王 靜，梁 琳 ，羅亞坤，袁維峰 ，崔尚金★

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.農(nóng)業(yè)部獸用藥物與獸醫(yī)生物技術(shù)北京科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，北京 100193）

犬冠狀病毒(Canine coronavirus,CCoV)感染犬并引起以胃腸炎為主要癥狀的高度接觸傳染病，一年四季均可發(fā)生，但冬季多發(fā)，主要感染犬科動(dòng)物，其他動(dòng)物如大熊貓等也具

★通訊作者：崔尚金(1971～),男,山東省青州市人,研究員,博士生導(dǎo)師。有易感性，對(duì)幼齡犬危害最為嚴(yán)重。1971年在一只患有腹瀉的德國(guó)軍犬中首次報(bào)道了CCoV感染，目前已呈世界性分布；1995年，我國(guó)首次從患病犬的心臟和胃腸內(nèi)容物中分離得到CCoV，并于2009年從死亡的大熊貓中分離到。CCoV與其他病原體如犬細(xì)小病毒共感染時(shí)往往導(dǎo)致致死性腹瀉。近幾年，CCoV變異株的出現(xiàn)，可導(dǎo)致犬全身感染以及犬的高死亡率，給養(yǎng)犬業(yè)、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和野生動(dòng)物保護(hù)帶來沉重的打擊。

N蛋白是CCoV顆粒中比較豐富的結(jié)構(gòu)蛋白，與病毒RNA緊密結(jié)合構(gòu)成病毒的核心。N蛋白不僅對(duì)RNA的轉(zhuǎn)錄起重要作用，而且還是免疫識(shí)別的相關(guān)靶位點(diǎn)，可介導(dǎo)宿主細(xì)胞免疫。

1 材料與方法

1.1 病毒株、質(zhì)粒及菌株

犬冠狀病毒BC-1株、小鼠抗N蛋白抗體和表達(dá)載體pET-32a由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所寵物疫病防控創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室提供；pMD19-T載體購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DAB顯色試劑盒購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)科技有限公司。

1.2 主要試劑

病毒RNA快速提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中登錄的CCoV（ AB781800.1）基因組序列，利用DNAStar和Primer Premier 5軟件，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用于擴(kuò)增CCoV N基因目的片段，序列為：CCoV-N-F:5′-CGGGATCCATGGCCAACCAGGGACAACGCG-3′CCoV-N-R:5′-CGGAA TTCTTAGTTCGTTACCTCATCAATAATC-3′(下劃線堿基分別是BamHⅠ和EcoRⅠ)，預(yù)期片段長(zhǎng)度為1165 bp。引物由北京華大生物科技生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

重組表達(dá)載體pET-32a-CCoV-N的構(gòu)建與鑒定參照文獻(xiàn)進(jìn)行。

1.5 表達(dá)條件的優(yōu)化

采用不同的誘導(dǎo)時(shí)間和不同的IPTG濃度摸索N蛋白的最適表達(dá)條件。

1.6 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

采用12%SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。

1.7 重組蛋白的western blot鑒定

將重組蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠電泳后，利用半干法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，用TBST配成的5%脫脂乳4℃封閉過夜；以鼠抗His標(biāo)簽MAb（1:2000稀釋）為一抗，山羊抗小鼠IgG-HRP（1:5000稀釋）為二抗，利用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色。鑒定得到特異的目的條帶后利用鼠抗N蛋白的抗體作為一抗按照相同的方法進(jìn)行western blot檢測(cè)。

1.8 序列分析

利用DNAStar中的MegAlign軟件對(duì)CCoV BC-1株N基因與GenBank發(fā)表的6株CCoV參考株序列進(jìn)行比對(duì)，并用Mega 5.0軟件對(duì)其進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，繪制遺傳進(jìn)化樹。

1.9 生物信息學(xué)分析

應(yīng)用 Protparam在線軟件（http://web.expasy.org/protparam/）對(duì)犬冠狀病毒BC-1株N基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)；應(yīng)用 InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）分析N蛋白的結(jié)構(gòu)與功能。利用SOPMA（http://metadatabase.org/wiki/SOPMA）軟件預(yù)測(cè)N蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；應(yīng)用DNAS-tarProtean軟件，預(yù)測(cè)N蛋白的B細(xì)胞抗原表位。

