王曉丹，胡慶一，張振乾，王 悅，官春云

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

葉綠素是綠色植物進(jìn)行光合作用的必需物質(zhì)，其含量高低是反映綠色植物葉片光合作用能力的重要指標(biāo)[1]，且葉綠素含量與作物的氮含量、種植密度等也密切相關(guān)，已有許多相關(guān)報(bào)道[2-4]。

油菜是世界第二大油料作物，也是我國(guó)最大的自產(chǎn)油料作物[5]，通過(guò)降低飽和脂肪酸含量，增加不飽和脂肪酸含量進(jìn)而改變菜油脂肪酸組成是油菜育種的重要目標(biāo)之一，如“雙低油菜”和高油酸油菜等[6-7]，受到眾多育種家的關(guān)注。不飽和脂肪酸是構(gòu)成葉綠體膜骨架的主要成分，是光合作用所必需的[8]，其中亞油酸與亞麻酸是人體必需脂肪酸，有較好的營(yíng)養(yǎng)保健作用[9-10]。fad2編碼ω-6型不飽和脂肪酸去飽和酶，是控制油酸向亞油酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因，直接決定了種子中儲(chǔ)存多不飽和脂肪酸的含量與比例[11]；fad3編碼ω-3型不飽和脂肪酸去飽和酶，是亞麻酸合成的關(guān)鍵基因[12]。對(duì)這2個(gè)基因進(jìn)行分析，有助于從分子方面促進(jìn)油菜脂肪酸組成改良研究的發(fā)展。

本研究分析了不同肥密條件下，甘藍(lán)型油菜不同生育期的葉綠素含量及fad2、fad3基因表達(dá)情況，并探討了葉綠素含量與fad2、fad3基因表達(dá)量之間的關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)不同栽培方式對(duì)葉綠素含量及基因表達(dá)的影響，為通過(guò)栽培方式改良油菜品質(zhì)提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘藍(lán)型油菜420，國(guó)家油料改良中心湖南分中心提供。

1.2 試驗(yàn)處理

試驗(yàn)于2016年10月-2017年4月在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)瀏陽(yáng)基地進(jìn)行。分別設(shè)氮(N)、硼(B)及種植密度各3個(gè)梯度，具體表示方法如表1，以正常肥密條件(A2B2C2)為對(duì)照，隨機(jī)區(qū)組排列，共27個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積10 m2，3個(gè)重復(fù)。所有小區(qū)施有效磷肥90 kg/hm2，有效鉀肥165 kg/hm2做基肥，一次施入。其他農(nóng)事操作均按當(dāng)?shù)毓芾泶胧┎僮鳌?/p>

表1 不同字符表示的肥密條件Tab.1 Fat and density conditions represented by different characters

1.3 樣品制備

每個(gè)小區(qū)分別取幼苗期(2016年11月12日)、五-六葉期(2016年12月11日) 和蕾薹期( 2017年1月10 日) 嫩葉5片(每株1片)，盛花期(2017年2月18日) 各材料取5株自交套袋的花，授粉后 20～35 d種子及角果皮(2017年3月25日) 用以提取RNA。另取各時(shí)期倒數(shù)第3片葉5片(每株1片)，角果期取角果皮，用以葉綠素含量測(cè)定。以上材料各自混合，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 葉綠素含量測(cè)定 取上述葉綠素含量測(cè)定所需材料，通過(guò)研磨法提取葉綠素，并用721型分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)測(cè)定吸光度。

1.3.2 RNA 提取取 上述RNA 提取材料，按照TransGene Biotech 公司的TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA無(wú)明顯降解，Nanodrop 2000 微量紫外分光光度計(jì)(Thermo) 檢測(cè) RNA濃度與純度良好，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 定量PCR Premier 6.0設(shè)計(jì)fad2和fad3引物(表2),并用Oligo 7.0進(jìn)行檢測(cè)，由上海生工技術(shù)公司合成。用上述檢測(cè)合格的RNA按照TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以劉芳等[13]所設(shè)PCR 反應(yīng)程序?qū)σ镞M(jìn)行檢測(cè)，使用CFX96TM Real-Time System(BIORAD，USA)，按照TransScript Tip Green qPCR SuperMix試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用兩步法進(jìn)行qPCR反應(yīng)。內(nèi)參基因選用UBC9，基因表達(dá)情況采用Pfaffl[14]的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

