唐躍輝，包欣欣，劉 坤，張慧聰，王 雙，趙君葦，婁慧敏，王 箐，梁 靜，喬 蓉，李成偉

(1.周口師范學(xué)院 植物遺傳與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 周口 466000；2.河南省作物分子育種與生物反應(yīng)器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 周口 466000)

蛋白質(zhì)的合成是細(xì)胞將遺傳信息由核酸水平傳遞到蛋白質(zhì)水平的重要步驟，在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定中起重要的作用。蛋白質(zhì)的合成分為起始、延伸和終止3個(gè)過(guò)程，然而，真核生物蛋白質(zhì)的終止需要2類肽鏈釋放因子eRF1(第1類肽鏈釋放因子)和eRF3(第2類肽鏈釋放因子)的參與[1-5]，eRF1在核糖體的A位點(diǎn)專一識(shí)別終止密碼子UAA、UAG、UGA，在P位點(diǎn)催化新生肽鏈與tRNA之間酯鍵水解，促使新生肽鏈的釋放，進(jìn)而引起翻譯過(guò)程終止[1]。eRF3是鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白，具有GTPase活性，與eRF1相互作用形成復(fù)合體，協(xié)助eRF1完成核糖體循環(huán)和新生肽鏈從核糖體的釋放[6]。

eRF1蛋白由N、M、C這3個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域組成，其中，N結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)保守的NIKS、GTS、YxCxxxF模塊基序(motif)，該結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)識(shí)別終止密碼子[7-9]；M結(jié)構(gòu)域包含1個(gè)高度保守的GGQ基序，負(fù)責(zé)肽酰tRNA酯鍵的水解[8]；C結(jié)構(gòu)域是eRF1和eRF3相互作用的區(qū)域，其中第410-415位置的氨基酸(GGXLRY基序)在eRF1和eRF3相互作用中起重要的作用，第416-437位的氨基酸富含酸性氨基酸，也是eRF1和eRF3相互作用所必需的[8-11]。

eRF1在不同物種中都具有很高的保守性，在多個(gè)物種中都有所研究，但植物中研究較少，僅在擬南芥方面有些報(bào)道。此外，eRF1除了終止翻譯的功能外還發(fā)現(xiàn)了其他功能，例如，抑制酵母eRF1影響酵母有絲分裂[12-13]；共抑制擬南芥eRF1-1影響細(xì)胞伸長(zhǎng)與徑向細(xì)胞的分離，導(dǎo)致韌皮部異位木質(zhì)化[14]，擬南芥中過(guò)表達(dá)eRF1-2表現(xiàn)出對(duì)葡萄糖超敏感，并且發(fā)現(xiàn)，eRF1-2在GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中可能起負(fù)調(diào)控的作用[15]。在水稻中關(guān)于eRF1基因功能還沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道。為此，本研究克隆了1個(gè)水稻eRF1基因，命名為OseRF1-3，首先對(duì)OseRF1-3進(jìn)行了組織特異性表達(dá)和生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建了OseRF1-3基因啟動(dòng)子融合GUS植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化到水稻愈傷組織，通過(guò)GUS組織化學(xué)染色進(jìn)一步分析了OseRF1-3基因的表達(dá)模式，旨在為進(jìn)一步研究OseRF1-3基因在水稻生長(zhǎng)與發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所需的水稻材料為粳稻中花11(ZH11)，種植于周口師范學(xué)院試驗(yàn)田，取生長(zhǎng)28 d的水稻幼苗根、莖、幼葉及分蘗芽，5～9 cm的水稻穗和授粉后10 d的種子用于組織特異性表達(dá)分析，錫箔紙包裹并立即放液氮速凍，然后放于-80 ℃保存待用。

本試驗(yàn)所用的pMD18-T載體，LATAG酶，Hind Ⅲ和BamH Ⅰ，T4DNA連接酶均購(gòu)買(mǎi)于大連寶生物有限公司，pCAMBIA1391Z載體為河南省作物分子育種與生物反應(yīng)器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 水稻DNA和RNA提取

水稻DNA的提取采用上海捷銳生物工程有限公司新型快速植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取方法，具體的操作參考試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。待水稻生長(zhǎng)到14 d后，取地上部分葉片液氮速凍，根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行水稻DNA提取。

水稻各組織RNA提取使用Magen公司植物小量RNA提取方法，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，取2 μg提取RNA作為模板，參照Magen公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行第1鏈cDNA合成。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育和氨基酸序列分析

