梁瑞圓，陳曉勇，孫洪新，孫少華，敦偉濤，沈志強(qiáng)，劉軍峰，王 玨

(1.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北 保定 071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071000；3.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

我國(guó)地方綿羊種質(zhì)資源非常豐富[1]，其中包括以高產(chǎn)羔數(shù)著稱(chēng)的湖羊；以肉質(zhì)好著稱(chēng)的蘇尼特羊[2]；以常年發(fā)情和高繁殖力著稱(chēng)的小尾寒羊[3]等地方綿羊品種，但由于對(duì)地方品種的特性認(rèn)識(shí)和保護(hù)不夠以及受到外來(lái)品種引入的影響，這些地方良種綿羊品種資源數(shù)量和種類(lèi)都在不同程度上面臨著嚴(yán)重的危機(jī)[4]，如蘭州大尾羊、湖羊?yàn)l臨滅絕[4-5]，甚至棗北大尾羊已經(jīng)滅絕[6]。因此，開(kāi)展現(xiàn)有綿羊品種的起源、遺傳分類(lèi)、遺傳歸屬和品種保護(hù)，了解地方綿羊品種間和品種內(nèi)的親緣關(guān)系、起源進(jìn)化和遺傳多樣性對(duì)于品種保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用尤為重要。小尾寒羊是我國(guó)以繁殖力著稱(chēng)的地方品種，小尾寒羊主要分布在山東省南部、河北黑龍港流域、河南省北部等地，主要分為2個(gè)類(lèi)型：山東小尾寒羊和河北小尾寒羊，山東小尾寒羊主要特征是腿高、體格大；河北小尾寒羊主要分布在河北省黑龍港流域，四肢較山東小尾寒羊短，但尾巴較圓大，且公母羊均無(wú)角[7]。此外，湖羊、洼地綿羊和蘇尼特羊均以繁殖性能好為主要特征。隨著肉羊雜交利用和大量外來(lái)品種的引入，不同地方品種綿羊均存在較為廣泛的血統(tǒng)交流，目前，上述地方品種是否存在血統(tǒng)交流，是否存在與外來(lái)品種血統(tǒng)交叉，以及遺傳多樣性如何等問(wèn)題均有待分析。

線(xiàn)粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)是動(dòng)物體內(nèi)唯一長(zhǎng)期穩(wěn)定存在的核外遺傳物質(zhì)，因其具有重組率低、替換速度快、拷貝數(shù)高、嚴(yán)格母系遺傳、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等特點(diǎn)被廣泛用于動(dòng)物起源進(jìn)化和遺傳多樣性等研究[8-13]。因此，本研究分析了5個(gè)地方綿羊種群mtDNA 控制區(qū)(Displacement loop，D-loop)遺傳變異及序列特征、遺傳多樣性和種間、種內(nèi)遺傳距離，目的是為深入挖掘我國(guó)地方品種綿羊起源進(jìn)化、種質(zhì)資源和品種保護(hù)利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品準(zhǔn)備

每個(gè)地方綿羊種群血液樣品均取自健康的不同母源家系(表1)。從NCBI網(wǎng)站下載3條綿羊序列作為參照序列：灘羊GenBank 登錄號(hào) KF938336.1(簡(jiǎn)稱(chēng)：TAN)；阿勒泰GenBank 登錄號(hào) KF938320.1(簡(jiǎn)稱(chēng)：ALT)；山東大尾寒羊GenBank 登錄號(hào) KP981380.1(簡(jiǎn)稱(chēng)：SDW)。

