制培養(yǎng)細(xì)胞酶法合成GSH及細(xì)胞外積累能力變化，探討研究肉桂醛、檸檬醛調(diào)控生長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞合成GSH的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

絮凝酵母(SaccharomycescerevisiaeSP5)為本實(shí)驗(yàn)室保藏。谷胱甘肽(GSH)、L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸、肉桂醛、檸檬醛：阿拉丁試劑有限公司；無水乙醇、六水合氯化鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、硫酸銨：西隴化工；葡萄糖：天津市大茂化學(xué)試劑廠；四氧嘧啶：Maclin。

1.2 方法

1.2.1 GSH測(cè)定

采用四氧嘧啶法[22]

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

參照張倩等[23]培養(yǎng)方法。

種子培養(yǎng)：將斜面種子在30 ℃下活化3 h，取一環(huán)至裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL的錐形瓶中，培養(yǎng)時(shí)間24 h，30 ℃溫度下，培養(yǎng)24 h，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min；

發(fā)酵培養(yǎng)：30 ℃ 溫度下，培養(yǎng)36 h，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min；斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20，瓊脂粉20；

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20 ，酵母粉10 ，蛋白胨20 ，培養(yǎng)基初始pH為6.0，滅菌鍋壓強(qiáng)為0.07 MPa，滅菌時(shí)間15 min；

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖35 ，酵母粉10，硫酸銨5，肌醇0.1 ，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 0.5，培養(yǎng)基初始pH為6.0，滅菌鍋壓強(qiáng)為0.07 MPa，滅菌時(shí)間15 min；

1.2.3 細(xì)胞干重(DCW)測(cè)定

將發(fā)酵液在8 000 r/min下離心10 min，去除上清液，并用無菌水清洗3次，離心收集菌體，于75 ℃下烘干至恒重。

1.2.4 調(diào)控生長(zhǎng)改善細(xì)胞傳質(zhì)能力

在發(fā)酵培養(yǎng)初期加入一定濃度的肉桂醛或檸檬醛，調(diào)控生長(zhǎng)培養(yǎng)36 h。

1.2.5 生長(zhǎng)調(diào)控結(jié)合分段培養(yǎng)方式考察酵母細(xì)胞的GSH合成能力

在發(fā)酵培養(yǎng)初期加入一定濃度的肉桂醛或檸檬醛，調(diào)控生長(zhǎng)培養(yǎng)24 h后停止搖床，補(bǔ)加一定濃度葡萄糖后靜態(tài)調(diào)控培養(yǎng)12 h，比較組合調(diào)控培養(yǎng)細(xì)胞GSH合成能力的變化。

1.2.6 細(xì)胞酶催化合成GSH

參照CHEN等[24]的方法，取2 g濕酵母，加入10 mL酶反應(yīng)液，加入150 mL的搖瓶中，于37 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，恒溫震蕩培養(yǎng)6 h，檢測(cè)GSH合成量。

酶反應(yīng)液(mmol/L)：葡萄糖400，L-Cys 15，L-Gly 40，L-Glu 20，MgCl2·6H2O，反應(yīng)液用pH為7.0 的檸檬酸緩沖液配置。

1.3 酶法總GSH計(jì)算方法

總GSH=胞外GSH+胞內(nèi)GSH

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)中酵母細(xì)胞生長(zhǎng)及胞內(nèi)GSH的合成

按照酵母培養(yǎng)條件發(fā)酵培養(yǎng)40 h，每4 h取樣收集細(xì)胞，測(cè)定培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的細(xì)胞濃度(DCW)和胞內(nèi)GSH合成情況，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酵母生長(zhǎng)及細(xì)胞內(nèi)GSH含量變化Fig.1 The change of growth and intracellular GSH concentration of yeast

由圖1可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)的前16 h內(nèi)，發(fā)酵液中細(xì)胞濃度以及生長(zhǎng)細(xì)胞內(nèi)GSH含量快速增加，培養(yǎng)到24 h后，細(xì)胞量增長(zhǎng)緩慢，在培養(yǎng)到36 h，發(fā)酵液中的生物量及其細(xì)胞內(nèi)的GSH含量達(dá)到最高，分別為8.09 g/L和44 mg/L；在酵母培養(yǎng)的發(fā)酵液中，基本檢測(cè)不到GSH的存在，表明胞內(nèi)GSH無明顯分泌。

2.2 肉桂醛及檸檬醛對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和GSH合成的影響

在細(xì)胞發(fā)酵初期，分別添加0、15、30、45、60、75、90 μg/mL的肉桂醛，質(zhì)量濃度為0、20、40、60、80、100、150、200、250 μg/mL的檸檬醛，發(fā)酵36 h后，收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外GSH含量以及細(xì)胞干重，結(jié)果如圖2、3所示。