擬南芥AteRF1蛋白序列來(lái)自于TAIR擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，水稻和別的物種的eRF1蛋白序列從GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載，通過(guò)ClustalW軟件進(jìn)行eRF1蛋白質(zhì)全長(zhǎng)序列比對(duì)，通過(guò)Mega software version 5軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建(NJ法，Bootstraps：1 000)。

1.4 基因表達(dá)量分析

以F：5′-ACTACGGTAAAGCACCTCAACAA-3′；R：5′-ATAGCGGAGAATCCCCCCT-3′為定量PCR引物，采用定量PCR儀(LightCycler 480)對(duì)OseRF1-3基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，條件如下：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s,60 ℃，20 s,72 ℃，20 s,40 個(gè)循環(huán)。選用水稻的Ubiquitin1 (Os06g0681400)F：5′-TTCCATGCTGCTC

TACCACAG-3′；R:5′-AGGGTTCACAAGTCTGCCTA

TT-3′作為定量 PCR 內(nèi)參引物。設(shè)3次重復(fù)。

1.5 基因及啟動(dòng)子克隆

按以下引物F：5′-ATGGCTGACAGCCATGAAA

C-3′; R：5′-GCCAGCACAGGCTCCTCC-3′進(jìn)行OseRF1-3基因開(kāi)放閱讀框克隆，條件如下：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，54 ℃，30 s，72 ℃，90 s，32 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min；16 ℃保存。按以下引物F：5′-ATCGAATTCCA

AACCCGTTAGCCAAACACT-3′; R：5′-AAAGGATCCTG

TCGTGCTCGCAGAGGTGT-3′進(jìn)行OseRF1-3基因啟動(dòng)子克隆，條件如下：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，54 ℃，30 s，72 ℃，2 min，31個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min；16 ℃保存。將克隆的片段連接到pMD18-T載體并送南京金斯瑞生物公司測(cè)序。

1.6 啟動(dòng)子生物信息學(xué)分析

使用tssp和plantCARE軟件對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.7 水稻穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因株系的獲得

以粳稻中花11的愈傷組織作為受體，參考Tang等[16]水稻轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行水稻的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化。通過(guò)潮霉素對(duì)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行初次篩選，然后通過(guò)GUS染色對(duì)初次篩選的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。

1.8 GUS組織化學(xué)染色分析

取生長(zhǎng)30 d的水稻幼苗根、葉、葉夾角、根莖接觸處以及60 d的莖，授粉后8 d的水稻種子、穎殼和授粉前的花進(jìn)行GUS染色，首先將這些組織放入GUS染液中，然后放入37 ℃，2 h后取出，取出后倒掉GUS染液，并向EP管里加入1 mL 75%的酒精，放入70 ℃溫箱脫色，脫色后拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 OseRF1-3基因系統(tǒng)發(fā)育和氨基酸序列分析

水稻基因組中存在4個(gè)eRF1基因，分別命名為OseRF1-1、OseRF1-2、OseRF1-3、OseRF1-4，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，OseRF1-1和OseRF1-3在禾本科中形成獨(dú)立的分支(圖 1-A)，說(shuō)明OseRF1-1和OseRF1-3在植物進(jìn)化過(guò)程中有可能分化出了新的功能，因此，OseRF1-3被用來(lái)做進(jìn)一步的功能分析。

設(shè)計(jì)特異引物，以水稻穗和種子混合cDNA為模板，通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆出了OseRF1-3的CDS序列，然后進(jìn)一步將該序列在NCBI進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，該序列與NP_001045349 (OseRF1-3)在Genbank登錄序列完全一致。對(duì)OseRF1-3的序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因位于水稻1號(hào)染色體，mRNA全長(zhǎng)2 059 bp，CDS序列長(zhǎng)1 308 bp，編碼436個(gè)氨基酸，包含N、M、C這3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，屬于eRF1家族。氨基酸序列比對(duì)分析表明，OseRF1-3蛋白與擬南芥AteRF1和水稻OseRF1家族別的成員相似性為90.6%，且OseRF1-3包含N結(jié)構(gòu)域中保守的NIKS、GTS、YxCxxxF基序以及M結(jié)構(gòu)域中GGQ基序和C結(jié)構(gòu)域中GGXLRY基序(圖1-B)。進(jìn)一步表明，eRF1基因在單子葉植物和雙子葉植物中高度保守。

A.OseRF1-3同源性蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分枝；Cr.萊茵衣藻；Vv.葡萄；Rc.蓖麻；Pt.毛果楊；Mt.苜蓿；Gm.大豆；Ps.北美云杉；At.擬南芥；St.馬鈴薯；Bo.花椰菜；Sb.高粱；Zm.玉米；Os.水稻；Ta.小麥；Hv.大麥；B.OseRF1-3蛋白NIKS、GTS、YxCxxxF、GGQ和GGXLRY基序通過(guò)下劃線顯示。