表1 樣本信息Tab.1 Information of sample

1.2 DNA提取

參照康為世紀(jì)的血液基因組柱式試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

引物信息參照文獻(xiàn)[14]中的P18。PCR反應(yīng)體系20 μL：DNA 1.6 μL，10×PCR Buffer 2 μL，dNTP(10 mmol/L)0.4 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.12 μL，上、下游引物(10 mmol/L)0.8 μL，雙蒸水14.28 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序獲得的樣本序列與參考序列(GenBank：AF010406)進(jìn)行比對(duì)，確定樣本序列的序列長(zhǎng)度和突變位點(diǎn)信息。使用BioEdit 7.0和DNAStar-SeqMan軟件根據(jù)測(cè)序峰圖的實(shí)際情況，將測(cè)序獲得的DNA序列進(jìn)行比對(duì)、拼接及人工校正，利用ClustalX[15]軟件進(jìn)行序列比對(duì)后保存比對(duì)結(jié)果。使用DnaSP 5.10[16]軟件進(jìn)行分析序列間的堿基差異，獲得各個(gè)樣品的單倍型信息，計(jì)算單倍型多樣度、核酸多樣度、平均核苷酸差異數(shù)等參數(shù)，并進(jìn)行中性檢驗(yàn)。利用MEGA 6.0[17]軟件確定單倍型，計(jì)算序列長(zhǎng)度、堿基組成、突變位點(diǎn)數(shù)、遺傳距離等參數(shù)，并且基于Kumar雙參數(shù)模型進(jìn)行種群內(nèi)遺傳距離及分子系統(tǒng)分析，構(gòu)建鄰接法(Neighbor-joining，NJ)、最小進(jìn)化法(Minimum-evolution method，ME)和非加權(quán)組平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，利用Bootstrap法重復(fù)1 000次。對(duì)DnaSP 5.10獲得的Haplotype進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，使用Network 5.0軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)D-loop序列PCR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)結(jié)果條帶清晰可見(jiàn)，且條帶大小1 291 bp與引物設(shè)計(jì)長(zhǎng)度一致(圖1)。

2.2 序列特征分析

5個(gè)綿羊種群131只個(gè)體mtDNA D-loop區(qū)序列長(zhǎng)度為1 106～1 242 bp，其中長(zhǎng)度為1 106 bp 的個(gè)體有6只，1 180 bp 的有45只，1 181 bp 的有58只，1 182 bp 的有10只，1 183 bp 的有6只，其他長(zhǎng)度個(gè)體有6只(表2)。不同長(zhǎng)度差異的主要原因是75 bp串聯(lián)重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)不同，少數(shù)為插入和缺失引起的變異。

N.空白對(duì)照；M.Marker；1～22.河北小尾寒羊22個(gè)樣品D-loop區(qū)擴(kuò)增結(jié)果。N.Blank control；M.Marker；1-22.Amplification production for D-loop of Hebei Small-tailed Han Sheep.

表2 五個(gè)中國(guó)地方綿羊群體D-loop區(qū)序列特征Tab.2 The features of D-loop sequence in five Chinese local sheep population 只

2.3 多態(tài)性及單倍型分析

mtDNA D-loop區(qū)序列A、T、C、G堿基的平均含量分別為33.1%，29.7%，22.9%，14.3%，其中AT含量總和高于CG含量總和(62.8%>37.2%)，表現(xiàn)出AT偏移性。mtDNA D-loop區(qū)序列共包含135個(gè)多態(tài)變異位點(diǎn)，其中包括37個(gè)單一多態(tài)位點(diǎn)，占總數(shù)的27.4%。98個(gè)簡(jiǎn)約多態(tài)位點(diǎn)，占總數(shù)的72.6%。所有多態(tài)位點(diǎn)中除了插入缺失外，共出現(xiàn)了132次轉(zhuǎn)換，3次顛換。在5個(gè)種群中，山東小尾寒羊多態(tài)位點(diǎn)最多，湖羊多態(tài)位點(diǎn)最少(表3)。

表3 五個(gè)中國(guó)地方綿羊群體D-loop 區(qū)多態(tài)性及堿基組成Tab.3 Polymorphism and base composition of D-loop in five Chinese local sheep population

