鄧紅梅，陳奕君，林壯輝，鄭理文，孫澤峰，郭偉峰

（廣東石油化工學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，廣東茂名 525000）

藥理研究試驗(yàn)表明，芒果苷不僅具有化痰、止咳、平喘、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、免疫等功效，還對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有興奮和保護(hù)作用，并且能增強(qiáng)心肌收縮功能，保肝利膽[1-4]。芒果皮是芒果生產(chǎn)加工中的主要副產(chǎn)物之一，基本上沒(méi)有被很好地利用而是被大量廢棄，不僅污染環(huán)境而且造成資源浪費(fèi)。芒果皮中富含芒果苷，目前從芒果葉中提取芒果苷的研究較多[5-7]，而對(duì)于芒果皮中芒果苷的研究卻很少。試驗(yàn)利用索氏提取法從芒果皮和芒果葉中分離純化芒果苷，并利用紫外分光光度法對(duì)提取的芒果苷進(jìn)行定量分析。此外，根據(jù)芒果苷的含量利用D101，AB-8，NKA 9型這3種大孔樹(shù)脂對(duì)其純化效果進(jìn)行比較。最終利用薄層層析對(duì)純化的芒果苷進(jìn)行定性分析。為芒果皮和芒果葉的開(kāi)發(fā)利用提供有效途徑，同時(shí)也為芒果資源的綜合利用開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

金煌芒果，購(gòu)于當(dāng)?shù)爻?；芒果?shù)葉采摘自校園內(nèi)，洗凈烘干，剪碎備用。

試劑：芒果苷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、甲酸、甲醇、磷酸，均為分析純；D101型大孔樹(shù)脂、NKA 9型大孔樹(shù)脂，購(gòu)于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；AB-8型大孔樹(shù)脂，購(gòu)于上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司；硅膠GF 254板，購(gòu)于青島海洋化工廠分廠。

主要儀器：RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；UV-5100 B型紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；JJ 224 BC型分析天平，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠產(chǎn)品；WD-9413 A型凝膠成像儀，北京市六一儀器廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 芒果苷提取

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 g處理好的芒果皮和葉，分別置于索氏提取器中，按照料液比為1∶10加入70%乙醇加熱提取1.5 h，重復(fù)提取3次，過(guò)濾并合并濾液，濃縮濾液至100 mL。分別將2種濃縮液置于分液漏斗中，加入100 mL石油醚，振蕩、靜置萃取，倒出石油醚層，反復(fù)萃取直至石油醚層無(wú)色，棄石油醚層，最后將水層濃縮得到40 mL芒果苷濃縮液。分別精確量取芒果皮和葉濃縮液各1 mL，分別置于100 mL容量瓶，加入50%乙醇定容，搖勻。即得到2種芒果苷樣品溶液。

1.2.2 芒果苷含量的測(cè)定

（1） 芒果苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。參照文獻(xiàn)[8]略有改變，配制成12.06 μg/mL芒果苷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液，準(zhǔn)確取芒果苷標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液10.0 mL，用50%乙醇定容至100.0 mL，搖勻；分別準(zhǔn)確移取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0 mL，用 50%乙醇定容至10.0 mL， 即 獲 得 4.020， 8.040， 12.060， 16.080，

20.100 ，24.120，28.140，32.160，36.180 μg/mL 的芒果苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后以50%乙醇作為參照，于波長(zhǎng)258 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度對(duì)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸分析。

（2）檢驗(yàn)精密度。分別準(zhǔn)確吸取6份1 mL的芒果皮芒果苷樣品溶液，置于10 mL帶塞比色管中，加入50%乙醇至10 mL。于波長(zhǎng)258 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算出芒果苷含量。

（3） 檢驗(yàn)重復(fù)性。分別量取芒果皮和葉2種芒果苷樣品溶液，于波長(zhǎng)258 nm處測(cè)其吸光度，每份樣品測(cè)定5次，觀察各種樣品的測(cè)定結(jié)果是否一致。

（4） 檢驗(yàn)穩(wěn)定性。取芒果皮和葉2種芒果苷樣品溶液置于室溫下，每隔15 min取樣測(cè)定其吸光度，分別測(cè)9次，觀察溶液中芒果苷是否保持穩(wěn)定，從而確定其有效測(cè)定時(shí)間范圍。

