邵彩虹，李 瑤，錢銀飛，陳 金，陳先茂，關(guān)賢交，劉光榮，彭春瑞，邱才飛

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 土壤肥料與資源環(huán)境研究所，江西 南昌 330200；2.農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江中下游作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330200)

水稻根系不僅僅是作為植株養(yǎng)分和水分的吸收器官，還是包括植物激素在內(nèi)的多種活性物質(zhì)的合成器官，根系與地上部農(nóng)藝性狀密切相關(guān)，其發(fā)育狀況直接影響地上部分的生長(zhǎng)發(fā)育，尤其是根尖合成的細(xì)胞分裂素(CTK)、赤霉素(CA)能有效提高地上部的抗衰老能力[1-2]。相對(duì)于地上部位，根系有較高的可塑性，可通過(guò)改變形態(tài)和結(jié)構(gòu)來(lái)適應(yīng)環(huán)境的變化[3-5]。眾多研究者也從植物生理學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等角度對(duì)逆境條件下水稻根系生長(zhǎng)發(fā)育特性開(kāi)展了研究，結(jié)果表明，養(yǎng)分缺乏引起葉片合成生長(zhǎng)素向根系極性運(yùn)輸發(fā)生變化，而淀粉、糖類在根系積累增加，引起根冠比增加，側(cè)根密度降低[6-9]；水稻生育后期對(duì)地上部進(jìn)行適度遮蔭可刺激根系生長(zhǎng)、延緩衰老[10]；蛋白質(zhì)組分析顯示，養(yǎng)分脅迫可誘導(dǎo)根系中參與細(xì)胞分裂、分化的蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，參與木質(zhì)素合成的蛋白質(zhì)表達(dá)量增強(qiáng)，呼吸代謝減弱，是養(yǎng)分脅迫下水稻根系發(fā)生衰老的內(nèi)在機(jī)理[11]。

長(zhǎng)期以來(lái)，養(yǎng)分管理作為栽培調(diào)控的重要手段，對(duì)水稻生長(zhǎng)發(fā)育的影響一直是栽培學(xué)研究的熱點(diǎn)，其中對(duì)根系的研究近年來(lái)逐漸得到重視。目前，關(guān)于氮素脅迫對(duì)根系影響的研究更多的是側(cè)重于生理方面，分子水平研究相對(duì)較少。近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在揭示生命活動(dòng)機(jī)理的研究中得到了快速發(fā)展，其中，轉(zhuǎn)錄組研究是通過(guò)測(cè)序技術(shù)揭示同一細(xì)胞在不同生長(zhǎng)時(shí)期及生長(zhǎng)環(huán)境下基因表達(dá)(RNA)情況的差異，并逐漸發(fā)展為應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)[12]。研究表明，逆境條件下，植物可通過(guò)調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)提高植物對(duì)逆境的耐受力，通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)差異分析，可獲得更全面的生物學(xué)信息[13-17]，在揭示植物相關(guān)逆境適應(yīng)機(jī)理方面具有重要的意義。

鑒于根系逆境環(huán)境響應(yīng)和轉(zhuǎn)錄因子研究的重要性，本研究擬對(duì)氮素脅迫下水稻根系的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)變化進(jìn)行分析，以揭示氮素脅迫下水稻根系應(yīng)答的分子機(jī)理，為栽培調(diào)控提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料培養(yǎng)

以篩選出的不耐養(yǎng)分脅迫易早衰水稻品種威優(yōu)916為材料，三葉一心期移栽至水培桶(15 L)，每桶3苗，采用霍格蘭全營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，每3 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液；至五葉一心期設(shè)置2個(gè)處理：①對(duì)照：繼續(xù)全營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)；②氮素脅迫：采用缺氮霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行養(yǎng)分脅迫。每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)。處理7 d后，取水稻根系，液氮速凍后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及處理 取每個(gè)處理根尖部混合樣品1 g左右，參考TaKaRa全RNA提取試劑操作說(shuō)明進(jìn)行根系RNA提取。

1.2.2 文庫(kù)的構(gòu)建及測(cè)序 水稻根系cDNA文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序均委托深圳華大公司完成。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝及基因功能注釋 對(duì)水稻根系的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及對(duì)獲得的數(shù)據(jù)庫(kù)Unigene的全面分析和注釋，均委托深圳華大公司完成。具體的數(shù)據(jù)分析流程如圖1所示。

圖1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)分析Fig.1 Data analysis of digital transcriptome

