邵彩虹，李 瑤，錢銀飛，陳 金，陳先茂，關賢交，劉光榮，彭春瑞，邱才飛

(1.江西省農業(yè)科學院 土壤肥料與資源環(huán)境研究所，江西 南昌 330200；2.農業(yè)部長江中下游作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室，江西 南昌 330200)

水稻根系不僅僅是作為植株養(yǎng)分和水分的吸收器官，還是包括植物激素在內的多種活性物質的合成器官，根系與地上部農藝性狀密切相關，其發(fā)育狀況直接影響地上部分的生長發(fā)育，尤其是根尖合成的細胞分裂素(CTK)、赤霉素(CA)能有效提高地上部的抗衰老能力[1-2]。相對于地上部位，根系有較高的可塑性，可通過改變形態(tài)和結構來適應環(huán)境的變化[3-5]。眾多研究者也從植物生理學、蛋白質組學等角度對逆境條件下水稻根系生長發(fā)育特性開展了研究，結果表明，養(yǎng)分缺乏引起葉片合成生長素向根系極性運輸發(fā)生變化，而淀粉、糖類在根系積累增加，引起根冠比增加，側根密度降低[6-9]；水稻生育后期對地上部進行適度遮蔭可刺激根系生長、延緩衰老[10]；蛋白質組分析顯示，養(yǎng)分脅迫可誘導根系中參與細胞分裂、分化的蛋白質表達上調，參與木質素合成的蛋白質表達量增強，呼吸代謝減弱，是養(yǎng)分脅迫下水稻根系發(fā)生衰老的內在機理[11]。

長期以來，養(yǎng)分管理作為栽培調控的重要手段，對水稻生長發(fā)育的影響一直是栽培學研究的熱點，其中對根系的研究近年來逐漸得到重視。目前，關于氮素脅迫對根系影響的研究更多的是側重于生理方面，分子水平研究相對較少。近年來，蛋白質組學、基因組學及轉錄組學技術在揭示生命活動機理的研究中得到了快速發(fā)展，其中，轉錄組研究是通過測序技術揭示同一細胞在不同生長時期及生長環(huán)境下基因表達(RNA)情況的差異，并逐漸發(fā)展為應用最為廣泛的技術[12]。研究表明，逆境條件下，植物可通過調控相關轉錄因子表達提高植物對逆境的耐受力，通過轉錄因子表達差異分析，可獲得更全面的生物學信息[13-17]，在揭示植物相關逆境適應機理方面具有重要的意義。

鑒于根系逆境環(huán)境響應和轉錄因子研究的重要性，本研究擬對氮素脅迫下水稻根系的轉錄組表達變化進行分析，以揭示氮素脅迫下水稻根系應答的分子機理，為栽培調控提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料培養(yǎng)

以篩選出的不耐養(yǎng)分脅迫易早衰水稻品種威優(yōu)916為材料，三葉一心期移栽至水培桶(15 L)，每桶3苗，采用霍格蘭全營養(yǎng)液培養(yǎng)，每3 d更換一次營養(yǎng)液；至五葉一心期設置2個處理：①對照：繼續(xù)全營養(yǎng)液培養(yǎng)；②氮素脅迫：采用缺氮霍格蘭營養(yǎng)液進行養(yǎng)分脅迫。每個處理設置5個重復。處理7 d后，取水稻根系，液氮速凍后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取及處理 取每個處理根尖部混合樣品1 g左右，參考TaKaRa全RNA提取試劑操作說明進行根系RNA提取。

1.2.2 文庫的構建及測序 水稻根系cDNA文庫構建及測序均委托深圳華大公司完成。

1.2.3 轉錄組數據組裝及基因功能注釋 對水稻根系的轉錄組測序及對獲得的數據庫Unigene的全面分析和注釋，均委托深圳華大公司完成。具體的數據分析流程如圖1所示。

圖1 轉錄組數據庫分析Fig.1 Data analysis of digital transcriptome

2 結果與分析

2.1 根系轉錄組數據組裝

對照根系(CKR)及氮素脅迫下處理根系(SR)轉錄組經測序，分別得到58 113 122，58 972 912條Raw reads，去除含adaptor的reads、N的比例(過濾后不確定的堿基比例)大于5%的reads及低質量reads，分別得到52 816 936，53 170 968條Clean reads，Q20的百分率(過濾后質量不低于20的堿基的比例)分別達到97.69%和97.57%，均大于90%，質量合格，符合后續(xù)分析要求(表1)。GC 含量(過濾后堿基G和C數占總堿基數的比例)是基因組堿基序列的重要特征之一，好的測序質量GC含量接近正態(tài)分布，本研究中，不同處理下水稻根系的 GC 含量平均值為49.61%和49.88%，顯示本次測序質量較好。

