武廣珩，傅仙玉，鄧家耀，劉金仙*

（1.福建省生態(tài)產(chǎn)業(yè)綠色技術(shù)重點實驗室，福建 武夷山 354300；2.武夷學(xué)院 生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建 武夷山 354300；3.武夷學(xué)院 茶與食品學(xué)院，福建 武夷山 354300）

白粉病是由白粉菌科（Erysiphacesae）真菌引起的植物病害。當(dāng)植物被侵染時，會產(chǎn)生大量由菌絲體、分生孢子梗和分生孢子構(gòu)成的肉眼可見的白色粉狀物，并由此而得名。白粉病在全世界分布廣泛，危害雙子葉植物，如葡萄、草莓、黃瓜等。同時它也侵染諸多的禾本科植物，如小麥、大麥、燕麥和多種牧草。其中小麥白粉病是由氣傳性?；纳婢际习追劬˙lumeria graminis）引起的真菌性病害，為世界各主要麥區(qū)的主要病害之一，且發(fā)病范圍日益擴大，危害程度不斷加重，可引起13.4%～34%的產(chǎn)量損失[1]。白粉菌是高等植物的專性活體寄生菌，通常生長在植物的表面，菌絲體表生或半內(nèi)生，以吸器進入寄主細(xì)胞吸取養(yǎng)分，從菌絲上長出直立的分生孢子梗，在梗端形成單生或成串的分生孢子。

擬南芥白粉病抗性相關(guān)基因EDR1基因編碼一個Raf樣MAPKKK蛋白激酶負(fù)調(diào)控水楊酸（Salicylic Acid，SA）誘導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)，edr1突變體表現(xiàn)出對白粉菌的抗性，以及病原菌誘導(dǎo)后比野生型積累更多的PR1轉(zhuǎn)錄本[2-3]。EDR1通過與MAPK級聯(lián)蛋白激酶MKK4和MKK5相互作用以及影響二者的蛋白表達水平來精確控制植物的免疫防衛(wèi)反應(yīng)[4]。KEG基因編碼一個包含環(huán)指結(jié)構(gòu)E3泛素連接酶結(jié)構(gòu)域和激酶域的蛋白，該基因的一個特異錯義突變能夠抑制edr1的相關(guān)表型[5]。KEG與EDR1相互作用并招募EDR1在反式高爾基體和早胞內(nèi)體（TGN/EE）上定位[6]。KEG調(diào)控內(nèi)膜系統(tǒng)蛋白的運輸，同時在白粉菌侵入的表皮細(xì)胞中發(fā)生特異性的降解[7]。EDR1還與另一個正調(diào)控植物免疫和細(xì)胞死亡的E3泛素連接酶ATL1在TGN/EE中相互作用；當(dāng)在擬南芥和煙草中過量表達ATL1導(dǎo)致植物出現(xiàn)細(xì)胞死亡的表型，并且這種細(xì)胞死亡能夠被EDR1抑制；而與此對應(yīng)的是，下調(diào)ATL1的表達能夠有效的抑制edr1介導(dǎo)的白粉病的抗病表型，以上這些暗示ATL1可能是EDR1潛在的底物[8]。近期研究發(fā)現(xiàn)，edr1的抑制子基因LLG1，編碼一個糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，與flg22識別受體FLS2互作，調(diào)控FLS2蛋白的積累及flg22誘導(dǎo)的FLS2降解，影響B(tài)IK1的磷酸化和活性氧的產(chǎn)生等，從而調(diào)控FLS2激活的免疫反應(yīng)[9]。

EDR1基因在在水稻和小麥的抗病中也表現(xiàn)出重要的作用。通過CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因定點編輯技術(shù)在普通小麥中創(chuàng)制的Taedr1基因編輯突變體同樣表現(xiàn)出對白粉菌的抗性，且無明顯的發(fā)育缺陷，驗證了EDR1基因在小麥育種的應(yīng)用前景[10]。水稻OsEDR1的T-DNA插入突變體和RNAi轉(zhuǎn)基因植株對水稻白葉枯病菌黃單胞桿菌表現(xiàn)出抗性，在黃單胞桿菌和水稻的互作中，OsEDR1的表達促進了乙烯的合成但抑制了水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）介導(dǎo)的抗性信號通路[11]。郭傳宇等研究還發(fā)現(xiàn)AtEDR1也參與擬南芥對稻瘟菌的非寄主抗性[12]。