2 結(jié)果與分析

2.1 根系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝

對(duì)照根系(CKR)及氮素脅迫下處理根系(SR)轉(zhuǎn)錄組經(jīng)測(cè)序，分別得到58 113 122，58 972 912條Raw reads，去除含adaptor的reads、N的比例(過(guò)濾后不確定的堿基比例)大于5%的reads及低質(zhì)量reads，分別得到52 816 936，53 170 968條Clean reads，Q20的百分率(過(guò)濾后質(zhì)量不低于20的堿基的比例)分別達(dá)到97.69%和97.57%，均大于90%，質(zhì)量合格，符合后續(xù)分析要求(表1)。GC 含量(過(guò)濾后堿基G和C數(shù)占總堿基數(shù)的比例)是基因組堿基序列的重要特征之一，好的測(cè)序質(zhì)量GC含量接近正態(tài)分布，本研究中，不同處理下水稻根系的 GC 含量平均值為49.61%和49.88%，顯示本次測(cè)序質(zhì)量較好。

表1 測(cè)序產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)Tab.1 Output statistics of sequencing

對(duì)獲得的不同處理下威優(yōu)916根系reads片段采用over-lap的方法進(jìn)行拼接(表2)，分別獲得了106 103，107 488個(gè)Contig片段，序列長(zhǎng)度分別達(dá)到了46 993 431，47 068 436 nt，平均長(zhǎng)度及N50分別為443 nt、950和438 nt、938。其中，長(zhǎng)度在200～500 nt的Contig片段分別為82 262，83 934條，比例達(dá)到了78%，長(zhǎng)度在600～1 200 nt的Contig片段所占比例為13%，長(zhǎng)度大于1 200 nt的Contig片段所占比例為9%(圖2)。

在獲得了Contig數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行拼接，分別獲得了74 239，75 006個(gè)Unigene片段(表2)，其中，屬于同源基因分別有19 539，19 522個(gè)，屬于單獨(dú)基因的分別有54 700，55 484個(gè)；序列長(zhǎng)度達(dá)到61 524 187，62 720 962 nt。

表2 組裝質(zhì)量統(tǒng)計(jì)Tab.2 Statistics of assembly quality

圖2 根系轉(zhuǎn)錄組的Contig數(shù)據(jù)長(zhǎng)度分布Fig.2 Conting data length distribution for digital transcriptome of rice root

2.2 Unigene功能注釋及GO分類

數(shù)據(jù)分析顯示，氮素脅迫誘導(dǎo)了威優(yōu)916根系中4 072個(gè)Unigene的表達(dá)量發(fā)生了變化，其中，上調(diào)表達(dá)的有1 933個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有2 139個(gè)(圖3)。以log2 Ratio(SR/CKR)>2作為基因表達(dá)顯著差異判斷標(biāo)準(zhǔn)；共獲得了2 270個(gè)在轉(zhuǎn)錄水平上差異顯著的Unigene(表3)，其中，上調(diào)表達(dá)的有1 176個(gè)，以變化為4>log2 Ratio(SR/CKR)>2的Unigene為主，占81%，下調(diào)表達(dá)的有1 094個(gè)，4>log2 Ratio(SR/CKR)>2的Unigene占53.8%，變化在12>log2 Ratio(SR/CKR)>4的占36.1%，log2 Ratio(SR/CKR)>12的占10.5%。

通過(guò)數(shù)據(jù)比對(duì)工具BlastX將Unigene序列比對(duì)到蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)NR、Swiss-Prot、KEGG及COG(evalue<0.000 01)，并通過(guò)數(shù)據(jù)比對(duì)工具Blast將Unigene比對(duì)到核酸數(shù)據(jù)庫(kù)Nt(evalue<0.000 01)，從而獲得跟給定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，得到該Unigene的蛋白功能注釋信息。

圖3 不同處理下水稻根系基因差異表達(dá)Fig.3 Differentially expressed genes inrice root under different treatment

變化倍數(shù)對(duì)數(shù)值(SR/CKR)log2Ratio上調(diào)Up-regu-lation下調(diào)Down-regu-lation合計(jì)Total2～495358915424～8351822178～12152213365>1236110146合計(jì)Total117610942270