表1 測序產量統計Tab.1 Output statistics of sequencing

對獲得的不同處理下威優(yōu)916根系reads片段采用over-lap的方法進行拼接(表2)，分別獲得了106 103，107 488個Contig片段，序列長度分別達到了46 993 431，47 068 436 nt，平均長度及N50分別為443 nt、950和438 nt、938。其中，長度在200～500 nt的Contig片段分別為82 262，83 934條，比例達到了78%，長度在600～1 200 nt的Contig片段所占比例為13%，長度大于1 200 nt的Contig片段所占比例為9%(圖2)。

在獲得了Contig數據的基礎上，進一步進行拼接，分別獲得了74 239，75 006個Unigene片段(表2)，其中，屬于同源基因分別有19 539，19 522個，屬于單獨基因的分別有54 700，55 484個；序列長度達到61 524 187，62 720 962 nt。

表2 組裝質量統計Tab.2 Statistics of assembly quality

圖2 根系轉錄組的Contig數據長度分布Fig.2 Conting data length distribution for digital transcriptome of rice root

2.2 Unigene功能注釋及GO分類

數據分析顯示，氮素脅迫誘導了威優(yōu)916根系中4 072個Unigene的表達量發(fā)生了變化，其中，上調表達的有1 933個，下調表達的有2 139個(圖3)。以log2 Ratio(SR/CKR)>2作為基因表達顯著差異判斷標準；共獲得了2 270個在轉錄水平上差異顯著的Unigene(表3)，其中，上調表達的有1 176個，以變化為4>log2 Ratio(SR/CKR)>2的Unigene為主，占81%，下調表達的有1 094個，4>log2 Ratio(SR/CKR)>2的Unigene占53.8%，變化在12>log2 Ratio(SR/CKR)>4的占36.1%，log2 Ratio(SR/CKR)>12的占10.5%。

通過數據比對工具BlastX將Unigene序列比對到蛋白數據庫NR、Swiss-Prot、KEGG及COG(evalue<0.000 01)，并通過數據比對工具Blast將Unigene比對到核酸數據庫Nt(evalue<0.000 01)，從而獲得跟給定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，得到該Unigene的蛋白功能注釋信息。

圖3 不同處理下水稻根系基因差異表達Fig.3 Differentially expressed genes inrice root under different treatment

變化倍數對數值(SR/CKR)log2Ratio上調Up-regu-lation下調Down-regu-lation合計Total2～495358915424～8351822178～12152213365>1236110146合計Total117610942270

根系差異表達基因根據GO功能分類，可分為分子功能(Molecular function)、細胞組分(Cellular component)及生物學過程(Biological process)三大類，涉及48條功能分支(圖4)，其中，樣本基因數量在1 000條以上參與生物學過程的主要聚集于細胞過程(Cellular process)和代謝過程(Metabolic process)；參與細胞組分的主要聚集于細胞(Cell)、細胞組分(Cell part)、隔膜(Membrane)及細胞器(Organelle)；參與分子功能的差異表達基因主要為結合(Binding)和催化活性(Catalytic activity)相關代謝途徑。

2.3 根系差異表達Unigene的KEGG代謝通路分析

為進一步分析差異表達基因的生物學行為，結合KEGG數據庫，對氮素脅迫下水稻根系差別異表達基因的Pathway注釋進行分析。結果顯示，根系差異表達Unigenes參與的主要生化代謝途徑有118條(表4)。其中，涉及差異表達基因(GEGs)最多的代謝通路是核糖體(ko03010)，共有404條Unigene；其次是RNA轉運(ko03013，392條Unigene)、mRNA監(jiān)視系統(ko03015，322條Unigene)及次生代謝生物合成(ko01110，299條Unigene)，這意味著在根系mRNA監(jiān)視體統下，氮素脅迫誘導根系中RNA合成大量新生的蛋白質，形成各種酶類，促使新的RNA合成，從而合成更多的新生蛋白質，線粒體及核糖體也同時形成[18]，根系表現出受養(yǎng)分脅迫刺激而發(fā)生了伸長生長[11]；而次生代謝途徑相關基因的差異表達，是植株響應環(huán)境養(yǎng)分脅迫，提高自身生存適應性，協調植株與環(huán)境關系的重要體現[19]。

