張華，高偉忠（.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州遵義563003；.遵義市第一人民醫(yī)院麻醉科，貴州 563000）

缺血再灌注損傷（IR）是由JENNINGS于1960年首次提出，指組織、器官缺血后再灌注，不僅不能使組織器官功能恢復(fù)，反而因凋亡因子、炎癥介質(zhì)的釋放及自由基的作用等多種因素加重其結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙。肝IR是一個多因素、多環(huán)節(jié)、多途徑損傷的級聯(lián)反應(yīng)過程，而缺血預(yù)處理是抗IR的有效措施[1]。

紅景天主要活性成分為紅景天苷，研究表明，紅景天苷具有抗疲勞、抗缺氧、抗纖維化等藥理作用[2-5]。但對肝IR的影響機制尚不完善。本實驗擬建立大鼠肝缺血再灌注模型，分別采用TUNEL法檢測肝細胞凋亡、免疫組織化學(xué)方法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達，探討紅景天苷對肝缺血再灌注肝細胞凋亡的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料及動物 兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體、兔抗鼠Bax多克隆抗體、總蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；TUNEL試劑盒（德國ROCHE）；Olympus全自動生化分析儀；紅景天苷粉劑（昆明同持生物技術(shù)公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 將56只SD大鼠分為肝缺血再灌注組（IR 組，n=24）、紅景天苷組（S組，n=24）及假手術(shù)組（C組，n=8），參照Pringle法[6]建立模型。IR組及 S組按再灌注1、3、6 h分為3個亞組。IR組采用夾閉肝蒂全肝缺血30 min，再灌注的方法建立大鼠肝缺血再灌注模型；S組大鼠分別于夾閉前24、48、72 h腹腔注射紅景天苷溶液，劑量40 mg/kg（8 g/L）；C組僅暴露肝蒂，不阻斷肝臟血流。實驗結(jié)束后腹主動脈取血，所取大鼠肝組織以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制作切片，部分肝組織-80℃冰箱保存。

1.2.2 大鼠血清生化指標檢測 生化分析儀檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性。

1.2.3 大鼠肝組織Bcl-2、Bax蛋白表達測定 采用二步免疫組織化學(xué)染色法（PV法）觀察Bcl-2、Bax蛋白表達情況。結(jié)果判定：Bcl-2、Bax蛋白光鏡下觀察細胞質(zhì)呈棕黃色或黃褐色顆粒為陽性染色，每個標本在200倍光學(xué)顯微鏡下隨機觀察15個視野，計算陽性細胞所占視野的百分比（陽性面積積分），進行半定量分析。

1.2.4 TUNEL法檢測大鼠肝組織凋亡表達 4%多聚甲醛固定肝組織標本，常規(guī)石蠟包埋、切片，采用TUNEL方法檢測肝細胞凋亡，具體步驟參照產(chǎn)品說明書，每張切片取5個視野，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)計數(shù)單位面積內(nèi)陽性細胞數(shù)（陰性細胞核呈藍色，陽性細胞核呈紅色），計算平均100個肝細胞中的凋亡細胞數(shù)，即凋亡指數(shù)（AI）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有實驗數(shù)據(jù)均以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清ALT、AST活性比較 IR組大鼠血清ALT、AST水平在再灌注后1 h開始上升，3 h左右升高最明顯，隨著時間延長各指標值逐漸下降，但均高于S組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。S組與IR組同一時間比較，ALT、AST指標值均有所下降，但2組均高于C組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清 ALT、AST活性比較（±s，U/L）

表1 各組大鼠血清 ALT、AST活性比較（±s，U/L）

注：與C組比較，aP＜0.05；與IR組同時間比較，bP＜0.05

?

2.2 各組大鼠肝組織Bcl-2、Bax蛋白表達情況比較 與C組比較，IR、S組肝組織中Bcl-2、Bax蛋白表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與IR組比較，S組Bcl-2蛋白表達水平升高，Bax蛋白表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2，圖1、2。

表2 各組大鼠肝組織Bcl-2、Bax蛋白表達情況比較（±s）

表2 各組大鼠肝組織Bcl-2、Bax蛋白表達情況比較（±s）

注：與C組比較，aP＜0.05；與IR組同時間比較，bP＜0.05

?

圖1 肝組織Bcl-2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（200×）

圖2 肝組織Bax免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（200×）

2.3 各組大鼠肝組織細胞凋亡情況比較 IR組、S組肝細胞凋亡增加，與C組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且再灌注3 h后2組肝細胞凋亡最明顯。與IR組比較，S組肝細胞凋亡明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3、圖3。

表3 各組大鼠肝細胞AI比較（±s）

表3 各組大鼠肝細胞AI比較（±s）

注：與C組比較，aP＜0.05；與IR組同時間比較，bP＜0.05

?