根系差異表達(dá)基因根據(jù)GO功能分類，可分為分子功能(Molecular function)、細(xì)胞組分(Cellular component)及生物學(xué)過(guò)程(Biological process)三大類，涉及48條功能分支(圖4)，其中，樣本基因數(shù)量在1 000條以上參與生物學(xué)過(guò)程的主要聚集于細(xì)胞過(guò)程(Cellular process)和代謝過(guò)程(Metabolic process)；參與細(xì)胞組分的主要聚集于細(xì)胞(Cell)、細(xì)胞組分(Cell part)、隔膜(Membrane)及細(xì)胞器(Organelle)；參與分子功能的差異表達(dá)基因主要為結(jié)合(Binding)和催化活性(Catalytic activity)相關(guān)代謝途徑。

2.3 根系差異表達(dá)Unigene的KEGG代謝通路分析

為進(jìn)一步分析差異表達(dá)基因的生物學(xué)行為，結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)氮素脅迫下水稻根系差別異表達(dá)基因的Pathway注釋進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，根系差異表達(dá)Unigenes參與的主要生化代謝途徑有118條(表4)。其中，涉及差異表達(dá)基因(GEGs)最多的代謝通路是核糖體(ko03010)，共有404條Unigene；其次是RNA轉(zhuǎn)運(yùn)(ko03013，392條Unigene)、mRNA監(jiān)視系統(tǒng)(ko03015，322條Unigene)及次生代謝生物合成(ko01110，299條Unigene)，這意味著在根系mRNA監(jiān)視體統(tǒng)下，氮素脅迫誘導(dǎo)根系中RNA合成大量新生的蛋白質(zhì)，形成各種酶類，促使新的RNA合成，從而合成更多的新生蛋白質(zhì)，線粒體及核糖體也同時(shí)形成[18]，根系表現(xiàn)出受養(yǎng)分脅迫刺激而發(fā)生了伸長(zhǎng)生長(zhǎng)[11]；而次生代謝途徑相關(guān)基因的差異表達(dá)，是植株響應(yīng)環(huán)境養(yǎng)分脅迫，提高自身生存適應(yīng)性，協(xié)調(diào)植株與環(huán)境關(guān)系的重要體現(xiàn)[19]。

2.4 根系分化伸長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)

養(yǎng)分脅迫誘導(dǎo)水稻根系發(fā)生了伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，是一系列基因表達(dá)發(fā)生了變化，從而引起代謝變化的結(jié)果，其中生長(zhǎng)素的變化對(duì)水稻根系的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的作用。本研究中，檢測(cè)到根系中負(fù)責(zé)生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸?shù)纳L(zhǎng)素外流蛋白基因OsPIN家族基因的表達(dá)量發(fā)生了變化，基因OsPIN2、OsPIN1b及OsPIN1c的表達(dá)量均顯示出受氮素脅迫誘導(dǎo)上調(diào)， 根系自身合成IAA途徑之一是乙醛脫氫酶通過(guò)催化吲哚-3-乙醛生成吲哚乙酸，氮素脅迫下，水稻根系的乙醛脫氫酶基因CYP71A1表達(dá)量發(fā)生了下調(diào)，這些與IAA生成相關(guān)基因的變化表明，氮素脅迫誘導(dǎo)根系IAA積累更多來(lái)自極性運(yùn)輸，自身IAA合成能力下降；植物源內(nèi)切β葡聚糖酶(EGase)與植物細(xì)胞伸長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，基因EGase在氮素脅迫的水稻根系中表達(dá)量高于全營(yíng)養(yǎng)處理，是全營(yíng)養(yǎng)處理根系的2倍，EGase基因的表達(dá)量(Rawfragment)高達(dá)2 278，從而誘導(dǎo)根系細(xì)胞發(fā)生伸長(zhǎng)，根系表現(xiàn)出快速生長(zhǎng)；木質(zhì)素是根系的重要組成成分，伴隨大量新生根系的分化伸長(zhǎng)，根系中參與木質(zhì)素合成的肉桂酰輔酶A還原酶(CCR1)表達(dá)量在氮素脅迫下發(fā)生了上調(diào)變化，從而滿足新生根系生長(zhǎng)發(fā)育的需求(圖5)。

