滑留帥，王 璟，白 杰，朱肖亭，陳付英，于 翔，楚秋霞，辛?xí)粤?，徐照學(xué)，趙洪昌，王二耀

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實驗室，河南 鄭州 450002)

隨著動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，轉(zhuǎn)基因動物在家畜改良、醫(yī)藥衛(wèi)生、生物制藥等方面均具有廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。慢病毒載體作為一類來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體，能夠?qū)⒛康幕蛘系剿拗骷?xì)胞染色體中，長期穩(wěn)定表達(dá)外源基因，同時其具備轉(zhuǎn)染效率高、可感染分裂期和非分裂期細(xì)胞、容納外源性基因片段大等優(yōu)點(diǎn)，是制備轉(zhuǎn)基因動物的一種高效工具[3-4]。

脂肪酸結(jié)合蛋白4(Fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4)是脂肪酸結(jié)合蛋白超家族的一員，能夠促進(jìn)脂肪酸的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)控脂類生成及降解，從而對于畜禽肉品的嫩度和肌內(nèi)脂肪含量具有重要的調(diào)控作用[5-6]。FABP4基因中的多個單核苷酸多態(tài)性(SNPs)被證明與家畜的肌內(nèi)脂肪含量和肉質(zhì)顯著相關(guān)[7-8]。在肌肉來源的干細(xì)胞中(MDSCs)異位表達(dá)FABP4，能夠誘導(dǎo)MDSCs向類脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化[9]。利用體細(xì)胞核移植獲得FABP4轉(zhuǎn)基因牛，目前健康狀況良好，外源性FABP4基因在體內(nèi)能夠正常表達(dá)，且轉(zhuǎn)基因牛FABP4表達(dá)量較野生型大幅升高，說明動物活體內(nèi)過表達(dá)FABP4未發(fā)現(xiàn)明顯的有害作用[5]。這些相關(guān)的研究證據(jù)均證明，F(xiàn)ABP4基因可以作為轉(zhuǎn)基因動物研究的重要候選基因，用于高效改良畜禽的肉品品質(zhì)。

小尾寒羊是在黃淮平原農(nóng)區(qū)特定的生態(tài)條件下，經(jīng)過自然選擇和培育形成的肉、裘兼用品種，具有生長發(fā)育快、早熟、繁殖能力強(qiáng)、遺傳性能穩(wěn)定、適應(yīng)性強(qiáng)，被定為名畜良種，并被列入了《國家畜禽遺傳資源保護(hù)目錄》[10]。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備FABP4轉(zhuǎn)基因小尾寒羊?qū)τ谛∥埠蛭磥淼钠贩N保護(hù)、開發(fā)與利用具有重要的意義。

本研究擬通過制備小尾寒羊原代成纖維細(xì)胞、構(gòu)建FABP4基因慢病毒表達(dá)載體，進(jìn)而制備穩(wěn)定表達(dá)FABP4基因的小尾寒羊成纖維細(xì)胞系，旨在為轉(zhuǎn)基因羊育種以及細(xì)胞水平分析FABP4基因的功能提供材料。

1 材料和方法

1.1 小尾寒羊耳緣組織原代成纖維細(xì)胞的制備

1.1.1 小尾寒羊耳緣組織樣品的采集 試驗動物在河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地養(yǎng)殖，耳緣組織樣品采集方法為：①用肥皂水和生理鹽水徹底清洗采樣部位；②用手術(shù)刀片將采樣部位的毛刮掉，使耳緣組織裸露；③分別使用碘酊棉球和酒精棉球?qū)Σ蓸硬课幌?；④使用耳缺鉗或剪刀將采樣部位取下，迅速放入PBS溶液中清洗血污；⑤將組織塊轉(zhuǎn)入75%的乙醇中浸泡20 s；⑥轉(zhuǎn)入含青鏈霉素的PBS溶液中清洗3遍；⑦將組織塊轉(zhuǎn)入含青鏈霉素的1×DMEM培養(yǎng)基中，室溫下6 h內(nèi)帶入實驗室。