2.4 根系分化伸長相關基因的表達

養(yǎng)分脅迫誘導水稻根系發(fā)生了伸長生長，是一系列基因表達發(fā)生了變化，從而引起代謝變化的結果，其中生長素的變化對水稻根系的生長發(fā)育具有重要的作用。本研究中，檢測到根系中負責生長素極性運輸的生長素外流蛋白基因OsPIN家族基因的表達量發(fā)生了變化，基因OsPIN2、OsPIN1b及OsPIN1c的表達量均顯示出受氮素脅迫誘導上調， 根系自身合成IAA途徑之一是乙醛脫氫酶通過催化吲哚-3-乙醛生成吲哚乙酸，氮素脅迫下，水稻根系的乙醛脫氫酶基因CYP71A1表達量發(fā)生了下調，這些與IAA生成相關基因的變化表明，氮素脅迫誘導根系IAA積累更多來自極性運輸，自身IAA合成能力下降；植物源內切β葡聚糖酶(EGase)與植物細胞伸長發(fā)育密切相關，基因EGase在氮素脅迫的水稻根系中表達量高于全營養(yǎng)處理，是全營養(yǎng)處理根系的2倍，EGase基因的表達量(Rawfragment)高達2 278，從而誘導根系細胞發(fā)生伸長，根系表現出快速生長；木質素是根系的重要組成成分，伴隨大量新生根系的分化伸長，根系中參與木質素合成的肉桂酰輔酶A還原酶(CCR1)表達量在氮素脅迫下發(fā)生了上調變化，從而滿足新生根系生長發(fā)育的需求(圖5)。

Biological regulation.生物調節(jié)；Cellular component organization or biogenesis.細胞組分組織或生物形成； Cellular process.細胞過程； Developmental process.發(fā)育過程； Establishment of localization.定位建成； Growth.生長； Immune system process.免疫系統過程； Localization.定位； Locomotion.運動力；Metabolic process.代謝過程；Multi-organism process.多-有機體過程；Multicellular organismal process.多細胞有機體過程；Negative regulation of biological process.被動的生物學調控過程；Positive regulation of biological process.主動的生物學調控過程；Regulation of biological process.生物學調控過程；Reproduction.復制；Reproductive process.復制過程；Response to stimulus.刺激反應；Rhythmic process.節(jié)律性過程；Signaling.信號；Single-organism process.單生物過程；Cell.細胞；Cell junction.細胞連接；Cell part.細胞組分；Extracellular matrix.細胞外基質；Extracellular region.胞外區(qū)； Extracellular region part.胞外區(qū)部分；Macromolecular complex.高分子復合物；Membrane.隔膜；Membrane part.隔膜部分；Membrane-enclosed lumen.膜蛋白；Nucleoid.擬核；Organelle.細胞器；Organelle part.細胞器部分；Symplast.共質體；Antioxidant activity.抗氧化劑活性；Binding.結合；Catalytic activity.催化活性；Channel regulator activity.通道調節(jié)活性；Electron carrier activity.電子載體；Enzyme regulator activity.酶調節(jié)活性；Molecular transducer activity.分子傳導活性；Nucleic acid binding transcription factor activity.核酸結合的轉錄因子活性；Nutrient reservoir activity.營養(yǎng)庫活性；Protein binding transcription factor activity.蛋白結合的轉錄因子活性；Receptor activity.受體活性；Structural molecule activity.結構分子活性；Transporter activity.轉運活性。

圖4 根系轉錄組48種GO功能分類Fig.4 48 types of gene ontology classification of the rice root transcriptome

表4(續(xù))