A. Phylogenetic tree analysis of OseRF1-3 and homologous proteins from other species：Cr.Chlamydomonasreinhardtii；Vv.Vitisvinifera；Rc.Ricinuscommunis；Pt.Populustrichocarpa；Mt.Medicagotruncatula；Gm.Glycinemax；Ps.Piceasitchensis；At.Arabidopsisthaliana；St.Solanumtuberosum；Bo.Brassicaoleraceavar.botrytis；Sb.Sorghumbicolor；Zm.Zeamays；Os.OryzasativaJaponica；Ta.Triticumaestivum；Hv.Hordeumvulgare；B. The conserved NIKS，GTS，YxCxxxF，GGQ and GGXLRY motifs of OseRF1-3 protein are indicated as the underlined segment.

圖1OseRF1-3與其他物種同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和多重序列比對(duì)分析
Fig.1PhylogenetictreeandmultiplesequencealignmentanalysisofOseRF1-3andhomologousproteinsfromotherspecies

2.2 水稻OseRF1-3組織特異性表達(dá)分析

通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了OseRF1-3基因在水稻不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式，結(jié)果表明，OseRF1-3是組成型表達(dá)，在根中表達(dá)最低，在水稻穗中表達(dá)最高(圖2)。

試驗(yàn)設(shè) 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè) 2 個(gè)技術(shù)性重復(fù)。字母b和c表示相對(duì)于根差異顯著(P<0.05)。

The experiment included three biological replicates, each with two technical replicates. Letters b and c indicate significant differences from the corresponding root(P<0.05).

圖2OseRF1-3表達(dá)模式分析
Fig.2ExpressionlevelsofOseRF1-3

2.3 OseRF1-3基因啟動(dòng)子克隆

根據(jù)OseRF1-3基因組序列設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出OseRF1-3基因啟動(dòng)子序列，然后送公司測(cè)序，結(jié)果表明，該序列長(zhǎng)2 120 bp(圖 3)。將該序列與擴(kuò)增出來(lái)的OseRF1-3基因CDS序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，該序列與OseRF1-3基因CDS序列A開(kāi)始連續(xù)49 bp堿基重合，說(shuō)明該序列為OseRF1-3基因啟動(dòng)子序列。去掉與CDS重合序列，擴(kuò)增出來(lái)的OseRF1-3基因啟動(dòng)子序列全長(zhǎng)2 071 bp。

1～3.啟動(dòng)子序列擴(kuò)增產(chǎn)物；M.Marker。

2.4 OseRF1-3啟動(dòng)子生物信息學(xué)分析

利用在線軟件tssp和plantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)水稻OseRF1-3啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，OseRF1-3基因啟動(dòng)子區(qū)共包含12個(gè)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄元件CAAT-box，11個(gè)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)TATA-box，這些元件在啟動(dòng)子發(fā)揮作用中起重要的調(diào)控作用，預(yù)測(cè)的-796位置的A可能為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(圖4)。此外，OseRF1-3基因啟動(dòng)子還包含1個(gè)光應(yīng)答元件TTTCAAA；3個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件WRKY71OS和3個(gè)細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)相關(guān)元件NGATT(圖4)。

圖4 OseRF1-3基因啟動(dòng)子序列分析Fig.4 Sequence analysis of OseRF1-3 gene promoter

2.5 構(gòu)建OseRF1-3啟動(dòng)子植物表達(dá)載體

將測(cè)序正確的OseRF1-3啟動(dòng)子序列通過(guò)T4DNA連接酶連接到植物表達(dá)載體pCAMBIA1391Z上Hind Ⅲ和BamH Ⅰ位點(diǎn)之間，獲得POseRF1-3∷GUS載體，并送公司進(jìn)行再次測(cè)序，進(jìn)一步通過(guò)Hind Ⅲ和BamH Ⅰ對(duì)構(gòu)建完成的POseRF1-3∷GUS載體進(jìn)行酶切驗(yàn)證(圖 5-A)，測(cè)序和酶切結(jié)果表明，該載體為OseRF1-3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS植物表達(dá)載體(圖 5-B)。

A .OseRF1-3啟動(dòng)子植物表達(dá)載體酶切結(jié)果；B.OseRF1-3啟動(dòng)子植物表達(dá)載體圖譜。NOS.胭脂氨酸合成酶基因終止轉(zhuǎn)錄區(qū)；Hph.潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；GUS.β-葡萄糖醛酸報(bào)告基因；MCS.多克隆微點(diǎn)。A.The enzyme result of plant expression vector from OseRF1-3 promoter;B.Plant expression vector spectrum of OseRF1-3 promoter.NOS. Nopaline synthase transcription termination region;Hph.Hygromycin phosphotransferase gene;GUS.β-glucuronidase reporter gene; MCS. Multiple clone site.