1.1.2 應(yīng)用組織塊法培養(yǎng)小尾寒羊原代成纖維細(xì)胞 將組織樣品帶入實驗室后，原代成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)方法為：①首先使用手術(shù)刀片對組織樣品進(jìn)行修剪，去除殘留的毛和血污；②將組織塊在75%的乙醇中浸泡20 s；③用含青鏈霉素的PBS溶液清洗3次；④將組織塊轉(zhuǎn)入2 mL EP管中，用眼科剪將組織塊剪成小于1 mm3的小組織塊，剪時加入1/2組織塊體積的高血清培養(yǎng)基(1×DMEM，20%的血清，1×青鏈霉素)；⑤將剪碎的組織塊均勻貼在60 mm或100 mm的培養(yǎng)皿中；⑥37 ℃、5% CO2培養(yǎng)4 h；⑦加入適量的高血清培養(yǎng)基；⑧每48 h換液一次，直至細(xì)胞在組織塊周圍匯合形成單層。

1.1.3 傳代與凍存 待培養(yǎng)皿內(nèi)的原代細(xì)胞形成單層時，用胰蛋白酶溶液(0.05% Trypsin-EDTA，Gibco：25300-054)將成纖維細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。避免消化時間過長，否則可能會將貼壁更牢的上皮細(xì)胞同時消化下來，造成污染。傳代后的培養(yǎng)條件為：完全培養(yǎng)基(1×DMEM，10%的血清，1×青鏈霉素)、37 ℃、5% CO2。等傳代后的細(xì)胞生長至80%匯合度，及時進(jìn)行凍存，凍存液的配方為：40% DMEM培養(yǎng)基、10% DMSO和50%的血清。

1.2 過表達(dá)FABP4基因慢病毒載體的構(gòu)建

1.2.1 羊FABP4基因的克隆 使用全基因合成的方法獲得綿羊FABP4基因的CDS全長，參考序列為NCBI：NM_001114667。序列合成時在翻譯起始位點(diǎn)(ATG)上游添加了Kozak序列和限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)EcoRⅠ，添加的序列為：5′-CCGGAATTCC

1.2.2 慢病毒載體的構(gòu)建 使用的慢病毒載體為PEB-GP(輝駿生物，廣州)，載體的主要結(jié)構(gòu)為：CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro。首先分別使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切目的基因質(zhì)粒puc57-FABP4和慢病毒載體PEB-GP，膠回收純化后使用T4連接酶將FABP4基因片段和PEB-GP片段連接為PEB-GP-FABP4，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆后測序，測序引物為，CMV-F：5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′。

1.2.3 慢病毒的包裝 首先在完全培養(yǎng)基(1×DMEM，10% FBS，1×青鏈霉素)中將293T細(xì)胞培養(yǎng)至80%匯合度。然后用轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000(Invitrogen，11668-027)將包裝質(zhì)粒(pLP1、pLP2、pLP/VSVG)與表達(dá)質(zhì)粒(PEB-GP-FABP4)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前2 h換液為無抗性培養(yǎng)基(1×DMEM，10% FBS)；轉(zhuǎn)染時質(zhì)粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG和PEB-GP-FABP4的使用量為每100 mm培養(yǎng)皿分別添加6.5，3.5，3.5，12.0 μg；轉(zhuǎn)染4～6 h后換液為低血清培養(yǎng)基(1×DMEM，2% FBS，1×青鏈霉素)；轉(zhuǎn)染48，72 h后分別收集上清，3 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清用0.45 μm微孔濾器過濾后-80 ℃保存。

1.2.4 慢病毒滴度測定 采用逐孔稀釋法測定慢病毒的滴度，步驟為：①滴度測定前1 d，將293T細(xì)胞接種至96孔板中，每孔的細(xì)胞數(shù)目約為1.0×104個，培養(yǎng)基體積為100 μL。②取10個無菌的EP管，每管加入90 μL新鮮的完全培養(yǎng)基，之后取10 μL病毒原液加入第一個EP管中，混勻后從中吸取10 μL加入第二個EP管中；以此類推，將病毒原液依次地進(jìn)行10倍稀釋。③每個細(xì)胞培養(yǎng)孔小心吸去10 μL培養(yǎng)基(共10個孔)，之后分別加入稀釋好的病毒液10 μL，其中第一孔相當(dāng)于添加了病毒原液1 μL。④將接種好病毒的細(xì)胞培養(yǎng)板放回37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，48 h后，每孔分別加入新鮮培養(yǎng)基100 μL。⑤96 h后觀察熒光表達(dá)情況，數(shù)出最后2個含有熒光細(xì)胞的孔中的熒光細(xì)胞個數(shù)；病毒原液的滴度值=熒光細(xì)胞個數(shù)/稀釋后的病毒量。若第6個孔的發(fā)光個數(shù)為3個，則病毒液的滴度為3×103/10-5=3×108(TU/mL)。