圖2 不同濃度肉桂醛調(diào)控酵母的生長(zhǎng)和GSH合成Fig.2 Different concentrations of cinnamaldehyde regulate the growth ofyeast and synthesis of GSH

從圖2中可以看出，隨著肉桂醛添加濃度的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，生長(zhǎng)酵母細(xì)胞的干重逐漸降低；肉桂醛調(diào)控培養(yǎng)細(xì)胞合成GSH，隨著其調(diào)控濃度的增加，胞內(nèi)合成積累的GSH含量呈下降趨勢(shì),而細(xì)胞發(fā)酵液中合成的GSH含量逐漸增加，當(dāng)肉桂醛濃度高于60 μg/mL后，發(fā)酵液中合成的GSH含量逐漸降低；在低濃度的肉桂醛濃度調(diào)控下培養(yǎng)的細(xì)胞合成GSH的總量有所提高，但不明顯，繼續(xù)提高肉桂醛的調(diào)控濃度，培養(yǎng)細(xì)胞的濃度和合成GSH的胞內(nèi)外含量都呈現(xiàn)下降。這可能與細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，生長(zhǎng)細(xì)胞膜合成受阻或結(jié)構(gòu)過度破壞相關(guān)。同樣從圖3中可以看出，與肉桂醛相似，隨著檸檬醛調(diào)控濃度的增加，培養(yǎng)細(xì)胞的濃度、胞內(nèi)GSH含量都出現(xiàn)下降，而分泌到胞外的GSH濃度逐漸升高；當(dāng)檸檬醛調(diào)控濃度高于140 μg/mL后，培養(yǎng)細(xì)胞合成GSH的分泌量快速下降，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制生物量明顯下降；

圖3 不同濃度檸檬醛調(diào)控酵母的生長(zhǎng)和GSH合成Fig.3 Different concentrations of citral regulate the growth of yeast and synthesis of GSH

結(jié)果表明，利用肉桂醛或檸檬醛調(diào)控生長(zhǎng)，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞合成GSH的分泌能力有一定促進(jìn)作用，低濃度的肉桂醛對(duì)細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控后，細(xì)胞GSH合成總量沒有明顯提高，繼續(xù)提高濃度，細(xì)胞GSH合成總量下降，而檸檬醛的調(diào)控，細(xì)胞GSH合成總量下降，這可能與細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞濃度降低相關(guān)。

2.3 肉桂醛、檸檬醛調(diào)控生長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞酶催化合成GSH的影響

收集分別經(jīng)過15、30、45、60、75、90 μg/mL濃度的肉桂醛，或20、40、60、80、100、120、140 μg/mL濃度的檸檬醛調(diào)控生長(zhǎng)的培養(yǎng)酵母，取2 g濕細(xì)胞，加入10 mL酶反應(yīng)液中，于37 ℃，180 r/min，進(jìn)行酶催化合成GSH，反應(yīng)6 h，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外GSH的含量，結(jié)果如圖4和圖5所示。

從圖4可以看出，經(jīng)過一定濃度肉桂醛或檸檬醛調(diào)控生長(zhǎng)的酵母，細(xì)胞酶催化合成反應(yīng)液中GSH濃度逐漸提高，催化細(xì)胞胞內(nèi)積累GSH量以及酶法合成反應(yīng)得到的總GSH量也有所提高；當(dāng)肉桂醛調(diào)控濃度高于60 μg/mL，培養(yǎng)細(xì)胞催化合成反應(yīng)胞內(nèi)積累GSH濃度明顯下降,但合成反應(yīng)生成的總GSH量趨于平穩(wěn)；從圖5看出，檸檬醛調(diào)控濃度高于40 μg/mL時(shí)，生長(zhǎng)細(xì)胞催化合成反應(yīng)分泌胞外反應(yīng)液中的GSH量繼續(xù)增長(zhǎng)，而胞內(nèi)積累的GSH量逐漸降低；檸檬醛調(diào)控濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)，生長(zhǎng)細(xì)胞催化合成的GSH總量達(dá)到相對(duì)高值410 mg/L。綜合考慮調(diào)控生長(zhǎng)的細(xì)胞生物量和培養(yǎng)細(xì)胞的酶催化合成GSH的效率，45 μg/mL濃度肉桂醛調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)較為合理，培養(yǎng)細(xì)胞酶催化合成GSH達(dá)到446 mg/L。