圖3 肝組織細胞凋亡結(jié)果（200×）

3 討 論

本實驗參照Pringle法建立肝IR模型，TUNEL法檢測肝細胞凋亡發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注1 h肝細胞出現(xiàn)少量凋亡，隨著時間推移，在肝缺血再灌注3 h時肝細胞凋亡最明顯。細胞凋亡是細胞基因調(diào)控的一種程序性主動自殺式行為，是保持機體穩(wěn)態(tài)的基本過程，但是凋亡過度則會引起組織細胞損傷，進而導(dǎo)致臟器組織功能障礙。在機體細胞凋亡過程中，凋亡調(diào)控基因發(fā)揮不同作用，共分為3類，抑制細胞凋亡的基因，包括Bcl-2、突變型p53等；促進細胞凋亡的基因，包括Bax、野生型p53、C-myc等；在細胞凋亡過程中表達的基因，包括p53、cyclin-D、HSP-70 等[7]。在肝臟缺血再灌注發(fā)生、發(fā)展過程中，大量氧自由基生成造成細胞線粒體水腫誘發(fā)細胞凋亡。在線粒體調(diào)控細胞凋亡的體系中，Bcl-2家族成員構(gòu)成錯綜復(fù)雜的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)相互作用，共同調(diào)節(jié)細胞凋亡。Bcl-2、Bax是Bcl-2家族與凋亡關(guān)系最密切的基因。Bax促進細胞凋亡，其位于細胞線粒體膜上，隨著Bax過度表達，組織細胞凋亡可能與細胞活性氧簇的增加及細胞線粒體膜電位丟失有關(guān)[8]。Bcl-2與Bax作用相反，其位于細胞線粒體外膜上，Bcl-2蛋白同源二聚體通過減輕細胞內(nèi)鈣超載、阻止線粒體PT孔的開放等發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用[9]。研究報道，Bax/Bcl-2蛋白還可通過改變線粒體膜的通透性，抑制caspase-3的激活來抑制細胞凋亡[10]。

近年研究表明，紅景天苷對缺血再灌注臟器損傷具有一定的保護作用[11-12]。本實驗中，肝缺血再灌注后血清ALT、AST水平升高，經(jīng)紅景天苷預(yù)處理后，血清ALT、AST水平均明顯下降。在缺血再灌注1 h時肝細胞出現(xiàn)凋亡，在3 h時肝細胞凋亡達到峰值，紅景天苷預(yù)處理肝細胞凋亡明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明紅景天苷可顯著減少肝細胞凋亡，對肝IR有保護作用，同時，S組較IR組Bcl-2蛋白表達增加，Bax蛋白表達下降，說明紅景天苷對肝IR的保護作用可能通過上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax表達，改變Bcl-2、Bax基因表達及蛋白表達，從而減少肝細胞凋亡。

綜上所述，紅景天苷對肝IR具有保護作用，該作用與Bcl-2/Bax基因調(diào)控細胞凋亡密切相關(guān)，但是紅景天苷對其保護作用還可能存在其他機制，有待深入探討。

[1]RüDIGER HA，KANG KJ，SINDRAM D，et al.Comparison of ischemic preconditioning and intermittent and continuous inflow occlusion in the murine liver[J].Ann Surg，2002，235（3）：400-407.

[2]劉東璞，盧鳳美，王明富，等.紅景天對大鼠肝纖維化肝臟組織中TIMP-1、Smad4 表達的影響[J].中國老年學(xué)雜志，2012，32（12）：2556-2558.

[3]石路，張延猛，李洋洋，等.紅景天對高原缺氧環(huán)境下人體運動前后血流動力學(xué)的作用[J].西北國防醫(yī)學(xué)雜志，2016，37（7）：159-456.

[4]榮黎，戴立罩，曾維政.紅景天甙對擬高原缺氧大鼠肝損傷的保護作用[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（31）：5813-5817.

[5]陳亞東，曹秀蘭，田長有，等.高山紅景天對小鼠耐缺氧、抗疲勞及耐低溫作用的影響[J].中國中醫(yī)藥科技，2002，9（3）：157-158.

[6]MAEHARA S，ADACHI E，SHIMADA M，et al.Clinical usefulness of biliary scope for Pringle′s maneuver in laparoscopic hepatectomy[J].J Am Coll Surg，2007，205（6）：816-818.

[7]宋勇.活性氧與細胞凋亡的研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)呼吸系統(tǒng)分冊，1997，1（17）：30-32.

[8]HADDAD JJ.The role of Bax/Bcl-2 and pro-caspase peptides in hypoxia/reperfusion-dependent regulation of MAPK（ERK）：discordant proteomic effect of MAPK（p38）[J].Protein Pept Lett，2007，14（4）：361-371.

[9]祝海洲，詹自力，何衛(wèi)陽，等.地塞米松和川芎嗪對腎缺血再灌注時c-Fos、Bcl-2、ICAM-1蛋白表達的影響[J].中國病理生理雜志，2004，20（5）：893-895.

[10]ABOUTALEB N，SHAMSAEI N，RAJABI H，et al.Protection of hippocampal CA1 neurons against ischemia/reperfusion injury by exercise preconditioning via modulation of Bax/Bcl-2 ratio and prevention of caspase-3 activation[J].Basic Clin Neurosci，2016，7（1）：21-29.

[11]廖國平，鄧芳文，孫德貴，等.紅景天苷對局灶性缺血-再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡及對 Bax、Bcl-2 的影響[J].海峽藥學(xué)，2016，28（4）：33-37.

[12]高琨，胡美琴，祁洪剛，等.紅景天苷對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的預(yù)防保護時限[J].吉林大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2012，38（4）：687-691.