1.3 慢病毒介導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)FABP4基因的小尾寒羊成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建

1.3.1 慢病毒感染細(xì)胞 在6孔板內(nèi)接種小尾寒羊原代成纖維細(xì)胞，待細(xì)胞生長至50%匯合度時，進(jìn)行慢病毒感染。操作步驟：①冰浴解凍慢病毒；②用無血清培養(yǎng)基1∶1稀釋病毒液；③去除6孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，加入稀釋過的病毒液，同時在培養(yǎng)基中加入8 μg/mL的Ploybrene；④在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后，更換為完全培養(yǎng)基；⑤在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光并檢測感染效率。

1.3.2 嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞 操作步驟：①慢病毒感染細(xì)胞48 h后，更換為新的培養(yǎng)基，同時在培養(yǎng)基中添加5 μg/mL的嘌呤霉素；②每48 h更換新的添加抗生素的培養(yǎng)基，直至細(xì)胞不再大量死亡，且在熒光顯微鏡下所有細(xì)胞均能觀察到綠色熒光；③然后更換為含1 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大培養(yǎng)后的細(xì)胞系在液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 利用Western Blot鑒定FABP4基因的表達(dá)水平 操作步驟：①制備樣品。復(fù)蘇細(xì)胞，等細(xì)胞生長至80%匯合度時，收獲細(xì)胞，使用RIPA裂解液和PMSF裂解細(xì)胞，然后使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品中的蛋白濃度，并調(diào)整試驗樣品和對照組為同一濃度。②電泳。制備10%的SDS-PAGE分離樣品。③轉(zhuǎn)膜。電泳結(jié)束后，將凝膠從玻璃板中取出，然后按照轉(zhuǎn)膜儀操作要求，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。④封閉。取出蛋白膜置于封閉液中，在37 ℃ 260 r/min，封閉1 h。⑤一抗孵育。將封閉過的蛋白膜置于稀釋過的一抗中(兔源FABP4一抗：生工D220618；鼠源GAPDH一抗：生工D190090)，在37 ℃ 260 r/min，孵育1 h。⑥二抗孵育。將一抗孵育過的蛋白膜置于稀釋過的二抗中(HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG：生工D110058；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG：生工D110087)，在37 ℃ 260 r/min，孵育1 h。⑦顯影。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天P0018)進(jìn)行顯影，然后使用成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 小尾寒羊原代成纖維細(xì)胞系的制備

組織塊在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，能夠觀察到零星的細(xì)胞從組織塊周圍游出，第4天后在大部分組織塊周圍均能夠觀察到細(xì)胞簇存在，細(xì)胞呈長梭形，立體感強(qiáng)(圖1-A)。繼續(xù)培養(yǎng)4 d后，成纖維細(xì)胞可圍繞組織塊形成單層。用胰蛋白酶在37 ℃消化5 min后，能夠觀察到成纖維細(xì)胞縮成圓形并成片脫落，但上皮細(xì)胞仍然繼續(xù)貼壁(圖1-B)，因此，根據(jù)成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞對胰蛋白酶敏感性的差異，消化時及時收獲細(xì)胞能夠?qū)⒊衫w維細(xì)胞進(jìn)行分離純化。收獲的細(xì)胞繼續(xù)傳代2～3次后，得到了較純的小尾寒羊原代成纖維細(xì)胞(圖1-C)。

2.2 綿羊FABP4基因的克隆及慢病毒載體的構(gòu)建

利用全基因合成方法獲得了綿羊FABP4基因的CDS區(qū)全長片段，合成后的片段被克隆至puc57質(zhì)粒，對puc57-FABP4質(zhì)粒進(jìn)行測序表明，合成的序列與模板序列完全一致，沒有突變，F(xiàn)ABP4基因CDS區(qū)全長為399 bp，編碼132個氨基酸。

用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ分別雙酶切質(zhì)粒puc57-FABP4和慢病毒質(zhì)粒PEB-GP后，通過膠回收和T4連接酶連接，將FABP4基因片段亞克隆至PEB-GP中，成功構(gòu)建了慢病毒載體PEB-GP-FABP4，對載體的雙酶切鑒定圖譜見圖2。同時對質(zhì)粒PEB-GP-FABP4進(jìn)行測序表明，亞克隆過程沒有發(fā)生序列變異。

A.組織塊培養(yǎng)4 d；B.胰蛋白酶消化原代細(xì)胞；C.傳代后的原代細(xì)胞。A.Tissue culture for 4 days； B.Digestion of the primary fibroblasts by trypsin； C.Primary fibroblasts after passage.