1.2.3 不同大孔樹(shù)脂對(duì)芒果苷純化效果的研究

（1） 大孔樹(shù)脂的預(yù)處理。分別稱(chēng)取一定量的D101，AB-8，NKA 9型樹(shù)脂，用0.5 BV的乙醇浸泡24 h，用2 BV的乙醇以2 BV/h流速通過(guò)樹(shù)脂柱，并浸泡4～5 h，再用水以同樣流速洗凈，用乙醇洗至流出液加水不呈白色混濁為止，用2 BV的5%HCl溶液以4～6 BV/h的流速通過(guò)樹(shù)脂層，并浸泡樹(shù)脂2～4 h。而后用水以同樣流速洗至出水pH值為中性，用2 BV的2%NaOH溶液以4～6 BV/h的流速通過(guò)樹(shù)脂層，并浸泡樹(shù)脂2～4 h，而后用水以同樣流速洗至出水pH值呈中性。

（2） 不同大孔樹(shù)脂對(duì)芒果苷靜態(tài)吸附的測(cè)定。量取3種經(jīng)過(guò)預(yù)處理的大孔樹(shù)脂（D101，AB-8，NKA9型）各5 g，分別置于3個(gè)錐形瓶中，取150 mL芒果皮芒果苷提取液，平均加入各個(gè)錐形瓶中振蕩吸附24 h，充分吸附后，過(guò)濾，分別取3種樹(shù)脂的濾液1 mL，進(jìn)行吸光度的分析，測(cè)定濾液剩余芒果苷的含量（芒果葉芒果苷提取液做法一樣）。按下列公式計(jì)算各樹(shù)脂在室溫下的吸附量和吸附率。

式中：C0——吸附前溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；Ce——吸附后溶液質(zhì)量濃度，mg/mL。

式中：Q——吸附量，mg/g；

W——干樹(shù)脂質(zhì)量，g；

V——溶液體積，mL。

用70%的乙醇沖洗樹(shù)脂，至乙醇洗脫液無(wú)色為止，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮至50 mL。測(cè)定其中芒果苷的含量，根據(jù)下式計(jì)算各樹(shù)脂在室溫下的解析率。

式中：C0——吸附前溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；

C1——吸附后溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；

V1——上樣溶液的體積，mL；

C2——解析液質(zhì)量濃度，mg/mL；

V2——解析液體積，mL。

1.2.4 最佳樹(shù)脂對(duì)芒果苷動(dòng)態(tài)吸附的測(cè)定

（1） 吸附階段的考查。精確吸取5.0 mL芒果皮芒果苷濃縮液于500 mL容量瓶中，加50%乙醇定容、搖勻。

取由1.2.3項(xiàng)下篩選出的最適大孔樹(shù)脂30.0 mL，濕法裝柱。緩慢加入芒果苷提取液350.0 mL，以4 BV/h的流速通過(guò)樹(shù)脂柱，每10.0 mL收集1管，共收集30管，分別測(cè)定流出液中芒果苷的濃度，繪制吸附曲線，找出該大孔樹(shù)脂的泄漏點(diǎn)和飽和點(diǎn)。

（2） 解析階段的考查。用2～4 BV的蒸餾水流速上述樹(shù)脂，直至流出液無(wú)色為止；依次用10.0%，30.0%，50.0%，70.0%，90.0%乙醇溶液各4.0 mL對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行梯度洗脫，每10.0 mL收集1管，共收集20管。分別測(cè)定各管收集液的芒果苷濃度，繪制解析曲線，找出解析芒果苷的最適乙醇體積分?jǐn)?shù)。

1.2.5 純化后的芒果苷檢驗(yàn)

（1）芒果苷樣品溶液的制備。分別精密量取經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后的芒果皮和葉濃縮液各1.0 mL，分別置于具塞比色管中，加入50.0%乙醇10.0 mL，作為供試液。

另外，取芒果苷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，加50.0%乙醇制成0.10 mg/mL溶液，作為對(duì)照品溶液。

（2） 薄層層析法（TLC） 檢測(cè)。①畫(huà)線：用2B以上的鉛筆在距硅膠G板下端至少5 mm處畫(huà)一條線，即點(diǎn)樣線；在距硅膠G板上端5 mm處畫(huà)一條線，為前沿線。畫(huà)線時(shí)要輕而清晰，在點(diǎn)樣線上畫(huà)上豎線形成十字型，用以確定點(diǎn)樣位置，2個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)之間距離一致。②點(diǎn)樣：用毛細(xì)管分別吸取芒果苷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液、芒果皮和芒果葉樣品溶液，從左往右分別點(diǎn)在硅膠G板上的各個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)。③展開(kāi)：以乙酸乙酯-甲酸-甲醇-水（10∶1∶1∶1） 為展開(kāi)劑，將點(diǎn)好樣的硅膠板置于層析缸中展開(kāi)。當(dāng)展開(kāi)液展開(kāi)至接近前沿線時(shí)，取出、晾干。④顯色：噴以10.0%的硫酸乙醇溶液，晾干，在105℃下加熱烘干至顯現(xiàn)淡黃色斑點(diǎn)，置于365 nm紫外燈下檢視。