5個(gè)中國(guó)地方綿羊群體D-loop區(qū)序列中共含有108種單倍型，單倍型比例為82.4%，綿羊種群?jiǎn)伪缎投鄻佣葹?.995 0±0.002 1，其中山東小尾寒羊最高，為0.998 0，其次是河北小尾寒羊、洼地綿羊、蘇尼特羊分別為0.996 0，0.995 0，0.992 0，最少的是湖羊?yàn)?.974 0；核苷酸多樣度為0.017 20～0.022 22，其中河北小尾寒羊最高，為0.022 22。其次是山東小尾寒羊、湖羊、洼地綿羊分別為0.022 21，0.021 72，0.021 57，蘇尼特羊最低，為0.017 20。全群平均核苷酸差異數(shù)K為20.795(表4)。所有數(shù)據(jù)均表明遺傳多樣性相對(duì)豐富。Tajima′s D中性檢驗(yàn)結(jié)果(值變化-1.101 05～0.725 08)均不顯著(P>0.10)，說(shuō)明狀態(tài)平穩(wěn)，符合中性突變(表4)。

表4 五個(gè)中國(guó)地方綿羊群體D-loop 區(qū)遺傳多樣性參數(shù)Tab.4 Genetic diversity parameters of D-loop in five Chinese local sheep population

2.4 各種群間親緣關(guān)系分析

利用MEGA 6.0 軟件獲得5個(gè)地方綿羊種群種內(nèi)及種間遺傳距離，種間遺傳距離為0.019 5～0.027 7，山東小尾寒羊和蘇尼特羊之間的遺傳距離最近，為0.019 5；洼地綿羊和蘇尼特羊之間的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.027 7。種內(nèi)遺傳距離為0.016 5～0.021 8，蘇尼特羊種內(nèi)遺傳距離較近，為0.016 5；河北小尾寒羊種內(nèi)遺傳距離較遠(yuǎn)，為0.021 8(表5)。各種群間遺傳距離的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，河北小尾寒羊與洼地綿羊先聚在一起，再與湖羊聚在一起，最后與蘇尼特羊和山東小尾寒羊聚在一起，說(shuō)明河北小尾寒羊與洼地綿羊遺傳距離很近(圖2)。

表5 五個(gè)綿羊種群間及種內(nèi)D-loop區(qū)遺傳距離Tab.5 Genetic distance five of D-loop varieties and intraspecific in five sheep population

注：對(duì)角線(xiàn)為種群內(nèi)遺傳距離，對(duì)角線(xiàn)以下為種間遺傳距離。

Notes：On the diagonal was genetic distance within breeds，under the diagonal was genetic distance between breeds.

圖2 基于D-loop區(qū)構(gòu)建的5個(gè)綿羊群體遺傳距離NJ樹(shù)Fig.2 Genetic distance NJ tree of D-loop in five sheep population

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)MEGA 6.0采用Kumar雙參數(shù)Bootstrap重復(fù)1 000次檢驗(yàn)，對(duì)5個(gè)綿羊群體和山東大尾寒羊(SDW)、阿勒泰羊(ALT)、灘羊(TAN)D-loop控制區(qū)構(gòu)建NJ(圖3)、ME樹(shù)(圖4)以及UPGMA聚類(lèi)圖(圖5)，在mtDNA D-loop區(qū)所有的聚類(lèi)圖中，均表明支系A(chǔ)包括70只綿羊個(gè)體，B包括48只個(gè)體，C包括13只個(gè)體，3個(gè)支系分別占53.4%，36.7%，9.9%。其中ALT和SDW均與支系C聚在一起，TAN與支系A(chǔ)聚在一起。除支系C外，支系A(chǔ)和支系B均有河北小尾寒羊分布，表明該種群與其他支系存在基因交流。