使用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切后質(zhì)粒呈現(xiàn)2條帶，其中8 200 bp的條帶為慢病毒質(zhì)粒骨架，412 bp的條帶為FABP4基因片段。

The vector displays two bands after digestion byEcoRⅠ andBamHⅠ，in which the band of 8 200 bp is the backbone of the lentiviral vector，while the band of 412 bp is theFABP4 fragment.

圖2慢病毒載體PEB-GP-FABP4的雙酶切鑒定
Fig.2VerificationofthelentiviralvectorPEB-GP-FABP4bydoubleenzymedigestion

2.3 獲得了高滴度的FABP4過表達(dá)慢病毒

將慢病毒載體PEB-GP-FABP4和包裝質(zhì)粒(pLP1、pLP2、pLP/VSVG)用轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，分別在48，72 h收集了上清液，離心和過濾后進(jìn)行了慢病毒滴度測定。測定結(jié)果表明，當(dāng)在96孔板中添加病毒原液量為10-4μL時，觀測不到熒光。當(dāng)添加量為10-3μL，能夠觀測到熒光，說明獲得慢病毒的滴度為1×106TU/mL以上(圖3)。

2.4 穩(wěn)定表達(dá)FABP4的小尾寒羊成纖維細(xì)胞系的制備

用制備的慢病毒感染小尾寒羊原代成纖維細(xì)胞48 h后，觀察熒光表明，大約70%以上的細(xì)胞能夠觀察到綠色熒光，說明制備的慢病毒對小尾寒羊原代成纖維細(xì)胞具有較高的感染效率(圖4-A1、A2)。在培養(yǎng)基中添加5 μg/mL的嘌呤霉素后，24 h能夠觀察到部分細(xì)胞死亡，繼續(xù)加藥篩選48 h后，細(xì)胞狀態(tài)趨于穩(wěn)定，不再觀察到大量的細(xì)胞死亡現(xiàn)象。用含1 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)并傳代2次后，在熒光顯微鏡下所有的細(xì)胞均能觀察到綠色熒光(圖4-B1、B2)。利用Western Blot檢測了細(xì)胞中FABP4蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果表明，在對照組幾乎檢測不到FABP4的表達(dá)，而在病毒感染組則能夠清晰的觀察到FABP4蛋白的表達(dá)，說明成功獲得了穩(wěn)定表達(dá)FABP4的小尾寒羊成纖維細(xì)胞系(圖4-C1、C2)。

第1行和第2行分別是添加不同量的病毒液后，96 h時觀察的熒光照片和白場照片。The first row and the second row displays the fluorescent and white field photograph 96 hours after infected by different amounts of viral fluid，respectively.

A1、A2.慢病毒感染小尾寒羊成纖維細(xì)胞系48 h后的熒光表達(dá)和白場照片(×40)；B1、B2.用嘌呤霉素篩選后的熒光表達(dá)和白場照片(×40)；C1.應(yīng)用Western Blot鑒定對照組和病毒感染組中FABP4蛋白的表達(dá)情況；C2.內(nèi)參基因GAPDH在對照組和病毒感染組中的表達(dá)情況。

A1，A2.The fluorescent and white field photograph of the fibroblasts 48 hours after infected by lentivirus (×40)； B1，B2.The fluorescent and white field photograph of the fibroblasts purified by puromycin(×40)； C1.Expression identification of the FABP4 in the virus infection group and the control group by Western Blot.C2.The expression of theGAPDHin the virus infection group and the control group.