為了進一步研究EDR1蛋白的抗白粉菌機制，明確EDR1蛋白是否具有跨物種的功能保守性，本研究選擇研究較為清楚的小麥EDR1蛋白作為對象，構(gòu)建了TaEDR1基因的過量表達載體并轉(zhuǎn)化了擬南芥edr1突變體，對轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗病表型進行了相關(guān)分析，為解析EDR1蛋白功能，以及為EDR1同源蛋白在其他經(jīng)濟作物中的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana）Columbia-0生態(tài)型 （Col-0）、pad4-1和edr1突變體，大腸桿菌DH5α，農(nóng)桿菌GV3101由本實驗室保存。植物表達載體pBI-1.4t，白粉菌菌株Golovinomyces cichoracearum UCSC1和小麥品種KN199由福建農(nóng)林大學(xué)唐定中教授饋贈。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥的種植

擬南芥種子經(jīng)表面消毒和4℃春化處理三天，然后平鋪于在含有1%蔗糖的1/2 MS固體培養(yǎng)基上，種子萌發(fā)7 d后移植。對于觀察表型的植物和用于瞬時表達的煙草，需放置在9h光照、光照強度7 000～8 000 lx、相對濕度50%～60%和溫度21～24℃的溫室；對于收集種子的植物，我們將其放置在16 h光照、光照強度10 000～12 000 lx、相對濕度50%～60%和溫度21～24℃的溫室。

1.2.2 載體構(gòu)建

為了獲得35S-TaEDR1-pBI1.4t載體，我們使用Promega RNA提取與反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得小麥KN199幼苗（出芽5 d）的cDNA。以cDNA為模板，設(shè)計特異引物 OE-F（CGCTCGAGATGAAGATCCCGTTTGTGACCAAGT，劃線部分為Xho I酶切位點）和OE-R（CCGTCGACATGTGCGGTTCACCGATATAAAGAT， 劃線部分為Sal I酶切位點）使用KOD plus（東洋紡）將TaEDR1完整CDS序列擴增出來。擴增程序：96℃預(yù)變性 5 min，95℃變性 10 s，68℃延伸3 min，68℃補充延伸5 min，30個循環(huán)。利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 （中科瑞泰）回收目的片段，插入克隆載體pEASY-Blunt Simple中（北京全式金生物公司），將測序驗證后的序列通過Xho I和Sal I（大連寶生物公司）酶切后連入由CaMV35S驅(qū)動的植物表達載體pBI1.4t中，進行菌落PCR及雙酶切檢測，將驗證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，進行菌落PCR鑒定陽性克隆。PCR引物合成及產(chǎn)物測序由上海生工生物公司完成。

1.2.3 遺傳轉(zhuǎn)化與純合體篩選

將上述含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌活化后，繼代培養(yǎng)至OD600=2.0，常溫3 200 g離心收集菌體，用等體積含0.03%SilwetL-77的5%蔗糖溶液重懸，使用2 mL吸管將重懸的菌液滴在擬南芥突變體edr1花上。暗培養(yǎng)24 h后放置于生長室，在長光照條件培養(yǎng)至種子成熟，得到T0代種子。將T0代種子在相應(yīng)抗性（卡那霉素，50 μg/mL）的不加蔗糖的MS平板上篩選，5～8 d后挑選轉(zhuǎn)化子，移苗到土中繼續(xù)培養(yǎng)。T1代轉(zhuǎn)化子用pBI1.4t載體篩選標(biāo)記基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ（Neomycin phosphotransferaseⅡ，NPTⅡ） 基因片段進行擴增，設(shè)計引物 NPTⅡ-F：5′-GGCTATTCGGCTATGACTGGGC-3′和 NPT Ⅱ -R：5′-GGCGATACCGTAAAGCACGAGG-3′PCR 驗證，長度 660 bp。 篩選得到的轉(zhuǎn)基因陽性植株，進一步培養(yǎng)收獲轉(zhuǎn)基因種子。提取篩選到的陽性植株T3代的葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄生成 cDNA，利用實時定量 PCR儀 （Eppendorf Realplex2）進行擴增（SYBR Premix Ex Taq Kit，反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性90 s，95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)）。以擬南芥ACT2基因為內(nèi)參，分別設(shè)計TaEDR1基因定量引物Q-TaEDR1-F：5′-GCTCATTGGCATTCAAGGGA-3′和 Q-TaEDR1-R：5′-GCATTGTCAGTGGCATTTCT-3′，內(nèi)參 ACT2 的引物 Q-ACT2-F：5′-AGTGTCTGGATCGGTGGTTC-3′和Q-ACT2-R：5′-CCCCAGCTTTTTAAGCCTTT-3′。 病程相關(guān)基因 PR1 引物：Q-PR1-F：5′-GTGGGTTAGCGAGAAGGCTA-3′和 Q-PR1-R：5′-ACTTTGGCACATCCGAGTCT-3′。