圖5 水稻根系生長相關基因表達Fig.5 The growth genes expression level of rice root

3 討論與結論

已有的研究顯示，逆境條件(養(yǎng)分脅迫、水分脅迫)可以誘導水稻根系在短期內發(fā)生伸長生長，根冠比顯著增加。生長素影響植物細胞的伸長和分裂，對植物的發(fā)育和形態(tài)建成具有重要的作用。研究顯示，逆境脅迫促進生長素在根系的積累，是導致水稻根系伸長生長的內在機理之一，水稻根系的生長素一部分來自根系自身生物合成，另一部分是由地上部極性運輸到根系[20]，這一極性運輸過程是由根系的外流運輸蛋白PIN的不對稱分布引起的[21]。在本研究中，檢測到了外流運輸蛋白PIN家族中的OsPIN2、OsPIN1b及OsPIN1c基因表達量均顯示出受氮素脅迫誘導發(fā)生上調變化，另檢測到與根系生長素直接合成相關的CYP71A1基因表達發(fā)生了下調變化，這些基因的變化表明，氮素脅迫引起根系自身IAA合成能力減弱，但IAA由地上部向根系極性運輸增強，是根系IAA積累并引起根系快速伸長的重要因素，這一結果與Liu等[20]在玉米上采用同位素研究的結果一致。孫虎威等[6]研究結果顯示，低氮脅迫誘導水稻的根冠比增加，相關基因表達檢測結果表明，根系外流運輸蛋白PIN家族中除OsPIN1c的表達量上調外，OsPIN1a-b、OsPIN5a-b及OsPIN9基因表達發(fā)生下調，同時根系中的生長素濃度降低。這些研究結果顯示，外流運輸蛋白PIN家族中相關基因表達量的變化與IAA積累密切相關，相關基因的相反變化引起了外流運輸蛋白PIN的不對稱分布，引起生長素的極性運輸，從而引起根系發(fā)生伸長生長。

生長素作用機理基因活化學說表明，IAA的生長效應是在轉錄和翻譯水平上促進核酸和蛋白質的合成而影響生長的，當IAA與激素受體蛋白結合后，可激活細胞內第二信使，基因開始轉錄和翻譯，合成新的mRNA和蛋白質[22]。在本研究中，根系發(fā)生差異表達基因涉及最多的代謝通路是核糖體，其次是RNA轉運、mRNA監(jiān)視系統及次生代謝生物合成，這意味著氮素脅迫下，IAA通過活化相關基因，合成大量新的mRNA和新生的蛋白質，形成各種酶類，促使新的RNA合成，從而合成更多的新生蛋白質，根系大量發(fā)生，根冠比增加，這些基因的變化也印證了生長素作用機理基因活化學說。

植物源內切β葡聚糖酶(EGase)在植物的生長發(fā)育過程中具有廣泛的作用，從豌豆正在伸長的黃化苗上胚軸、擬南芥的花序柄伸長區(qū)及煙草植株和根系的伸長區(qū)分離到編碼EGase的相關基因，在植物的延伸區(qū)域高量表達，且與細胞伸長的快慢相對應，但在已經停止伸展的區(qū)域則不表達或低表達，表明EGase在參與植物細胞伸長發(fā)育中發(fā)揮了重要作用[23-25]，而且可能直接參與了組織中的纖維素生物合成[26]。本研究中，EGase在氮素脅迫下表達量明顯上調，表達量是正常氮素供應情況的2倍，這一變化結果表明，氮素脅迫誘導EGase在水稻根系發(fā)生高表達，從而引起根系細胞的伸長發(fā)育，這也是養(yǎng)分脅迫誘導根系快速生長的內在機理之一。

木質素是形成植物骨架的主要成分，對于植物的抗倒、抗逆和抗病起到舉足輕重的作用[27]，而肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)是參與木質素特異合成途徑的關鍵酶[28]，其中基因CCR1表達部位集中在木質化程度高的部位，直接參與木質素合成[29]。本研究中，檢測到參與木質素合成的基因CCR1在水稻根系中因養(yǎng)分脅迫誘導而發(fā)生表達量上調，參與根系細胞分化伸長的木質化過程，增強根系細胞的韌性和強度。

為深入系統地了解短期氮素脅迫對水稻根系生長發(fā)育的影響，本研究以氮素脅迫下水稻根系為材料，對水稻根系轉錄組表達差異進行分析，經Illumina Hiseq2000平臺測序，分別獲得了52 816 936，53 170 968條Clean reads，Q20的百分率分別達到97.69%和97.57%(>90%)，質量合格，滿足后續(xù)分析要求。數據分析結果表明，根據GO功能分類，根系發(fā)生差異表達的基因可分為生物學過程、細胞組分及分子功能三大類48個分支，經Pathway功能注釋，這些差異表達基因可歸類到118條生化代謝及信號轉導途徑。根系中參與生長素積累、細胞分化伸長、木質素合成及新生蛋白質合成的相關基因發(fā)生差異表達，是引起根系伸長的重要因素之一。為進一步驗證分析根系轉錄組數據結果，筆者將對獲得的與能量代謝 、氨基酸代謝、氮代謝及信號傳導等相關的基因表達情況進行定量PCR分析，以揭示并分析氮素脅迫誘導對水稻根系生長發(fā)育影響的分子機理，為生產栽培提供理論依據。

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