2 結(jié)果與討論

2.1 N基因的克隆與表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示在約1165 bp處有目的片段，構(gòu)建了表達(dá)載體，利用優(yōu)化的條件表達(dá)菌體，超聲破碎后離心，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示，上清幾乎無(wú)目的蛋白，而沉淀在62 ku處出現(xiàn)明顯的特異性條帶，故表達(dá)的N重組蛋白主要以包涵體形式存在（圖1）。

圖1 N基因RT-PCR擴(kuò)增

2.2 western blot分析

分別利用鼠抗His標(biāo)簽的抗體和鼠抗N蛋白的抗體作為一抗進(jìn)行western blot鑒定，結(jié)果顯示得到與預(yù)期相符的大小分別為62 ku和43ku的特異性目的條帶（圖2），表明正確表達(dá)目的蛋白（His-N）。

圖2 CCoV蛋白的Western blotting分析

2.3 CCoV BC-1株N基因的遺傳進(jìn)化分析

利用生物軟件Mega 5.0最大相似法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），結(jié)果顯示犬冠狀病毒BC-1株與CCoV A76株和CCoV HLJ-072株位于同一分支中，有較近親緣關(guān)系。

圖3 N基因核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.4 生物信息學(xué)分析

理化性質(zhì)預(yù)測(cè)表明N基因全長(zhǎng)為1149 bp，編碼個(gè)382氨基酸，賴氨酸和絲氨酸含量最高。絲氨酸易于形成β-轉(zhuǎn)角，而賴氨酸易于形成α-螺旋，所以N蛋白可能具有高度纏繞和螺旋的結(jié)構(gòu)。N基因的親水性平均系數(shù)（GRAVY）是-1.190，為親水性蛋白，有利于N蛋白的高效表達(dá)。應(yīng)用InterProScan軟件分析N蛋白的結(jié)構(gòu)和功能域（圖4A），從預(yù)測(cè)結(jié)果可知，第6～164位為RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（SSF110304)，在體內(nèi)能夠結(jié)合冠狀病毒產(chǎn)生的RNA序列；第229～335位為核衣殼蛋白二聚體結(jié)構(gòu)域 (SSF103068)；第1～29位、第121～240位和第 328～362 位為紊亂區(qū)（mobidb-lite），對(duì)這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域功能不知，也未見相關(guān)報(bào)道（圖4A）。利用在線軟件SOPMA預(yù)測(cè)，結(jié)果表明N蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最大,這可能使得N蛋白特定功能活性部位具有較大構(gòu)象柔性，有利于與病毒RNA結(jié)合，也易于形成抗原表位（圖4B）。 應(yīng)用DNAStar Protean軟件，結(jié)合N蛋白的靈活性、親水性、表面呈現(xiàn)性和抗原指數(shù)預(yù)測(cè)N蛋白含有9個(gè)潛在優(yōu)勢(shì) 抗 原 表 位 ， 分 別 位 于 N 端 第 11～29、73～75、80～88、154～188、210～234、180～182、210～230、312～319 和 346～350位（圖4C）。由于未考慮各氨基酸之間的分子間作用力和立體結(jié)構(gòu)的限制，因而試驗(yàn)結(jié)果只能作為確定N蛋白潛在優(yōu)勢(shì)抗原表位的參考。

3 小結(jié)

本研究對(duì)犬冠狀病毒BC-1株N蛋白進(jìn)行原核表達(dá)并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為N蛋白的進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)。由于核蛋白的高度保守性及其在致病性和病毒復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過程中的作用，通過其在體外的大量表達(dá)，可作為診斷抗原，也可用其制備抗血清及單克隆抗體進(jìn)行疾病診斷；同時(shí)N基因的克隆與表達(dá)，為進(jìn)一步探討該病毒的分子致病特性及新型抗病毒藥物的研制提供基礎(chǔ)。

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圖4 CCoV BC-1株N蛋白的分子結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)