2 結(jié)果分析

2.1 芒果苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性考查結(jié)果

根據(jù)芒果苷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的測(cè)定方法，測(cè)定不同質(zhì)量濃度芒果苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液在波長(zhǎng)258 nm處的吸光度，以芒果苷的質(zhì)量濃度對(duì)吸光度繪制芒果苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到芒果苷標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程：Y=0.069 3X-0.036 3，R2=0.999。

芒果苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 芒果苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖1可以看出，芒果苷標(biāo)準(zhǔn)曲線在4.020～36.180 μg/mL范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

2.2 精密度檢驗(yàn)結(jié)果分析

芒果皮芒果苷含量精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 芒果皮芒果苷含量精密度試驗(yàn)結(jié)果

表1為在258nm波長(zhǎng)處測(cè)定芒果皮中芒果苷樣品精密度檢驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明，用紫外分光光度法測(cè)定的芒果皮中芒果苷含量變化不大。因此，用紫外分光光度法測(cè)定芒果苷含量不僅具有可行性，還具有簡(jiǎn)便性。

2.3 重復(fù)性檢驗(yàn)結(jié)果分析

芒果皮芒果苷含量重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 芒果皮芒果苷含量重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表2為芒果皮和芒果葉的芒果苷樣品在258 nm波長(zhǎng)處測(cè)定芒果苷含量的重復(fù)性檢驗(yàn)的結(jié)果，每份供試品測(cè)定5次（n=5)。從表2可知，芒果皮的RSD為0.89%，芒果葉的RSD為1.31%，二者的RSD均小于2.00%，一致性程度較高，表明了用紫外分光光度法測(cè)定芒果苷含量的方法準(zhǔn)確性和重復(fù)性比較好。

2.4 穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

芒果皮芒果苷含量精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 芒果皮芒果苷含量精密度試驗(yàn)結(jié)果

表3為芒果皮和葉2種芒果苷樣品在258 nm波長(zhǎng)處每隔15 min測(cè)定一次芒果苷含量的結(jié)果。從表3可知，2種芒果苷樣品溶液于室溫下存放2 h內(nèi)，同質(zhì)量濃度的芒果苷供試品的吸光度變化不明顯，2種芒果苷樣品溶液RSD均在小于2.00%，表明紫外分光光度法在2 h內(nèi)測(cè)定芒果苷的穩(wěn)定性較好。因此，該試驗(yàn)表明用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品中芒果苷含量是可行的。

2.5 不同型號(hào)大孔樹(shù)脂對(duì)芒果苷靜態(tài)吸附的結(jié)果

不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附與解析效果見(jiàn)表4。

表4 不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附與解析效果

表4為不同大孔樹(shù)脂采用靜態(tài)吸附法吸附芒果皮芒果苷，通過(guò)測(cè)定吸附殘留液和解析液中芒果苷含量來(lái)研究其靜態(tài)吸附和解析效果。由表4可知，D101型大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附和解析效果最佳，AB-8型大孔樹(shù)脂次之，NKA 9型相對(duì)來(lái)說(shuō)較弱。

芒果苷是一種四羥基吡酮的碳酮苷，屬雙苯吡酮類(lèi)黃酮類(lèi)化合物，不溶于非極性溶劑，略溶于甲醇、乙醇、水等。所以，芒果苷具有一定的弱極性和非極性，適合于D101型這類(lèi)非極性樹(shù)脂和AB-8型這類(lèi)弱極性樹(shù)脂。此外，芒果苷的分子量為422.33，而D101型大孔樹(shù)脂（孔徑為10 nm） 的孔徑比AB-8型（孔徑為13～14 nm） 和NKA 9型（孔徑為15.5～16.5 nm）都小，因此D101型大孔樹(shù)脂對(duì)芒果苷的吸附能力優(yōu)于AB-8型和NKA 9型大孔樹(shù)脂。

2.6 D101型大孔樹(shù)脂對(duì)芒果苷動(dòng)態(tài)吸附的測(cè)定

D101型大孔樹(shù)脂對(duì)芒果苷的動(dòng)態(tài)吸附曲線見(jiàn)圖2，D101型大孔樹(shù)脂對(duì)芒果苷的動(dòng)態(tài)解析曲線見(jiàn)圖3。

圖2 D101型大孔樹(shù)脂對(duì)芒果苷的動(dòng)態(tài)吸附曲線

圖3 D101大孔樹(shù)脂對(duì)芒果苷的動(dòng)態(tài)解析曲線

由圖2可知，從第9份流出液開(kāi)始，芒果苷出現(xiàn)了較大的泄漏，隨著流出液份數(shù)增大，芒果苷含量也逐漸增多，從第25份流出液開(kāi)始芒果苷動(dòng)態(tài)吸附趨于飽和。

