劉良宵，張雪靜，吳福玲，王海英

(濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東濱州256603)

毛細支氣管炎是一種以1～6個月嬰幼兒多見的下呼吸道感染性疾病，以呼吸道合胞病毒(RSV)感染最為常見。嬰兒RSV下呼吸道感染與哮喘有很強的相關性，且與哮喘嚴重程度相關[1,2]。RSV感染后誘發(fā)T細胞免疫應答，除Th1/Th2失衡外，Th17在毛細支氣管炎發(fā)展過程中也起到了重要的作用[3～5]。Notch信號通路是一種普遍存在的信號序列，該序列高度保守并且能夠調(diào)節(jié)T細胞的分化及發(fā)育[6,7]，γ促分泌酶抑制劑(GSI)MW167是其阻斷劑。Th17細胞主要產(chǎn)生IL-17，視黃酸受體相關孤核受體γt(RORγt)是Th17的特異性轉錄因子。本研究觀察了MW167對RSV毛細支氣管炎患兒外周血單個核細胞(PBMC)中Th17細胞比例、RORγt mRNA表達及細胞上清液中IL-17水平的影響，旨在為該疾病的免疫治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取第1次出現(xiàn)喘息、病程在2 d以內(nèi)，且入院后通過固相酶聯(lián)免疫吸附試驗顯示血清特異性RSV抗體IgM陽性的年齡小于2周歲的患兒?；純涸谏虾粑栏腥境跗诔霈F(xiàn)持續(xù)性的干咳和發(fā)作性的呼吸困難，聽診發(fā)現(xiàn)肺部喘鳴音輕重不等，胸片可顯示不同程度的梗阻性肺氣腫、支氣管周圍炎以及肺紋理增粗等改變，診斷均符合《諸福棠實用兒科學(第八版)》中毛細支氣管炎的診斷標準[8]。選擇2016年1月～2017年1月在濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院住院并診斷為RSV毛細支氣管炎的30例患兒作為觀察組，其中男19例、女11例，年齡(5.5±3.4)月。同時選擇來自我院兒保門診25例健康體檢兒作為對照組，其中男13例、女12例，年齡(5.2±3.3)月，兩周內(nèi)無感染，無服藥，且無家族過敏史及哮喘史，無過敏性疾病以及慢性病史。入選患兒均為排除先天性心臟病以及免疫缺陷等其他疾病，且沒有糖皮質(zhì)激素以及其他免疫抑制劑使用史的足月產(chǎn)嬰幼兒。觀察組與對照組性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義。本研究取得入選對象監(jiān)護人知情同意并獲濱州醫(yī)學院醫(yī)學倫理委員會批準同意。

1.2 實驗試劑 人淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；胎牛血清購自四季青公司；GSIⅡ(MW167)為德國默克密理博公司產(chǎn)品；PMA以及離子霉素購自北京索萊寶公司；抗人CD4-PerCP-Cy5.5、抗IL-17-PE購自美國BD公司；反轉錄及實時熒光定量PCR試劑盒購自Roche公司；引物由上海生工公司合成。

1.3 PBMC收集 入院后抽取兩組外周靜脈血3 mL(肝素抗凝)。向1只新的離心管中加入3 mL人淋巴細胞分離液，將患兒血液輕輕加入分離液表面，注意不要搖晃。室溫550 g離心30 min。離心后液體分為4層，自上而下依次是：紅細胞層(紅色)、分離液層(透明)、淋巴細胞層(即白膜層，白色)、血漿層(淡黃色)。吸取白膜層置于新的離心管，加入10 mL細胞洗滌液混勻，250 g離心10 min，棄上清，重復上述操作2次，離心管底部沉淀就是PBMC。

1.4 細胞分組干預及培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸所得的PBMC，調(diào)整細胞密度為1×106/mL，1 mL每孔接種于24孔板。將細胞分為正常組、RSV組、MW167組。正常組即為對照組兒童外周血分離所得的PBMC，每孔加入2 μL DMSO；RSV組為觀察組患兒外周血分離所得的PBMC，每孔加入2 μL DMSO；MW167組為觀察組患兒外周血分離所得的PBMC，每孔加入2 μL MW167(1 mg MW167溶于141.7 μL DMSO)。以上各組每孔加入10 μg/mL植物血凝素，混勻后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后收集細胞以及培養(yǎng)上清液。

1.5 各組PBMC中Th17細胞比例檢測 向上述三組細胞中加入終濃度分別為50 ng/mL的PMA，1 μg/mL的離子霉素以及1.5 μL/mL的莫能霉素，混勻后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h，收集細胞，并用140 μL RPMI1640培養(yǎng)基重懸。孵育后，細胞用PerCP-Cy5.5綴合的抗人CD4，PE綴合的抗IL-17單克隆抗體染色在室溫下避光染色40 min。給予同種型對照以實現(xiàn)正確的補償并確認抗體特異性。使用配備有Cell Quest軟件(BD Bioscience Phar-Mingen，San Jose，CA，USA)的FACS Calibur細胞儀通過流式細胞術分析染色的細胞，計算PBMC中Th17細胞比例。