圖4 不同濃度肉桂醛調(diào)控生長(zhǎng)細(xì)胞酶催化合成GSHFig.4 Enzymatic synthesis of GSH by yeast cells regulated with different concentration of cinnamyl aldehyde

圖5 不同濃度檸檬醛調(diào)控生長(zhǎng)細(xì)胞酶催化合成GSHFig.5 Enzymatic synthesis of GSH by yeast cells regulated with different concentration of citral

2.4 培養(yǎng)模式對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和合成GSH影響

選用葡萄糖作為碳源，初始發(fā)酵液葡萄糖的添加量為45 g/L，搖瓶裝液量為70 mL/250 mL，在細(xì)胞生長(zhǎng)到24 h后停止震蕩、補(bǔ)糖及控氧發(fā)酵，研究不同模式發(fā)酵對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及其GSH合成能力的影響。實(shí)驗(yàn)操作按以下模式：1. 空白；2. 培養(yǎng)24 h后添加25 g/L的葡萄糖，搖床繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)；3. 培養(yǎng)24 h后添加25 g/L的葡萄糖，靜止培養(yǎng)；4. 培養(yǎng)24 h后添加25 g/L的葡萄糖，靜止密封厭氧培養(yǎng)；5. 培養(yǎng)24 h后添加25 g/L的葡萄糖，低速(接近0)控溫(30 ℃)培養(yǎng)。后期繼續(xù)培養(yǎng)12 h，離心收集細(xì)胞，檢測(cè)生物量和細(xì)胞GSH合成能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6和圖7所示。

圖6 不同發(fā)酵模式對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和合成GSH能力的影響Fig.6 Effects of different fermentation modes on cell growth and synthesis of GSH

圖7 不同發(fā)酵模式培養(yǎng)的細(xì)胞酶催化合成GSH的能力Fig.7 Enzymatic synthesis of GSH by yeast cells cultured in different fermentation modes

從圖6和圖7中可以看出，補(bǔ)加葡萄糖操作對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)及其GSH的合成都具有一定的促進(jìn)作用；發(fā)酵過程搖床停止對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)一定的抑制，細(xì)胞發(fā)酵合成GSH的量有所降低，但培養(yǎng)細(xì)胞酶催化合成GSH的能力提高了，結(jié)果顯示，發(fā)酵培養(yǎng)24 h后補(bǔ)加葡萄糖并靜止培養(yǎng)，生長(zhǎng)細(xì)胞進(jìn)行酶催化合成GSH的能力相對(duì)明顯較高，其合催化成量達(dá)GSH量達(dá)到461 mg/L。

2.5 佳選發(fā)酵模式結(jié)合肉桂醛或檸檬醛調(diào)控對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及其合成GSH的影響

酵母發(fā)酵之前，向培養(yǎng)液中分別加入30、45、60、75、90、105 μg/mL濃度的肉桂醛,或加入60、80、100、120、140、160 μg/mL濃度的檸檬醛，選擇發(fā)酵模式3結(jié)合調(diào)控生長(zhǎng)培養(yǎng)細(xì)胞，研究其對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、培養(yǎng)細(xì)胞的GSH合成能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8和圖9所示。

由圖8和圖9可以看出，肉桂醛或檸檬醛調(diào)控結(jié)合發(fā)酵模式3培養(yǎng)，隨著調(diào)控試劑濃度的增加細(xì)胞生長(zhǎng)生物量呈下降趨勢(shì)，培養(yǎng)細(xì)胞的GSH分泌能力逐漸增強(qiáng)；當(dāng)肉桂醛調(diào)控濃度高于75 μg/mL，或檸檬醛調(diào)控濃度高于120 μg/mL，發(fā)酵液中分泌的GSH濃度逐漸降低，培養(yǎng)細(xì)胞合成GSH量總體呈下降趨勢(shì)，與生長(zhǎng)細(xì)胞的生物量減少成正相關(guān)。因此綜合優(yōu)化前后發(fā)酵法合成GSH的情況，可以看出，通過利用肉桂醛、檸檬醛調(diào)控細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的合成，從而提高細(xì)胞的傳質(zhì)能力的方法，由于細(xì)胞生物量的限制，對(duì)于促進(jìn)發(fā)酵法合成GSH的效果不明顯。

圖8 肉桂醛調(diào)控結(jié)合模式3培養(yǎng)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和GSH合成Fig.8 The growth and GSH synthesis of yeast cells regulated by cinnamyl aldehyde cultured in mode 3

圖9 檸檬醛調(diào)控結(jié)合模式3培養(yǎng)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和GSH合成Fig.9 The growth and GSH synthesis of yeast cells regulated by citral cultured in mode 3

