吳 憂，莫書榮，張 鑫（廣西醫(yī)科大學生理教研室，廣西南寧530021）

腫瘤是一類常見且多發(fā)的疾病，是導致人類死亡的主要原因之一。根據(jù)我國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析，全國惡性腫瘤發(fā)病與死亡第1位均為肺癌[1]。據(jù)報告顯示，我國2015年估計有4 292 000例癌癥新發(fā)病例，2 814 000例癌癥死亡，肺癌成為最常見癌癥，也是癌癥死亡的首要原因[2]。

肺癌按其組織學分型有以下2種基本類型：小細胞肺癌（SCLC）和非小細胞肺癌（NSCLC），其中20%的肺癌患者屬于SCLC，特點為腫瘤細胞倍增時間短，進展快，常伴內分泌異?；蝾惏┚C合征；而另外80%的NSCLC患者中又被分成以下4種類型：鱗癌、腺癌、腺鱗癌和類癌，其中腺癌占肺癌的40%以上，女性多于男性，且易發(fā)生轉移及血性胸腔積液。近20多年來腫瘤化療發(fā)展迅速，應用越來越廣泛。通過臨床實踐，化療對SCLC的療效無論是早期或晚期都較為肯定，甚至有根治的少數(shù)報告?；煂SCLC也有一定療效，但僅為姑息，作用有待進一步提高。當前早期NSCLC的治療主要是手術治療，而中晚期腫瘤則以化療為主。而化療會抑制骨髓造血系統(tǒng)，主要是白細胞和血小板的下降，因此限制了其化療藥物的使用劑量[3]。

中藥因其獨特的抗腫瘤特性在全球范圍內越來越引人關注，研究表明，中醫(yī)治療肺癌能減輕手術，放、化療的不良反應，提高機體免疫力和患者生活質量[4-5]，而黃芪作為我國的傳統(tǒng)中藥便是其中之一。藥理實驗及臨床報道表明，黃芪在免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、糖尿病、延緩衰老等方面具有重要作用[6]。近年來通過對黃芪中的有效成分如黃芪多糖、黃芪甲苷的研究，臨床對其抗腫瘤的作用及機制更加了解。本課題組通過使用黃芪注射液作為實驗藥物探究其對肺癌A549細胞的作用來尋找其適宜的作用濃度及時間。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 本科室凍存的人肺腺癌A549細胞系。

1.1.2 儀器與試劑 黃芪注射液（質量濃度為2000mg/mL，神威藥業(yè)集團有限公司）；RPMI-1640（Hyclone公司）；胎牛血清（Gibco公司）；青霉素、鏈霉素（索萊寶科技有限公司）；活細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8，同仁公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，武漢博士德生物工程有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）；胰蛋白酶（北京博奧拓達科技有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2，北京索萊寶科技有限公司）；96孔板（Corning公司）；YJ.875型醫(yī)用超凈臺（吳江市空氣凈化設備廠）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）；TD6M臺式離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）；移液槍（Eppendorf公司）；酶標儀（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 0.25%胰蛋白酶溶液的配制 稱取0.25 g胰蛋白酶粉劑和0.04 g EDTA-Na2同時溶于高壓后放涼的100 mL PBS中，待完全溶解后用過濾器過濾溶液，密封放置4℃保存，使用時取出。

1.2.2 人肺腺癌A549細胞的培養(yǎng) 人肺癌A549細胞用RPMI-1640培養(yǎng)基配成的完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 mg/L）培養(yǎng)，隔天換培養(yǎng)液，細胞長滿單層細胞瓶后，用0.25%胰蛋白酶消化2 min后，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化，用巴氏吸管吹下貼壁細胞后吸入離心管，以700 r/min離心5 min后取出棄上清，加入培養(yǎng)基重懸，再分至新細胞培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察A549細胞形態(tài) 培養(yǎng)細胞并將其種于6孔板中，設對照組和不同質量濃度（100、200、400、600、800 mg/mL）的黃芪注射液組。在細胞生長貼壁約為孔板底部的80%時，加入不同質量濃度的黃芪注射液，培養(yǎng)24 h觀察細胞形態(tài)，實驗重復3次。

1.2.4 CCK-8法檢測藥物效應 取對數(shù)生長期A549細胞，調整濃度為2×104個/mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，同時設置空白調零孔，每組設置5個副孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。第2天，用1.5 mL EP 管配制質量濃度分別為 100、200、400、600、800 mg/mL的黃芪注射液，每孔110μL替換原有的全部培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。分別培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入10μL CCK-8試劑繼續(xù)混合培養(yǎng)1.5 h顯色。酶標儀檢測光密度（OD）值（檢測波長為 450 nm），實驗重復3次，匯總OD450值，計算抑制率，抑制率=[（對照組平均OD450值－實驗組平均OD450值）/（對照組平均OD450值－空白組平均OD450值）]×100%。黃芪注射液的半數(shù)抑制濃度（IC50）采用改良寇氏法[7-8]：lgIC50=Xm-I[P-（3-Pm-Pn）/4]，其中Xm：lg（最大劑量），I：lg（最大劑量/相臨劑量），P：陽性反應率之和，Pm：最大陽性反應率，Pn：最小陽性反應率。