1.6 各組PBMC細胞培養(yǎng)上清液中IL-17水平檢測 將各組離心后的上清液置于新的試劑管，隨后采用酶聯(lián)免疫法檢測培養(yǎng)液中IL-17的水平，按照說明書進行操作。

1.7 各組PBMC中RORγt mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR。TRIzol一步法提取離心后各組細胞沉淀中的總RNA，隨后對RNA進行反轉錄。反應體系如下：Random Hexamer Primer 2 μL，總RNA 3 μL，無核酸酶水8 μL，65 ℃ 10 min。反應完成后繼續(xù)向體系內(nèi)加入5×Transcriptor RT Reaction Buffer 4.0 μL，Transcriptor Reverse Transcriptase 0.5 μL，Protector RNase Inhibitor 0.5 μL，Deoxynuc-Ieo-tide Mix 2 μL，混勻試劑后按以下條件進行反應：25 ℃ 10 min，55 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。反應結束后將cDNA置于-20 ℃保存。以人GAPDH為內(nèi)參基因，上游引物：5′-GGTGTGAACCATGAGAAGTATGACA-3′，下游引物：5′-GTCCTTCCACGATACCAAAGTTGT-3′，產(chǎn)物長度為138 bp，通過SYBR Green RT-PCR檢測RORγt mRNA表達。人RORγt上游引物：5′-ACCTCACCGAGGCCATTCAG-3′,下游引物：5′-TAGGCCCGGCACATCCTAAC-3′，產(chǎn)物長度為117 bp。按照Roche PCR試劑盒說明反應體系如下：Fast Start Universal SYBR Green Master(ROX)10 μL，cDNA 2 μL，無核酸酶水7.6 μL，上、下游引物各0.2 μL。反應設定條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，40個循環(huán)。反應結束后將正常組基因表達設為1，獲得其他各組RORγt mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 各組PBMC中Th17細胞比例比較 正常組、RSV組、MW167組PBMC中Th17細胞比例分別為0.49%±0.09%、1.56%±0.77%、0.84%±0.23%，RSV組與正常組相比P<0.01，MW167組與RSV組相比P<0.05。

2.2 各組PBMC細胞培養(yǎng)上清液中IL-17水平比較 正常組、RSV組、MW167組PBMC細胞培養(yǎng)上清液中IL-17水平分別為(12.18±2.97)、(20.88±4.10)、(12.91±4.28)pg/mL，RSV組與正常組相比，MW167組與RSV組相比，P均<0.05。

2.3 各組PBMC中RORγt mRNA表達比較 正常組、RSV組、MW167組PBMC中RORγt mRNA相對表達量分別為1.0、5.72±0.53、1.82±0.21，RSV組與正常組相比，MW167組與RSV組相比，P均<0.05。

3 討論

毛細支氣管炎是1歲以內(nèi)嬰兒住院的最常見疾病，多見于冬春季節(jié)，RSV是最常見的病原體。2歲以下兒童發(fā)生RSV感染可能會嚴重威脅患兒的生命，并且也可能導致其他遠期的并發(fā)癥[9]。隨訪1歲以內(nèi)因RSV毛細支氣管炎入院的嬰兒至18歲，發(fā)現(xiàn)RSV毛細支氣管炎患兒發(fā)展為哮喘的概率是正常兒童的4.3倍，發(fā)生臨床過敏的概率是正常兒童的2.5倍[10]，進一步證實RSV毛細支氣管炎對健康存在長期威脅。毛細支氣管炎主要導致Th1/Th2的失衡[9,11]，以Th2的優(yōu)勢反應為主，近年研究顯示，Th17在毛細支氣管炎的發(fā)病過程中也起到重要作用。Th17細胞是CD4+T細胞的另一個族群，通過激活特異性轉錄因子RORγt分化，刺激炎癥反應，并增強對細胞外細菌、真菌和病毒的獲得性細胞免疫應答[12,13]。

李賓等[4]研究發(fā)現(xiàn)，RSV毛細支氣管炎患兒外周血中Th17細胞比例較正常兒童明顯升高，本實驗中對RSV組患兒PBMC中Th17細胞比例進行檢測得出與其相同的趨勢，提示RSV毛細支氣管炎患兒外周血中存在Th17數(shù)量的變化。Jafri等[14]發(fā)現(xiàn)，在急性中性粒細胞炎癥和哮喘發(fā)病過程，肺組織中IL-17過度表達，且嚴重RSV感染的嬰兒氣管吸出物樣品中IL-17水平增加，同時RSV感染小鼠模型中觀察到IL-17的表達呈現(xiàn)時間依賴性增加[3,15]；檢測RSV毛細支氣管炎患兒外周血也發(fā)現(xiàn)，臨床癥狀越重的患兒外周血中IL-17水平越高[16]，提示IL-17水平與疾病發(fā)展密切相關。本實驗對各組PBMC細胞培養(yǎng)上清液中IL-17水平檢測后發(fā)現(xiàn)，RSV組IL-17水平較正常組升高，進一步印證了IL-17與疾病的相關性。RORγt可以誘導未成熟CD4+T細胞產(chǎn)生IL-17，調(diào)控Th17細胞的分化[17]。對毛細支氣管炎的大鼠模型和正常大鼠血漿內(nèi)的IL-17以及RORγt進行檢測發(fā)現(xiàn)，模型組Th17相關的細胞因子及蛋白均增高[18]，這與本實驗結果相一致。以上研究結果提示Th17細胞因子IL-17以及轉錄因子RORγt在RSV毛細支氣管炎發(fā)病過程中發(fā)揮促進作用，進一步加重疾病的進程。