2.6 佳選發(fā)酵模式結(jié)合肉桂醛、檸檬醛調(diào)控生長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞酶催化合成GSH的影響

收集分別經(jīng)過15、30、45、60、75、90 μg/mL濃度的肉桂醛，或20、40、60、80、100、120、140 μg/mL濃度的檸檬醛在發(fā)酵模式三下培養(yǎng)的酵母細(xì)胞，取2 g濕細(xì)胞，加入10 mL酶反應(yīng)液中，于37 ℃，進(jìn)行酶催化合成GSH，反應(yīng)6 h，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外GSH的含量，結(jié)果如圖10和圖11所示。

從圖10可以看出，在佳選模式下，經(jīng)過一定濃度肉桂醛或檸檬醛調(diào)控生長(zhǎng)的酵母，細(xì)胞酶催化合成反應(yīng)液中GSH濃度逐漸提高，催化細(xì)胞胞內(nèi)積累GSH量以及酶法合成反應(yīng)得到的總GSH量也有所提高；當(dāng)肉桂醛調(diào)控濃度達(dá)到60 μg/mL，培養(yǎng)細(xì)胞催化合成反應(yīng)胞內(nèi)積累GSH濃度明顯下降,但合成反應(yīng)生成的總GSH量趨于平穩(wěn)；從圖11看出，檸檬醛調(diào)控濃度達(dá)到60 μg/mL后，生長(zhǎng)細(xì)胞催化合成反應(yīng)分泌胞外反應(yīng)液中的GSH量繼續(xù)增長(zhǎng)，胞內(nèi)積累的GSH量變化不大，酶法合成反應(yīng)的總GSH量有所提高；檸檬醛調(diào)控濃度超過100 μg/mL后，生長(zhǎng)細(xì)胞催化合成反應(yīng)胞內(nèi)GSH積累量和總GSH量顯著下降。在佳選模式下，選用肉桂醛或檸檬醛調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)，綜合考慮調(diào)控生長(zhǎng)的細(xì)胞生物量和培養(yǎng)細(xì)胞的酶催化合成GSH的效率，45 μg/mL濃度肉桂醛或100 μg/mL的檸檬醛調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)較為合理，培養(yǎng)細(xì)胞酶催化合成GSH分別達(dá)到580 mg/L和551 mg/L，相較未處理細(xì)胞分別提高了107%和96.8%。

圖10 肉桂醛調(diào)控結(jié)合模式3培養(yǎng)酵母細(xì)胞催化合成GSHFig.10 Enzymatic synthesis of GSH by yeast cells regulated by cinnamyl aldehyde and cultured in mode 3

圖11 檸檬醛調(diào)控結(jié)合模式3培養(yǎng)酵母細(xì)胞催化合成GSHFig.11 Enzymatic synthesis of GSH by yeast cells regulated by citral and cultured in mode 3

3 結(jié)論

肉桂醛、檸檬醛對(duì)酵母細(xì)胞壁、膜的合成具有一定的調(diào)節(jié)作用。本研究利用肉桂醛和檸檬醛對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)調(diào)控，考察在肉桂醛或檸檬醛添加后，酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和合成GSH的情況，以及經(jīng)過肉桂醛或檸檬醛調(diào)控生長(zhǎng)的細(xì)胞酶催化合成GSH的效率；選擇發(fā)酵培養(yǎng)模式，結(jié)合肉桂醛、檸檬醛調(diào)控生長(zhǎng)，考察細(xì)胞的生長(zhǎng)和GSH的合成，以及調(diào)控生長(zhǎng)細(xì)胞酶催化合成GSH的能力。結(jié)果顯示，合適培養(yǎng)模式結(jié)合肉桂醛或檸檬醛調(diào)控生長(zhǎng)培養(yǎng)細(xì)胞，其催化合成GSH的濃度分別達(dá)到580 mg/L和551 mg/L，相較未處理細(xì)胞的合成能力分別提高107%和96.8%。同時(shí)看到，進(jìn)行調(diào)控生長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)中，發(fā)酵液中細(xì)胞分泌GSH量有所提高，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到一定抑制；調(diào)控生長(zhǎng)細(xì)胞酶催化合成GSH能力和分泌的反應(yīng)液中的量明顯高于對(duì)照細(xì)胞。這表明一定濃度的有機(jī)小分子化合物肉桂醛或檸檬醛，會(huì)影響酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞膜、壁的合成，導(dǎo)致生長(zhǎng)酵母的細(xì)胞膜、壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，改善細(xì)胞的GSH分泌能力，從而影響細(xì)胞的GSH合成的效率。

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