Biological regulation.生物調(diào)節(jié)；Cellular component organization or biogenesis.細(xì)胞組分組織或生物形成； Cellular process.細(xì)胞過(guò)程； Developmental process.發(fā)育過(guò)程； Establishment of localization.定位建成； Growth.生長(zhǎng)； Immune system process.免疫系統(tǒng)過(guò)程； Localization.定位； Locomotion.運(yùn)動(dòng)力；Metabolic process.代謝過(guò)程；Multi-organism process.多-有機(jī)體過(guò)程；Multicellular organismal process.多細(xì)胞有機(jī)體過(guò)程；Negative regulation of biological process.被動(dòng)的生物學(xué)調(diào)控過(guò)程；Positive regulation of biological process.主動(dòng)的生物學(xué)調(diào)控過(guò)程；Regulation of biological process.生物學(xué)調(diào)控過(guò)程；Reproduction.復(fù)制；Reproductive process.復(fù)制過(guò)程；Response to stimulus.刺激反應(yīng)；Rhythmic process.節(jié)律性過(guò)程；Signaling.信號(hào)；Single-organism process.單生物過(guò)程；Cell.細(xì)胞；Cell junction.細(xì)胞連接；Cell part.細(xì)胞組分；Extracellular matrix.細(xì)胞外基質(zhì)；Extracellular region.胞外區(qū)； Extracellular region part.胞外區(qū)部分；Macromolecular complex.高分子復(fù)合物；Membrane.隔膜；Membrane part.隔膜部分；Membrane-enclosed lumen.膜蛋白；Nucleoid.擬核；Organelle.細(xì)胞器；Organelle part.細(xì)胞器部分；Symplast.共質(zhì)體；Antioxidant activity.抗氧化劑活性；Binding.結(jié)合；Catalytic activity.催化活性；Channel regulator activity.通道調(diào)節(jié)活性；Electron carrier activity.電子載體；Enzyme regulator activity.酶調(diào)節(jié)活性；Molecular transducer activity.分子傳導(dǎo)活性；Nucleic acid binding transcription factor activity.核酸結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子活性；Nutrient reservoir activity.營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性；Protein binding transcription factor activity.蛋白結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子活性；Receptor activity.受體活性；Structural molecule activity.結(jié)構(gòu)分子活性；Transporter activity.轉(zhuǎn)運(yùn)活性。

圖4 根系轉(zhuǎn)錄組48種GO功能分類Fig.4 48 types of gene ontology classification of the rice root transcriptome

表4(續(xù))

圖5 水稻根系生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)Fig.5 The growth genes expression level of rice root

3 討論與結(jié)論

已有的研究顯示，逆境條件(養(yǎng)分脅迫、水分脅迫)可以誘導(dǎo)水稻根系在短期內(nèi)發(fā)生伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，根冠比顯著增加。生長(zhǎng)素影響植物細(xì)胞的伸長(zhǎng)和分裂，對(duì)植物的發(fā)育和形態(tài)建成具有重要的作用。研究顯示，逆境脅迫促進(jìn)生長(zhǎng)素在根系的積累，是導(dǎo)致水稻根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的內(nèi)在機(jī)理之一，水稻根系的生長(zhǎng)素一部分來(lái)自根系自身生物合成，另一部分是由地上部極性運(yùn)輸?shù)礁礫20]，這一極性運(yùn)輸過(guò)程是由根系的外流運(yùn)輸?shù)鞍譖IN的不對(duì)稱分布引起的[21]。在本研究中，檢測(cè)到了外流運(yùn)輸?shù)鞍譖IN家族中的OsPIN2、OsPIN1b及OsPIN1c基因表達(dá)量均顯示出受氮素脅迫誘導(dǎo)發(fā)生上調(diào)變化，另檢測(cè)到與根系生長(zhǎng)素直接合成相關(guān)的CYP71A1基因表達(dá)發(fā)生了下調(diào)變化，這些基因的變化表明，氮素脅迫引起根系自身IAA合成能力減弱，但I(xiàn)AA由地上部向根系極性運(yùn)輸增強(qiáng)，是根系IAA積累并引起根系快速伸長(zhǎng)的重要因素，這一結(jié)果與Liu等[20]在玉米上采用同位素研究的結(jié)果一致。孫虎威等[6]研究結(jié)果顯示，低氮脅迫誘導(dǎo)水稻的根冠比增加，相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果表明，根系外流運(yùn)輸?shù)鞍譖IN家族中除OsPIN1c的表達(dá)量上調(diào)外，OsPIN1a-b、OsPIN5a-b及OsPIN9基因表達(dá)發(fā)生下調(diào)，同時(shí)根系中的生長(zhǎng)素濃度降低。這些研究結(jié)果顯示，外流運(yùn)輸?shù)鞍譖IN家族中相關(guān)基因表達(dá)量的變化與IAA積累密切相關(guān)，相關(guān)基因的相反變化引起了外流運(yùn)輸?shù)鞍譖IN的不對(duì)稱分布，引起生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸，從而引起根系發(fā)生伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。