Notch信號通路是一種在哺乳動物中廣泛存在的通路，4種Notch受體(Notch1～4)被5種跨膜結合配體(Jagged1-2及DLL1、3、4)活化，細胞質(zhì)Notch被γ-分泌酶切割，導致釋放Notch活性細胞內(nèi)結構域(NICD)，隨后NICD進入細胞核調(diào)節(jié)相關基因的表達[7]，繼而發(fā)揮其相關作用。多個研究[7,19]顯示，Notch信號通路在T細胞的增殖、分化以及細胞功能調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用，GSI是Notch信號通路的阻斷劑，抑制NICD的釋放，從而調(diào)節(jié)T細胞的免疫應答。

Notch信號通路是控制Th17細胞存活和凋亡模式的關鍵信號傳導途徑[20]。Notch可以直接激活轉錄因子RORγt，這對Th17的分化至關重要[21]；另有研究[22,23]顯示，除了RORγt，Notch信號通路也直接調(diào)節(jié)IL-17的水平。因此，IL-17以及RORγt在一定程度上反映Th17細胞的水平及變化趨勢，而在疾病過程中，Notch信號通路可能通過對Th17相關細胞因子以及轉錄因子的調(diào)節(jié)參與炎癥進程。

Zhang等[24]發(fā)現(xiàn)，應用GSI后的哮喘模型大鼠氣道炎癥有所改善，臨床癥狀也有緩解，提示GSI在一定程度上可以緩解哮喘的臨床及病理表現(xiàn)，有可能是治療哮喘的有效措施。在前期動物實驗[25]過程中，HE染色證明使用GSI處理后的RSV毛細支氣管炎大鼠模型的氣道炎癥有明顯好轉，這提示GSI對于RSV毛細支氣管炎可能也有與哮喘相一致的治療作用。

Amsen等[6]發(fā)現(xiàn)，當在體外誘導Th17細胞時抑制Notch的活化可導致Th17細胞的分化降低，并且用GSI治療小鼠時Th17細胞也明顯減少，說明Notch信號通路可以調(diào)節(jié)Th17的數(shù)量，影響炎癥發(fā)展及過程。在體內(nèi)試驗中，楊鑫娜等[26]比較COPD小鼠以及用GSI處理后的COPD小鼠體內(nèi)Notch以及Th17細胞的表達發(fā)現(xiàn)，在COPD小鼠中存在Notch信號通路的增強以及Th17細胞的增多，GSI可以部分抑制Notch信號表達和Th17細胞的數(shù)量。本實驗結果顯示，MW167組Th17細胞在PBMC中的比例較RSV組明顯降低，提示GSI可以抑制Th17細胞的表達，結果與前者相一致。研究[24]顯示，與對照組相比，用GSI處理過的哮喘大鼠NICD水平降低，血漿中IL-17水平降低，而在本實驗中，MW167組細胞培養(yǎng)上清液中IL-17減少。前期動物實驗[25]中，用GSI處理過的RSV毛細支氣管炎大鼠模型的肺組織中NICD以及RORγt的蛋白表達降低，在細胞實驗中，Yu等[27]用GSI阻斷血小板減少癥患者PBMC中Notch信號通路后，Th17細胞呈劑量依賴性降低，細胞培養(yǎng)上清液中IL-17減少且RORγt mRNA表達降低，提示GSI可能是通過抑制IL-17以及RORγt的表達調(diào)節(jié)Th17細胞的水平，從而參與疾病過程。而在本實驗中，MW167組較RSV組RORγt mRNA表達降低，與上述的結論相一致。本研究結果提示GSI能夠降低Th17細胞轉錄因子以及細胞因子的表達，進一步調(diào)節(jié)Th17細胞的比例，為毛細支氣管炎的治療提供一條新的思路。

目前RSV毛細支氣管炎的治療僅是對癥支持治療，近年來，對RSV的疫苗研究十分熱門，但是截止到目前為止，仍沒有安全有效的疫苗上市，因此，尋求有效安全的特異性治療方法刻不容緩。在培養(yǎng)PBMC時加入GSI后PBMC中Th17細胞比例、Th17的細胞因子IL-17以及特異性轉錄因子RORγt均降低，緩解了疾病過程中Th17的增長，提示GSI可能對于抑制RSV毛細支氣管炎的疾病發(fā)展能夠起到一定的作用，為RSV毛細支氣管炎的免疫學治療提供了一個新的研究方向。

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