1.2.4 表型分析

Typan Blue染色：由于Typan Blue可以染色白粉菌的菌絲和分生孢子以及死亡的植物細(xì)胞。4周大小的擬南芥植物葉片接種保存于易感性突變體pad4-1上的白粉菌菌株Golovinomyces cichoracearum UCSC1；接種6 d后，采收葉片，將其置于Trypan Blue染液 （20 mL乙醇，10 mL苯酚，10 mL超純水，10 mL 83%乳酸和10 mg臺盼藍粉末）中煮沸2～5 min；染色后的葉片用水合三氯乙醛（2.5 g/ml）過夜脫色；用超純水洗滌三次后用50%甘油保存。依據(jù)Wang等[13]采用的方法，顯微鏡下計數(shù)每個獨立孢子形成的分生孢子梗的數(shù)目，隨后統(tǒng)計分析。對于基因型個體的表型記錄，則取接種8 d后的葉片進行Typan Blue染色，使用光學(xué)顯微鏡（Leica DM2500）進行觀察和拍照。

DAB染色：DAB可以染色白粉菌的侵染植物細(xì)胞時產(chǎn)生的過氧化氫（H2O2）。按一下步驟進行：收集接種白粉菌48 h的葉片，將其置于DAB（1 mg/mL，pH=5.8）染液中染色12 h，隨后用無水乙醇脫色；用超純水洗滌三次后用50%甘油保存；使用光學(xué)顯微鏡（Leica DM2500）進行觀察和拍照。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

通過GenBank數(shù)據(jù)庫進行序列檢索，利用Clustal omega軟件進行序列比對，用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用Excel 2007對分生孢子梗計數(shù)數(shù)據(jù)進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 EDR1同源蛋白保守性

為了分析EDR1蛋白在植物中的保守性，我們對NCBI數(shù)據(jù)庫中EDR1近緣蛋白進行提取，利用Clustal Omega 軟件進行比對分析（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）并通過MEGA7.0軟件構(gòu)建蛋白序列進化樹。發(fā)現(xiàn)EDR1同源蛋白存在于單子葉和雙子葉植物中，并呈現(xiàn)較高的保守性（圖1A）。其中，不同物種中EDR1蛋白的激酶結(jié)構(gòu)域的一致性高達89.3%（圖1B）。

圖1 EDR1同源蛋白序列分析Figure 1 Sequence analysis of EDR1 homologous proteins

2.2 TaEDR1基因表達載體構(gòu)建

為了在擬南芥中異源表達小麥的TaEDR1基因，播種小麥KN199種子，生長5 d后，收集新鮮葉片提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。利用特異性引物OE-F和OE-R擴增長度獲得了2896bp的TaEDR1 CDS編碼區(qū) （圖2A）。將 CDS序列連接到 pEASY-Blunt Simple克隆載體中，測序正確后用Xho I和Sal I雙酶切連接到pBI1.4t表達載體。將構(gòu)建好的重組表達載體35S-TaEDR1-pBI1.4t轉(zhuǎn)化大腸桿菌并進行菌落PCR驗證，提取驗證正確的菌落質(zhì)粒用Xho I和Sal I雙酶切鑒定，能夠切出目的片段，表明載體構(gòu)建成功（圖2B）。

圖2 TaEDR1 CDS表達載體的構(gòu)建Figure 2 TaEDR1 CDS expression vector constructed

2.3 異源表達TaEDR1抑制突變體edr1表型

通過農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)的浸花法將重組植物表達載體35S-TaEDR1-pBI1.4t轉(zhuǎn)入擬南芥突變體edr1，獲得16個具有T1代轉(zhuǎn)化子，PCR擴增轉(zhuǎn)化子中的NPTII基因（660 bp），發(fā)現(xiàn)12個陽性轉(zhuǎn)基因植株（圖3A）。此后，4周大小的12個T1代的轉(zhuǎn)基因植株、野生型和edr1接種白粉菌，8 d后發(fā)現(xiàn)T1代的轉(zhuǎn)基因植株、野生型各自的葉片上都有大量白粉菌菌絲和分生孢子梗的生長，而edr1突變體僅有少量的菌絲和分生孢子梗，并出現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡。說明擬南芥中異源表達TaEDR1基因能夠抑制突變體edr1的抗病表型（圖3B）。

圖3 異源表達TaEDR1抑制擬南芥edr1突變體白粉菌抗病表型Figure 3 Heterologous expression of TaEDR1 complementary edr1 mutant resistance phenotype

2.4 異源表達TaEDR1抑制突變體edr1中PR基因的表達和過氧化氫的積累

為了進一步了解TaEDR1在擬南芥抗病反應(yīng)中的功能，我們將35S-TaEDR1-pBI1.4t遺傳轉(zhuǎn)化植株收種和分離鑒定，獲得T3代的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因株系。提取這些株系的RNA并合成cDNA，利用實時熒光定量PCR檢測TaEDR1在轉(zhuǎn)基因株系中的表達水平，選取表達量最高的OE-5進行后續(xù)實驗（圖4A）。