生長(zhǎng)素作用機(jī)理基因活化學(xué)說(shuō)表明，IAA的生長(zhǎng)效應(yīng)是在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)的合成而影響生長(zhǎng)的，當(dāng)IAA與激素受體蛋白結(jié)合后，可激活細(xì)胞內(nèi)第二信使，基因開(kāi)始轉(zhuǎn)錄和翻譯，合成新的mRNA和蛋白質(zhì)[22]。在本研究中，根系發(fā)生差異表達(dá)基因涉及最多的代謝通路是核糖體，其次是RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、mRNA監(jiān)視系統(tǒng)及次生代謝生物合成，這意味著氮素脅迫下，IAA通過(guò)活化相關(guān)基因，合成大量新的mRNA和新生的蛋白質(zhì)，形成各種酶類，促使新的RNA合成，從而合成更多的新生蛋白質(zhì)，根系大量發(fā)生，根冠比增加，這些基因的變化也印證了生長(zhǎng)素作用機(jī)理基因活化學(xué)說(shuō)。

植物源內(nèi)切β葡聚糖酶(EGase)在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有廣泛的作用，從豌豆正在伸長(zhǎng)的黃化苗上胚軸、擬南芥的花序柄伸長(zhǎng)區(qū)及煙草植株和根系的伸長(zhǎng)區(qū)分離到編碼EGase的相關(guān)基因，在植物的延伸區(qū)域高量表達(dá)，且與細(xì)胞伸長(zhǎng)的快慢相對(duì)應(yīng)，但在已經(jīng)停止伸展的區(qū)域則不表達(dá)或低表達(dá)，表明EGase在參與植物細(xì)胞伸長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮了重要作用[23-25]，而且可能直接參與了組織中的纖維素生物合成[26]。本研究中，EGase在氮素脅迫下表達(dá)量明顯上調(diào)，表達(dá)量是正常氮素供應(yīng)情況的2倍，這一變化結(jié)果表明，氮素脅迫誘導(dǎo)EGase在水稻根系發(fā)生高表達(dá)，從而引起根系細(xì)胞的伸長(zhǎng)發(fā)育，這也是養(yǎng)分脅迫誘導(dǎo)根系快速生長(zhǎng)的內(nèi)在機(jī)理之一。

木質(zhì)素是形成植物骨架的主要成分，對(duì)于植物的抗倒、抗逆和抗病起到舉足輕重的作用[27]，而肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)是參與木質(zhì)素特異合成途徑的關(guān)鍵酶[28]，其中基因CCR1表達(dá)部位集中在木質(zhì)化程度高的部位，直接參與木質(zhì)素合成[29]。本研究中，檢測(cè)到參與木質(zhì)素合成的基因CCR1在水稻根系中因養(yǎng)分脅迫誘導(dǎo)而發(fā)生表達(dá)量上調(diào)，參與根系細(xì)胞分化伸長(zhǎng)的木質(zhì)化過(guò)程，增強(qiáng)根系細(xì)胞的韌性和強(qiáng)度。

為深入系統(tǒng)地了解短期氮素脅迫對(duì)水稻根系生長(zhǎng)發(fā)育的影響，本研究以氮素脅迫下水稻根系為材料，對(duì)水稻根系轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異進(jìn)行分析，經(jīng)Illumina Hiseq2000平臺(tái)測(cè)序，分別獲得了52 816 936，53 170 968條Clean reads，Q20的百分率分別達(dá)到97.69%和97.57%(>90%)，質(zhì)量合格，滿足后續(xù)分析要求。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，根據(jù)GO功能分類，根系發(fā)生差異表達(dá)的基因可分為生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分及分子功能三大類48個(gè)分支，經(jīng)Pathway功能注釋，這些差異表達(dá)基因可歸類到118條生化代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。根系中參與生長(zhǎng)素積累、細(xì)胞分化伸長(zhǎng)、木質(zhì)素合成及新生蛋白質(zhì)合成的相關(guān)基因發(fā)生差異表達(dá)，是引起根系伸長(zhǎng)的重要因素之一。為進(jìn)一步驗(yàn)證分析根系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果，筆者將對(duì)獲得的與能量代謝 、氨基酸代謝、氮代謝及信號(hào)傳導(dǎo)等相關(guān)的基因表達(dá)情況進(jìn)行定量PCR分析，以揭示并分析氮素脅迫誘導(dǎo)對(duì)水稻根系生長(zhǎng)發(fā)育影響的分子機(jī)理，為生產(chǎn)栽培提供理論依據(jù)。

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