利用Network 5.0繪制D-loop區(qū)序列的單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，結(jié)果顯示，131只個(gè)體D-loop區(qū)序列的108種單倍型聚為3個(gè)單倍型群，與NJ樹(shù)、ME樹(shù)及UPGMA聚類(lèi)圖分析結(jié)果一致，A單倍型群包括70只個(gè)體，其中蘇尼特羊26只，山東小尾寒羊23只，湖羊9只，河北小尾寒羊9只，洼地綿羊3只；B單倍型群包括48只個(gè)體，其中河北小尾寒羊13只，山東小尾寒羊8只，蘇尼特羊5只，湖羊12只，洼地綿羊10只；C單倍型群包括13只個(gè)體，其中山東小尾寒羊4只，蘇尼特羊1只，湖羊1只，洼地綿羊7只。其中單倍型H_8和H_23分別在A、B單倍型群的中心位置，是2個(gè)主要的共享單倍型。另外，單倍型H_14、H_27、H_30、H_34、H_43、H_45、H_49、H_51、H_85、H_89均為共享單倍型(圖6)。表明河北小尾寒羊與其他上述地方綿羊種群間存在一定的基因交流。

3 討論與結(jié)論

中國(guó)養(yǎng)羊歷史悠久，綿羊種類(lèi)繁多，廣泛分布于從高海拔的青藏高原到地勢(shì)較低的東部地區(qū)。根據(jù)地理分布和遺傳關(guān)系，中國(guó)家養(yǎng)綿羊可劃分為三大系譜：藏系綿羊、蒙古系綿羊、哈薩克系綿羊[1]。其中蒙古系綿羊是由中亞山脈地區(qū)的野生原羊演化而來(lái)，同羊、小尾寒羊、湖羊、灘羊等品種是其亞種。本研究所選5個(gè)地方綿羊種群均有蒙古羊血統(tǒng)，其中河北小尾寒羊無(wú)論從外貌特征還是生產(chǎn)性能方面均不同于山東小尾寒羊，而與洼地綿羊較為相似，故將其作為獨(dú)立種群進(jìn)行分析，從分子方面證實(shí)其起源及歸屬問(wèn)題。

圖3 五個(gè)綿羊群體mtDNA D-loop區(qū)NJ樹(shù)Fig.3 NJ tree of mtDNA D-loop in five sheep population

圖4 五個(gè)綿羊群體mtDNA D-loop區(qū)ME樹(shù)Fig.4 ME tree of mtDNA D-loop in five sheep population

圖5 五個(gè)綿羊群體mtDNA D-loop區(qū)UPGMA聚類(lèi)圖Fig.5 UPGMA cluster of mtDNA D-loop in five sheep population

圖6 五個(gè)綿羊群體mtDNA D-loop單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 The haplotypes network of mtDNA D-loop in five sheep population

mtDNA結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且穩(wěn)定，嚴(yán)格遵守母系遺傳，并在世代傳遞中沒(méi)有重組，因此，可以用于探討綿羊的起源進(jìn)化，分析綿羊群體的遺傳多樣性。本研究分別對(duì)河北小尾寒羊、山東小尾寒羊、洼地綿羊、湖羊、蘇尼特羊等5個(gè)種群的線(xiàn)粒體DNA D-loop區(qū)序列分析，序列長(zhǎng)度在1 106～1 242 bp，長(zhǎng)度差異的主要原因是75 bp串聯(lián)重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)不同，少數(shù)為插入和缺失引起的變異，與Hiendleder[18]的研究一致。mtDNA D-loop區(qū)AT含量總和高于CG含量總和(62.8%>37.2%)，表現(xiàn)出明顯的AT偏移性，這與脊椎動(dòng)物mtDNA D-loop 區(qū)堿基組成的特點(diǎn)相符合。單倍型多樣度(Hd)和核苷酸多樣度(Pi)是衡量一個(gè)群體mtDNA遺傳分化和遺傳多樣性的2個(gè)重要指標(biāo)，結(jié)果值越大，群體的遺傳多樣性越豐富，反之則越貧乏。其中單倍型多樣度反映的是群體變異的程度，即群體的多樣性，而核苷酸多樣度是序列內(nèi)核苷酸變異的程度，即個(gè)體堿基突變的多樣性。本研究對(duì)5個(gè)綿羊群體131只個(gè)體的mtDNA D-loop區(qū)全序列包含135個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，108種單倍型，單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.995 0和0.021 89，這表明遺傳多樣性豐富，這與韓旭等[19]的研究結(jié)果一致，其中蘇尼特羊單倍型多樣性和核苷酸多樣性低于其他種群，說(shuō)明本研究中蘇尼特羊群體遺傳多樣性貧乏。