基于PLC和HMI控制的旋擺沖擊磨操作系統(tǒng)的改進(jìn)設(shè)計(jì) 程行知，申小剛，潘小康，田文海，韓玉香2(84)

表2 定量PCR引物及內(nèi)參基因序列Tab.2 Sequences of primer and reference gene used for quantitative real-time PCR validation of gene expression

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

測(cè)得的數(shù)據(jù)以SPSS 20.0處理，并用 Excel 2010作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)期葉綠素含量變化

按1.3.1方法對(duì)油菜各個(gè)時(shí)期的葉綠素含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1。在A2B1C2、A3B1C2 與A2B1C3處理葉綠素含量整個(gè)生育期均高于對(duì)照；反之，在A1B3C1與A1B3C3的處理則遠(yuǎn)低于對(duì)照?？傮w而言，整個(gè)生育期葉綠素的變化規(guī)律是相同的，即在相同N及B用量條件下，隨著種植密度的增加，葉綠素含量逐漸降低，在相同種植密度及B用量條件下，隨著N素的增加，葉綠素含量先升高后降低；相同種植密度及N肥條件下，隨著B(niǎo)用量的增加，葉綠素含量亦先升高后降低；隨著生育期的推進(jìn)，葉綠素含量不斷增加，這與胡戎朔[6]的研究是一致的。此外，不同處理間差異隨著生育期推進(jìn)越來(lái)越大，可能是油菜生長(zhǎng)前期植株幼小，光合作用較弱，隨著植株生長(zhǎng)，總?cè)~片數(shù)、綠葉數(shù)增多，光合指數(shù)升高而導(dǎo)致[15]。

圖1 不同時(shí)期不同處理下葉綠素含量差異Fig.1 Difference of chlorophyll content under different treatments in different periods

2.2 營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期fad2、fad3表達(dá)差異

2.2.1 幼苗期基因表達(dá)差異 對(duì)幼苗期葉片中fad2、fad3的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2。fad2的表達(dá)量?jī)H在A2B1C2處理遠(yuǎn)高于對(duì)照，是對(duì)照的1.51倍，fad3的表達(dá)量則在A2B1C2、A2B1C3及A3B1C2處理，均高于對(duì)照，分別是對(duì)照的1.65，1.54，1.36倍。

fad2的表達(dá)量在A1B3C1處理下表達(dá)量最低，僅是對(duì)照的0.13倍，其次是A1B2C1與A1B3C3，分別是對(duì)照的0.18，0.23倍。fad3的表達(dá)量同fad2類似，在3個(gè)處理下，分別是對(duì)照的 0.12，0.21，0.18倍。另外，在A1B1C1處理，fad2、fad3的表達(dá)量也僅有對(duì)照的0.31，0.35倍?？傮w而言，在幼苗期，大部分肥密條件下都抑制兩者的表達(dá)。

圖2 fad2、fad3基因在幼苗期表達(dá)差異

2.2.2 五-六葉期基因表達(dá)差異 對(duì)五-六葉期葉片中fad2、fad3的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3。fad2在A2B1C2(1.86倍)、A3B1C2(1.57倍)與A2B1C3(1.51倍)處理時(shí)高于對(duì)照；fad3則在A2B1C2、A3B1C2與A2B1C3處理高于對(duì)照，分別是對(duì)照的1.51，1.50,1.31倍。

反之，fad2在A1B3C1(0.38倍)、A1B2C1(0.39倍)、A1B1C1(0.40倍)與A1B3C3(0.40倍)處理時(shí)遠(yuǎn)低于對(duì)照；fad3同之，分別是對(duì)照的0.15，0.19，0.23倍。此時(shí)期基因整體表達(dá)量大于幼苗期，可能是隨著生育期的推進(jìn)，油菜各生命活動(dòng)加強(qiáng)所致[16]。