2.6 POseRF1-3∷GUS轉(zhuǎn)基因株系獲得和組織GUS染色

以水稻愈傷組織為受體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將構(gòu)建好的OseRF1-3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織，通過(guò)潮霉素抗性篩選和PCR技術(shù)鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系，通過(guò)T2分離比，挑選單拷貝插入轉(zhuǎn)基因株系(分離比為3∶1)進(jìn)行進(jìn)一步分析。取T3轉(zhuǎn)基因水稻不同組織部位進(jìn)行GUS染色，37 ℃，2 h后觀察GUS染色結(jié)果，進(jìn)而確定OseRF1-3基因啟動(dòng)子的表達(dá)特性。GUS染色結(jié)果表明，OseRF1-3基因是組成型表達(dá)，在根中表達(dá)較弱，然而，在水稻花、穗中有高水平的表達(dá)(圖 6)。GUS檢測(cè)OseRF1-3基因啟動(dòng)子的表達(dá)特性的結(jié)果與qRT-PCR得出的結(jié)果相一致。

從上到下、從左到右依次為：根、莖、葉、葉夾角、莖結(jié)合部位、花、種子、根莖結(jié)合部和穗。From top to bottom and from Left to right in turn：root，stem，leaf，leaf angle，stem-stem junction，flower，seed，root-stem junction and spike.

3 結(jié)論與討論

基因的功能往往與該基因在植物組織中的表達(dá)模式密切相關(guān)。為了研究水稻肽鏈釋放因子OseRF1-3在水稻發(fā)育中的功能，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了該基因的組織表達(dá)模式，其在穗中有強(qiáng)的表達(dá)，在其他組織都有較強(qiáng)表達(dá)。此外，克隆了OseRF1-3基因起始密碼子ATG上游2 071 bp序列，并構(gòu)建了啟動(dòng)子融合GUS基因植物表達(dá)載體，該基因啟動(dòng)子融合GUS基因組織化學(xué)染色結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致，該結(jié)果表明，OseRF1-3為組成型表達(dá)。該結(jié)果與擬南芥AteRF1表達(dá)模式相似[8-9]，表明肽鏈釋放因子eRF1表達(dá)模式具有一定的保守性，推測(cè)該基因的功能也存在一定的保守性。

在過(guò)去的研究中，對(duì)作物抗逆、抗蟲(chóng)害等優(yōu)良品種的分子育種中，選用的是外源花椰菜花葉病毒CaMV35S組成型啟動(dòng)子。近幾年，一些植物內(nèi)源組成型啟動(dòng)子被相繼克隆和功能分析。Wu等[17]研究表明，滸苔(Olavprolifera)Actin1啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的強(qiáng)度高于CaMV 35S啟動(dòng)子。擬南芥AtTCTP啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因在所有的組織中都表達(dá)，能夠替代35S啟動(dòng)子作為驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)的組成型啟動(dòng)子[18]。Masura等[19]證明棕櫚油Type2啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子。Huang等[20]證明田旋花EPSPS啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子。在本研究中，OseRF1-3啟動(dòng)子融合GUS基因在轉(zhuǎn)基因水稻中為組成型表達(dá)。

在水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)品種的分子模塊設(shè)計(jì)育種中，往往采用的是花椰菜花葉病毒35S或玉米泛素基因啟動(dòng)子作為常用的植物表達(dá)載體激活靶基因表達(dá)的啟動(dòng)子，然而，選用水稻內(nèi)源組成型啟動(dòng)子仍然很少。因此，從植物中挖掘更多的組成型啟動(dòng)子對(duì)優(yōu)良基因在作物生產(chǎn)上的應(yīng)用和基礎(chǔ)研究具有重要的意義。在本研究中，GUS活性分析結(jié)果表明，水稻肽鏈釋放因子OseRF1-3基因的啟動(dòng)子具有明顯的組成型特性，因此，該啟動(dòng)子可以作為內(nèi)源啟動(dòng)子應(yīng)用于水稻植物過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建，進(jìn)而在水稻高產(chǎn)、抗逆、耐蟲(chóng)害等品種的培育中具有很好的應(yīng)用前景。

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