為了明確TaEDR1在擬南芥中抑制edr1表型的能力，4周大小的野生型、edr1和轉(zhuǎn)基因植株OE5接種白粉菌。通過白粉菌在葉片表面的生長觀察和白粉菌單個孢子上分生孢子梗生長的定量計數(shù)發(fā)現(xiàn)OE5和野生型無明顯差異，都明顯多于edr1突變體上生長的分生孢子梗數(shù)，即表現(xiàn)出更加抗病的表型（圖4B、4C和4E）。此外，對4周大小的野生型、edr1和OE5進行白粉菌接種，在48 h后取新鮮葉片進行DAB染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體edr1在白粉菌接種48 h后，白粉菌孢子入侵點處出現(xiàn)大量過氧化氫積累，而Col-0和OE-5植物僅出現(xiàn)少量積累（圖4D）。

為了了解突變體中病程相關(guān)基因表達是否發(fā)生變化，對4周大小的野生型Col-0、edr1和OE5接種白粉菌，在接種后0、2、4 d收集葉片提取RNA、轉(zhuǎn)錄和對抗病相關(guān)基因AtPR1進行實時定量PCR分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接菌前后Col-0和OE-5中AtPR1基因的表達都沒有明顯的差異；突變體edr1中AtPR1的表達接菌后2 d，較Col-0和OE-5已經(jīng)出現(xiàn)明顯的上調(diào)，在接菌后4 d，上調(diào)幅度已經(jīng)遠(yuǎn)大于Col-0和OE-5（圖4F）。

圖4 TaEDR1抑制擬南芥edr1突變體中白粉菌誘導(dǎo)的AtPR1基因的大量表達和H2O2的積累Figure 4 TaEDR1 inhibits the expression of AtPR1 gene and accumulation of H2O2in edr1 mutant

A：在12個T3轉(zhuǎn)基因植株中定量分析TaEDR1表達量，以AtACT2作為參照；B：4周大小的野生型、edr1和轉(zhuǎn)基因植株OE5，接種白粉菌后8 d的表型；C：Trypan Blue染色（B）中的葉片；D：對4周大小的野生型、edr1和轉(zhuǎn)基因植株OE5進行白粉菌接種，48 h后取新鮮葉片進行過DAB染色，褐色顯示過氧化氫的積累；E：定量分析野生型、edr1和轉(zhuǎn)基因植株OE5葉表面單克隆白粉菌形成分生孢子梗的數(shù)目。數(shù)據(jù)經(jīng)t檢驗統(tǒng)計分析，不同字母代表差異顯著。該實驗重復(fù)3次，得到類似的結(jié)果（P＜0.01）；F：4 周大小的野生型、edr1 和轉(zhuǎn)基因植株 OE5 接種白粉菌，實時定量PCR檢測接種白粉菌后0、2、4 d的AtPR1的表達情況

3 討論與結(jié)論

植物在生長發(fā)育的過程中可能會遭遇各種生物脅迫。以模式植物擬南芥為研究對象，人們通過鑒定和克隆對各種病原菌增強或減弱抗性的突變體，找到了很多基因參與了植物對病原微生物的防衛(wèi)反應(yīng)。EDR1基因作為一個抗病基因，多項研究發(fā)現(xiàn)其調(diào)控了植物（擬南芥、水稻和小麥）對真菌和細(xì)菌的抗性[2,10,11]。序列比對發(fā)現(xiàn)來自于不同單雙子葉植物的EDR1蛋白表現(xiàn)出很高的保守性，其抗性功能都表現(xiàn)出大量的過氧化氫和胼胝質(zhì)的積累，以及病程相關(guān)基因PR1表達的大幅度上調(diào)[4,10,12]。由此我們認(rèn)為EDR1是一個具有廣譜抗性的保守蛋白，在不同物種中發(fā)揮著類似的功能的基因。由此推測，不同來源的EDR1蛋白很可能能夠在不同物種中發(fā)揮同樣的功能。我們的結(jié)果證明了小麥的EDR1基因?qū)霐M南芥中，小麥EDR1蛋白可以在擬南芥中發(fā)揮功能，并且激發(fā)與AtEDR1類似的信號通路。EDR1蛋白在單雙子葉植物中大量存在、功能高度保守，為我們今后在其它經(jīng)濟作物中利用EDR1同源基因提高不同植物抗病性，乃至在分子設(shè)計育種中的利用，提供了堅實的理論依據(jù)。

此外，復(fù)雜農(nóng)作物物種的植物病理學(xué)研究由于缺乏相應(yīng)的研究體系，發(fā)展較為緩慢。利用模式植物擬南芥和相應(yīng)的突變體，與不同病原菌（假單胞桿菌、卵菌和白粉菌等）的植物病理研究系統(tǒng)的建立，將有利于復(fù)雜經(jīng)濟作物的抗病研究。