1.3 數(shù)據(jù)處理 采用Excel2010對數(shù)據(jù)進行匯總及初步處理，應用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行差異性分析，其所有數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。文中所用圖采用GraphPad Prism 5軟件制作。

2 結 果

2.1 細胞形態(tài)學觀察 對照組及100、200、400 mg/mL的黃芪注射液組細胞貼壁生長，形態(tài)呈上皮樣，多角形，核仁明顯，胞質飽滿，邊界清晰。在600 mg/mL黃芪注射液組中，可見部分細胞體積變小、形態(tài)變圓，皺縮，與鄰近細胞分離，但仍有部分細胞貼壁生長；在800 mg/mL黃芪注射液組中，大部分細胞變圓且失去貼壁特性，呈現(xiàn)明顯的細胞增殖抑制。見圖1。

圖1 各組A549細胞形態(tài)變化（20×）

2.2 黃芪注射液對A549細胞的作用 作用24 h時，100、200、400 mg/mL黃芪注射液組對細胞有促生長作用，但隨著濃度的增加而減弱，600、800 mg/mL黃芪注射液組對細胞有抑制作用，且隨濃度的增加而增強；作用48 h時，作用效果大致與24 h相同；而作用72 h后，400 mg/mL黃芪注射液組不再具有促細胞生長作用，600、800 mg/mL黃芪注射液組的抑制作用增強，見圖2。作用 24、48 h 后，100、200、800 mg/mL 黃芪注射液組與對照組的OD450值比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；作用 72 h 后，100、200、400、600、800 mg/mL 黃芪注射液組與對照組的OD450值比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 黃芪注射液作用肺癌A549細胞的IC50計算 根據(jù)改良寇氏法計算 24、48、72 h 的 IC50分別為 776、851、616 mg/mL，作用48 h時，黃芪注射液對A549細胞有明顯的促生長作用，而在72 h時，黃芪注射液對A549細胞的抑制作用明顯增強。

圖2 不同質量濃度黃芪注射液作用不同時間對A549細胞生長的作用

表1 各組作用不同時間A549細胞OD450值的比較（±s）

表1 各組作用不同時間A549細胞OD450值的比較（±s）

注：與對照組同時間比較，aP＜0.05；與同組72 h比較，bP＜0.05

組別對照組黃芪注射液質量濃度（mg/mL）100 200 400 600 800作用時間（h）24 0.342±0.023 48 0.342±0.023 72 0.664±0.063 0.389±0.034ab 0.369±0.025ab 0.352±0.033b 0.325±0.027b 0.290±0.027ab 0.389±0.034ab 0.369±0.025ab 0.352±0.033b 0.325±0.027b 0.290±0.027ab 0.835±0.074a 0.782±0.089a 0.551±0.057a 0.436±0.062a 0.378±0.041a

3 討 論

肺癌是全世界目前惡性腫瘤死亡的首要原因，放、化療方案因其確切的療效一直是NSCLC臨床治療的首選，但其對人體血液系統(tǒng)有不良反應。在我國，中醫(yī)藥治療惡性腫瘤歷史悠久，并且中醫(yī)藥治療肺癌有自己獨特的理論體系和確切療效，中西醫(yī)學互為補充、相互交融的模式成為肺癌治療發(fā)展的方向與趨勢[9]，黃芪也因其抗腫瘤的特性備受關注。

本研究通過用黃芪注射液作用A549細胞觀察其細胞形態(tài)的變化和增殖的影響，發(fā)現(xiàn)其在低濃度和短時間時對A549細胞有促生長的作用，加大濃度及延長作用時間能顯著增強黃芪注射液對A549細胞的明顯抑制作用。不同于黃芪單一活性成分的研究，如黃芪多糖[10]、黃芪甲苷[11]，均具有明顯A549細胞抑制作用，而對細胞的促生長作用未在實驗中發(fā)現(xiàn)。本研究結果顯示，黃芪注射液在低濃度、短作用時間時對A549細胞具有促生長作用，其抑制作用在高濃度、長作用時間時顯著。黃芪化學成分復雜，目前研究已經(jīng)證實主要含有多糖、黃酮、皂苷及氨基酸等活性物質[12]。而腫瘤細胞自身不能合成氨基酸，所以其生長增殖所需皆需從外界獲取。本實驗中所用黃芪注射液中含有多種氨基酸，可能對肺癌A549細胞產(chǎn)生一定的促生長作用。

另就計算得出的黃芪注射液對肺癌A549細胞的IC50而言（計算得出作用細胞24、48、72 h的IC50分別為776、851、616 mg/mL），其濃度先升后降，初步可以得出，黃芪注射液作用A549細胞需要較高濃度及更長的作用時間才能達到較好的抑制效果。而如果需要得出更精確的、能適用于臨床治療的IC50仍需進一步進行細胞體內實驗來探索驗證。

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