種間遺傳距離表明不同種群之間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，種內(nèi)遺傳距離一定程度上反映了該種群自身的遺傳多樣性。通過(guò)mtDNA D-loop區(qū)遺傳距離分析，結(jié)果表明，山東小尾寒羊和蘇尼特羊之間的遺傳距離最近，這與山東小尾寒羊的起源有關(guān)。洼地綿羊和蘇尼特羊之間的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)，這與婁淵根等[20]利用微衛(wèi)星分析DNA遺傳多樣性的研究結(jié)果一致。從體型外貌來(lái)看，蒙古羊體型較大，公羊有螺旋形大角，尾巴較小，尾尖卷曲呈S形，而洼地綿羊體型適中，公母均無(wú)角，尾巴肥厚，呈方圓形，尾寬大于尾長(zhǎng)。來(lái)自中亞的脂尾綿羊被移民中的回民帶到了濱州[21]，與元朝留下的蒙古羊雜交后，逐漸形成了洼地綿羊種群。因此，洼地綿羊具有蒙古羊和中亞脂尾綿羊血統(tǒng)。洼地綿羊與河北小尾寒羊遺傳距離很近，從地理位置上來(lái)看，洼地綿羊主要產(chǎn)區(qū)位于山東省濱州，與河北小尾寒羊的主要產(chǎn)區(qū)河北省黑龍港流域相臨。2種綿羊的體型外貌特征及生產(chǎn)性能等各方面均比較相似，可能兩者因距離較近而有一定的基因交流；經(jīng)歷史考證，湖羊?qū)儆诿晒叛蛳到y(tǒng)[22]，湖羊的湖最初是胡服的胡，這可能是由“胡人、胡馬”等引申而來(lái)，后來(lái)才改寫(xiě)成現(xiàn)在的湖，這也證明了湖羊來(lái)源于蒙古羊；D-loop種內(nèi)遺傳距離分析表明，蘇尼特羊種內(nèi)遺傳距離較近，說(shuō)明了蘇尼特羊的種內(nèi)遺傳多樣性相對(duì)貧乏。

通過(guò)構(gòu)建聚類(lèi)圖，在mtDNA D-loop區(qū)NJ、ME樹(shù)以及UPGMA圖中，均表明阿勒泰羊和山東大尾寒羊均與支系C聚在一起，說(shuō)明該支系與ALT和SDW有基因交流。TAN與支系A(chǔ)聚在一起。除支系C中不存在河北小尾寒羊個(gè)體外，其余各種群均在3個(gè)支系中有分布，表明各個(gè)種群之間有一定的基因交流，綿羊種群個(gè)體之間的堿基差異不明顯，不足以完全區(qū)分開(kāi)不同種群個(gè)體，這可能與歷史的遷移和畜禽流動(dòng)有關(guān)。

河北小尾寒羊、山東小尾寒羊、蘇尼特羊、湖羊、洼地綿羊遺傳多樣性較為豐富，河北小尾寒羊與山東小尾寒羊存在一定遺傳差異，而與洼地綿羊更為接近。

致謝：感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所儲(chǔ)明星團(tuán)隊(duì)提供的蘇尼特羊血液樣品，感謝中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所向海博士后在數(shù)據(jù)分析中給予的幫助。

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