由圖3可知，10%乙醇洗脫效果最差，用70%乙醇解析液中芒果苷含量最高。說(shuō)明70%乙醇是最適洗脫濃度。

大孔樹(shù)脂的吸附作用主要是化合物分子與樹(shù)脂之間產(chǎn)生的范德華力或氫鍵而達(dá)到的。因此，可以根據(jù)有機(jī)化合物吸附力及其分子量大小使用一定濃度的溶劑進(jìn)行洗脫，從而達(dá)到分離、純化、除雜、濃縮等目的。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，一方面可以提高待分離有機(jī)物的溶解度和樹(shù)脂的溶脹；另一方面乙醇能誘導(dǎo)非極性溶劑分子產(chǎn)生一定的極性，根據(jù)相似相溶原理，從而使極性與非極性溶液互溶。但是，由于芒果苷微溶于乙醇，溶于熱稀乙醇，所以當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)90%時(shí)，芒果苷的溶解度反而減少，從而導(dǎo)致芒果苷洗脫效果不明顯。

不同體積分?jǐn)?shù)乙醇解析液中芒果苷含量比較見(jiàn)表5。

由表5可知，當(dāng)洗脫劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)低于30%或高于90%時(shí)，洗脫效果不明顯，當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)為70%，洗脫效果最佳。由表5可知，芒果皮、芒果葉純化后的芒果苷含量分別是上樣前的1.43倍和1.51倍。

表5 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇解析液中芒果苷含量比較

通過(guò)D101、AB-8和NKA 9型大孔樹(shù)脂對(duì)芒果苷純化效果的分析，發(fā)現(xiàn)D101型大孔樹(shù)脂對(duì)芒果苷的富集純化要優(yōu)于其他2種大孔樹(shù)脂。這與李學(xué)堅(jiān)等人的試驗(yàn)結(jié)果相符合?；衔锏臉O性大小會(huì)直接影響大孔樹(shù)脂的分離純化效果。一般來(lái)說(shuō)化合物極性較大的分子一般用中極性、極性的樹(shù)脂進(jìn)行分離純化，而極性小的分子一般使用非極性樹(shù)脂進(jìn)行分離純化。

2.7 芒果苷的薄層層析（TLC）鑒別結(jié)果

365 nm紫外光下芒果苷薄層色譜見(jiàn)圖4。

圖4 365 nm紫外光下芒果苷薄層色譜

由圖4可知，供試樣液與芒果苷標(biāo)準(zhǔn)品在色譜的相應(yīng)位置上，顯現(xiàn)出相同顏色的淺藍(lán)色熒光斑點(diǎn)。經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，薄層色譜的重現(xiàn)性良好。

苷類(lèi)的溶解性與苷元和糖的結(jié)構(gòu)均有關(guān)系。一般來(lái)說(shuō)，苷元具有弱親水性，而糖具有親水性。苷類(lèi)的極性、親水性往往與糖基有關(guān)，由于苷類(lèi)這類(lèi)物質(zhì)存在糖的多羥基結(jié)構(gòu)，而且苷元的活潑氫與糖的端基羥基結(jié)合，導(dǎo)致了苷元結(jié)構(gòu)影響變小。展開(kāi)劑使用極性較大的有機(jī)溶劑，如氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇和水。乙酸和甲酸的使用，不僅能增大展開(kāi)劑的極性，而且還能抑制硅膠羥基的作用，減少拖尾。如果提取物中含有色素或者大分子物質(zhì)時(shí)，展開(kāi)后顯色經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)拖尾或擴(kuò)散，導(dǎo)致顯色后的熒光點(diǎn)不集中，甚至出現(xiàn)交聯(lián)。

3 結(jié)論

（1）用紫外分光光度法測(cè)定芒果苷含量時(shí)基本不會(huì)受到芒果皮或象牙芒葉提取物溶液中其他物質(zhì)的干擾，測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性較高、穩(wěn)定性和重復(fù)性都較好，RSD均小于2.00%。同品種的芒果皮與芒果葉相比，芒果葉中的芒果苷含量多于芒果皮。

（2）D101型大孔樹(shù)脂對(duì)芒果苷的富集純化要優(yōu)于AB-8和NKA 9型大孔樹(shù)脂。70%乙醇的洗脫效果比較好，而且用70%乙醇洗脫解析液中芒果苷含量最高，分別是上柱前芒果皮、芒果葉樣液芒果苷含量的1.43倍，1.51倍，富集純化的效果明顯。

（3）純化后的芒果苷的薄層層析（TLC） 色譜帶與芒果苷標(biāo)準(zhǔn)品相一致，在365 nm紫外光下顯現(xiàn)出相同顏色的淺藍(lán)色熒光斑點(diǎn)。

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