圖3 fad2、fad3基因在五-六葉期表達(dá)差異

反之，fad2表達(dá)量在A1B1C1(0.46倍)、A1B2C1(0.38倍)、A1B3C1(0.35倍)、A3B3C1(0.27倍)及A1B3C3(0.23倍)處理下遠(yuǎn)低于對(duì)照。fad3在這幾種處理下表達(dá)量也較低，分別是對(duì)照的0.57，0.45，0.42，0.42，0.47倍。此時(shí)期是由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期的關(guān)鍵期，是油菜吸收氮等元素最多的時(shí)期(http：//www.chinabaike.com/z/nong/sc/968921.html)，而fad2、fad3基因的表達(dá)量比五-六葉期有所增加但增幅不大，此外，在整個(gè)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，在氮、硼含量均最低(A1C1)條件下，無(wú)論密度(B)怎么變化，基因表達(dá)量均小于對(duì)照，可推測(cè)在氮、硼含量低時(shí)，密度對(duì)基因表達(dá)量的影響并不明顯。

圖4 fad2、fad3基因在蕾薹期表達(dá)差異

2.3 生殖生長(zhǎng)期fad2、fad3表達(dá)差異

2.3.1 花期基因表達(dá)差異 對(duì)花瓣中fad2、fad3的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5。fad2在A2B1C2處理表達(dá)量最高，是對(duì)照的1.60倍，其次是A3B1C2，是對(duì)照的1.53倍；fad3同之，分別是對(duì)照的1.63，1.57倍。

fad2表達(dá)量在A1B3C1處理下表達(dá)量最低，是對(duì)照的0.36倍，其次是在A1B2C1(0.39倍)、A3B1C1(0.45倍)與A1B3C3(0.48倍)處理下亦遠(yuǎn)低于對(duì)照。fad3同樣在A1B3C1處理表達(dá)量最低，是對(duì)照的0.43倍，其次在A3B3C1(0.46)、A3B3C3(0.48倍)處理表達(dá)量也較低。此時(shí)期比之營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，fad2、fad3的表達(dá)量有明顯提高，但除了上述幾個(gè)處理與對(duì)照有較大差異之外，其他處理與對(duì)照間均無(wú)明顯差異。

圖5 fad2、fad3基因在花瓣中的表達(dá)差異Fig.5 Differentially expressed of fad2 and fad3 in the petals

2.3.2 授粉后20-35 d種子基因表達(dá)差異 對(duì)授粉后20～35 d種子中fad2、fad3的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6。fad2在A2B1C2條件下有最大表達(dá)量，是對(duì)照的1.94倍，其次是在A2B1C3、 A3B1C3、A3B1C2條件下，分別是對(duì)照的1.60，1.54，1.50倍；fad3則僅在A2B1C2、A2B1C3處理遠(yuǎn)高于對(duì)照，分別是對(duì)照的1.55，1.52倍。

反之，fad2在A1B3C1(0.35倍)、A1B2C2(0.43倍)、A1B3C3(0.44倍)條件下均低于對(duì)照，fad3在A1B3C3條件下表達(dá)量最低，是對(duì)照的0.16倍，其次是A1B3C2、A1B2C1、A1B2C3處理，表達(dá)量分別是對(duì)照的0.19，0.27，0.29倍。此時(shí)期兩基因的表達(dá)量均達(dá)整個(gè)生育期的最大值，推測(cè)與角果期是脂肪酸積累的關(guān)鍵期有關(guān)[17]。

圖6 fad2、fad3基因在授粉后20～35 d種子中的表達(dá)差異Fig.6 Differentially expressed of fad2 and fad3 in 20-35 d seeds after pollination

2.3.3 角果皮中基因表達(dá)差異 對(duì)角果皮中fad2、fad3的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖7。fad2在A2B1C2處理表達(dá)量最高，是對(duì)照的1.80倍，其次是在A2B1C3處理，表達(dá)量是對(duì)照的1.50倍，fad3亦在A2B1C2處理表達(dá)量最高，是對(duì)照的1.85倍，其次在A3B1C2(1.56倍)、A2B1C3(1.51倍)處理表達(dá)量也較高。

反之，fad2表達(dá)量在A1B3C1(0.32倍)條件下表達(dá)量最低，其次是A1B3C3(0.35倍)、A1B2C3(0.42倍)、A3B3C1(0.47倍)處理均低于對(duì)照。fad3則在這幾種處理下也遠(yuǎn)低于對(duì)照，分別是對(duì)照的0.17，0.24，0.39，0.32倍，除此之外，fad3在A1B2C1處理下表達(dá)量也較低，僅為對(duì)照的0.21倍。與20～35 d的種子相比，角果皮中fad2、fad3的表達(dá)量明顯較低，推測(cè)此時(shí)角果皮作為油分積累的“源”向種子“庫(kù)”中轉(zhuǎn)移，角果皮的油分積累與種子呈相反趨勢(shì)，從基因?qū)用骝?yàn)證了傅壽仲等[18]的研究。

