唐 成

（四川省遂寧市船山區(qū)畜牧食品局，四川 遂寧 629000）

動物附紅細(xì)胞體病是豬、牛、羊等多種動物包括人都能感染的人畜共患傳染病。羊附紅細(xì)胞體病的臨床特征為貧血、體質(zhì)虛弱。該病主要多發(fā)于綿羊養(yǎng)殖和生產(chǎn)比較多的國家，但其發(fā)病率不高，多呈潛伏感染，所以診斷有一定的難度。對羔羊的影響是發(fā)育不良，死亡率較低。目前該病的診斷多通過鏡檢，但準(zhǔn)確性較差，已得到了業(yè)界的關(guān)注和研究。建立血清學(xué)診斷以及分子生物學(xué)診斷的前提條件是抗原純化。而當(dāng)前對該病的血清學(xué)診斷主要是利用粗制附紅細(xì)胞體抗原，在抗原制備過程中，對溶液進行振蕩和水溶操作易造成溶血現(xiàn)象，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，研究出了一種羊附紅細(xì)胞體高純度抗原的有效制備方式——體外驅(qū)蟲法。這一方法對羊附紅細(xì)胞體病的診斷提供了先進的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 試驗材料

主要是采集本地區(qū)羊養(yǎng)殖場的羊血，數(shù)量要大于800mL。在實驗中主要使用的制劑是雙向紅蓮滅，規(guī)格是每支10mL，由江西某動物藥生產(chǎn)。

2 試驗方法

2.1 血樣采集

無菌采集羊血并加入檸檬酸鈉抗凝劑。涂片鏡檢，紅細(xì)胞感染率為10%左右，符合本次實驗要求。

2.2 羊附紅細(xì)胞體解離

將800mL的羊血平均分成4份，每份200mL。并分別標(biāo)號為A、B、C、D。每份具體使用的解離方法如表1所示。

表1 羊附紅細(xì)胞體解離方法

A組使用的是水溶法。具體的實驗方法是將血液樣本經(jīng)過2000r/min的速度進行離心，10min以后去除了樣本當(dāng)中的血漿和白細(xì)胞等其他干擾物質(zhì)。然后將剩余的紅細(xì)胞用生理鹽水洗3次。加入pH 2 PBS后上搖床振搖1h。而后立即用大約56℃的水對處理后的樣本進行水浴2min。再離心10min后取上清液。

B、C、D組用的都是藥物體外驅(qū)蟲法。離心、生理鹽水洗滌步驟同上。然后將處理后的樣本加入足量的生理鹽水至200mL，再加入準(zhǔn)備好的雙向紅蓮滅0.5mL，置4℃放置36h。這三組的步驟基本一致，差別在于雙向紅蓮滅的劑量，C組使用的是1mL，D組使用的是2mL。

2.3 指標(biāo)觀察

主要是觀察分離前后附紅細(xì)胞體感染率（%）、紅細(xì)胞感染強度（個）、附紅細(xì)胞體數(shù)（1×104／mm3）、雜質(zhì)含量和附紅細(xì)胞體的運動性，一共是5項指標(biāo)。

2.4 提取附紅細(xì)胞體抗原

將藥物體外驅(qū)蟲法解離后的血液進行離心10min后取上清液。將水浴法和藥物體外驅(qū)蟲法所得的上清液離心40min，沉淀物就是附紅細(xì)胞體抗原，加入生理鹽水2mL。

2.5 制備羊附紅細(xì)胞體抗原全蛋白懸液

將取得的羊附紅細(xì)胞體抗原用超聲波裂解約10min，即得到羊附紅細(xì)胞體抗原全蛋白懸液。

2.6 羊附紅細(xì)胞體全蛋白的SDS-PAGE

將這兩中解離方法制備的全蛋白裂解液，按照SDS-PAGE的方式進行相關(guān)的處理，比較兩者的區(qū)別。（見圖1）

3 結(jié)果與分析

從表2可知，實驗結(jié)果顯示，使用體外驅(qū)蟲法的三組其解離效果要好過水溶法。使用體外驅(qū)蟲法的樣本其紅細(xì)胞的感染率和感染的強度都會降低，但是附紅細(xì)胞體的活性受到一定的影響。而且根據(jù)實驗3組的分析來看，雙向紅蓮滅的濃度越高其解離效果越好。

從表3結(jié)果可以解離液裂解后測定的抗原蛋白濃度與使用體外驅(qū)蟲法雙向紅蓮滅的劑量成正相關(guān)。

用SDS－PAGE試驗對利用水浴法與體外驅(qū)蟲法制備的全蛋白測定得知，兩者成分相同，都由4條帶組成。

表2 不同方法附紅細(xì)胞的解離效果

表3 抗原蛋白質(zhì)濃度測定結(jié)果

4 討論與分析

針對羊附紅細(xì)胞體的解離方法，國內(nèi)外動物學(xué)家都進行了一定的研究。水溶法是一種比較常用的方式，但有一定的缺陷，會影響到結(jié)果的準(zhǔn)確。本文采用體外驅(qū)蟲法對羊附紅細(xì)胞體解離的效果好于水溶法。所以筆者認(rèn)為，可以使用這種方法制備羊附紅細(xì)胞體的抗原。但在實驗的過程當(dāng)中，我們也發(fā)現(xiàn)了該法的缺陷，有少量的溶血現(xiàn)象出現(xiàn)，所以該法還有一定的改進空間。

圖1 羊附紅細(xì)胞體抗原蛋白的SDS-PAGE電泳

[1]楊峰.農(nóng)區(qū)散養(yǎng)戶羊布病免疫技術(shù)要點及注意事項[J].甘肅畜牧獸醫(yī).2017(10).

[2]彭海生,等.畜禽附紅細(xì)胞體生物學(xué)特性試驗研究[J].畜牧與獸醫(yī).2015(01).