圖7 fad2、fad3基因在角果皮中的表達(dá)差異Fig.7 Differentially expressed of fad2 and fad3 in the pods

總體而言，生殖生長(zhǎng)期的基因表達(dá)量高于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，特別是角果期。生殖生長(zhǎng)期是油菜進(jìn)行脂肪酸積累的關(guān)鍵期，有效的肥料、種植密度條件可以促進(jìn)脂肪酸的積累，本研究在A2B1C2與 A2B1C3處理fad2、fad3基因均有較高表達(dá)量，可能有助于亞油酸與亞麻酸的合成。而在A1B3C1、A3B3C1及A1B3C3處理下fad2、fad3均有較低表達(dá)量，可能有助于其他類脂肪酸(如油酸等)的積累，推動(dòng)油菜籽品質(zhì)的提高。

2.4 不同時(shí)期葉綠素含量與基因表達(dá)量之間的關(guān)系

不同時(shí)期葉綠素含量與fad2、fad3表達(dá)量之間的關(guān)系如表3。在整個(gè)生育期，葉綠素含量與fad2、fad3之間表現(xiàn)出相同的變化規(guī)律，即隨著N、B肥的增加而先增加后減少，隨著密度的增加而減少。Broun等[8]證實(shí)不飽和脂肪酸參與構(gòu)成葉綠體膜骨架葉綠素含量變化，本試驗(yàn)中，通過(guò)線性擬合分析兩者間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)量與葉綠素含量擬合度較高，呈正相關(guān)關(guān)系。

表3 葉綠素含量與基因表達(dá)量之間的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis between chlorophyll content and gene expression in different periods

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

通過(guò)對(duì)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期與生殖生長(zhǎng)期fad2、fad3基因表達(dá)量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)fad2、fad3在A2B1C2與 A2B1C3處理下均有較高表達(dá)量，而在A1B3C1、A3B3C1及A1B3C3處理下均有較低表達(dá)量?？傮w而言，增加氮、硼肥在一定程度上可促進(jìn)葉綠素含量以及fad2、fad3表達(dá)量的增加，過(guò)多則抑制，而增加種植密度則會(huì)抑制葉綠素含量以及fad2、fad3表達(dá)量。另一方面，fad2、fad3表達(dá)量變化規(guī)律同葉綠素含量變化規(guī)律相同，呈正相關(guān)關(guān)系。

3.2 討論

施肥量及種植密度對(duì)農(nóng)作物各個(gè)方面均有較大的影響，本研究發(fā)現(xiàn)在不同肥密條件處理下，fad2、fad3的表達(dá)量有較大差異，尤其是在生殖生長(zhǎng)期。李志玉等[19]對(duì)雙低油菜新品種中油雜8號(hào)施用氮磷硼肥表明，施用氮磷硼肥的作用主要是促進(jìn)油菜后期的生長(zhǎng)發(fā)育；楊美等[20]以甘藍(lán)型雙低油菜華雙4號(hào)為材料，通過(guò)盆栽試驗(yàn)證明硼肥過(guò)高或過(guò)低對(duì)油菜品質(zhì)都有影響；曾宇等[21]證明肥密相互協(xié)調(diào)作用是獲得產(chǎn)量品質(zhì)俱佳的關(guān)鍵，且種植密度對(duì)油酸、亞油酸等的含量影響不大，本試驗(yàn)則從基因?qū)用骝?yàn)證了這一研究。

亞油酸、亞麻酸無(wú)論對(duì)作物本身還是對(duì)人體而言，都有不可或缺的作用，但含量過(guò)高會(huì)引發(fā)機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂，從而引起一系列病癥，如脂肪肝等[22-23]。且亞油酸極易被氧化，作為食用油時(shí)不耐高溫，易腐壞[24]，故而對(duì)油脂品質(zhì)有一定影響。本研究中，在A1B3C1、A3B3C1及A1B3C3處理下fad2、fad3均有較低表達(dá)量，可能有助于其他類脂肪酸(如油酸等)的積累，從而提高油菜籽品質(zhì)，有待進(jìn)一步研究。

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