圖4慢病毒介導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)FABP4基因的小尾寒羊成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建與鑒定
Fig.4ConstructionandidentificationofthestablyexpressingFABP4fibroblastsfromtheSmall-tailedHansheep

3 討論與結(jié)論

隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展，生產(chǎn)水平不斷提高，肉類生產(chǎn)數(shù)量的也在不斷提高，肉類的研究更加注重肉質(zhì)的改善。家畜肉品質(zhì)評價指標(biāo)主要有：大理石花紋、色澤、嫩度、多汁性、風(fēng)味、系水力、pH值等。其中，大部分評價指標(biāo)均與脂肪組織的生長發(fā)育相關(guān)。提高肉品質(zhì)中肌內(nèi)脂肪含量，對于提高肉品質(zhì)具有重要的作用[11-12]。FABP4是一類分子質(zhì)量較小、對脂肪酸有高親和力的可溶性蛋白質(zhì)，是細(xì)胞內(nèi)重要的脂肪酸載體蛋白，廣泛參與脂肪酸的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝。FABP4主要在動物脂肪組織中高表達(dá)，被認(rèn)為與家畜大理石花紋、脂肪沉積、胴體重量以及牛肉風(fēng)味、脂肪酸組成等性狀密切相關(guān)[13-15]。本研究選擇FABP4作為候選基因，預(yù)期能夠提高未來轉(zhuǎn)基因綿羊的肌內(nèi)脂肪含量，從而提高肉品品質(zhì)。同時本研究選擇了全基因合成的方法來克隆綿羊的FABP4基因，通過基因合成后測序、慢病毒載體構(gòu)建后測序以及Western Blot分析，均證明克隆的序列是正確的，且在細(xì)胞內(nèi)能夠正確表達(dá)。提示除了傳統(tǒng)的RT-PCR或Overlap-PCR[16]，全基因合成為便捷的獲得一些序列確定的基因提供了新的選擇。

小尾寒羊是我國優(yōu)良的地方綿羊品種，生產(chǎn)性能優(yōu)越、適應(yīng)性強(qiáng)，因此在國內(nèi)被廣泛引種和推廣[10]。本研究利用組織塊培養(yǎng)法制備了小尾寒羊的原代成纖維細(xì)胞，為小尾寒羊未來的種質(zhì)資源保護(hù)和種質(zhì)創(chuàng)新提供了素材。通常原代細(xì)胞培養(yǎng)法主要有2種：消化培養(yǎng)法和組織塊培養(yǎng)法。其中，消化培養(yǎng)法能夠把組織塊直接分散為細(xì)胞團(tuán)或單個細(xì)胞，從而大大縮短細(xì)胞的潛伏生長期，獲得原代細(xì)胞的周期較短，但是其操作步驟繁瑣，容易造成污染；組織塊培養(yǎng)法細(xì)胞生長速度雖然較慢，但是操作便捷，且成功率高，適用于大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)[17]。通過采用本研究中的組織塊培養(yǎng)方法，河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動物繁殖生物工程研究團(tuán)隊已經(jīng)成功制備50多個包括牛、羊、豬、驢等物種的細(xì)胞系，從而對其他物種細(xì)胞系構(gòu)建工作具有參考價值。

隨著基因編輯技術(shù)的不斷進(jìn)步，轉(zhuǎn)基因動物的制備方法也越來越多樣。尤其是近年來CRISPR Cas9技術(shù)在轉(zhuǎn)基因研究中的廣泛應(yīng)用，有取代其余技術(shù)的趨勢[18]。但是慢病毒作為一種傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，仍然有一些獨(dú)特的優(yōu)勢。首先，慢病毒具有主動整合目的基因進(jìn)入宿主基因組的特性，因此能夠高效感染多種細(xì)胞類型，尤其是在原代細(xì)胞操作和基因治療時有明顯的優(yōu)勢。其次，制備好的慢病毒載體具有通用性，其不僅能夠感染細(xì)胞、胚胎等不同的細(xì)胞類型，還能夠感染不同的物種，對于跨物種研究具有優(yōu)勢。同時，慢病毒操作成熟、簡單，目前的慢病毒制備技術(shù)已經(jīng)非常穩(wěn)定，對于快速開展細(xì)胞水平以及轉(zhuǎn)基因動物水平上功能驗證仍然是一個高效的工具[3-19]。本研究成功包裝了過表達(dá)FABP4的慢病毒，直接包裝獲得的慢病毒滴度為1×106TU/mL，與其他研究的滴度水平相一致[20-21]。高滴度的病毒顆粒對于下游應(yīng)用時提高感染效率具有重要的意義，因此，在慢病毒包裝時，需要對細(xì)胞狀態(tài)、質(zhì)粒比例、病毒收獲時間進(jìn)行優(yōu)化，以盡量提高病毒的滴度。如果需要更高的病毒滴度，如對受精卵注射等操作時也可以采用對慢病毒進(jìn)行濃縮處理。但由于慢病毒在包裝及感染過程中具有潛在的生物安全問題，操作必須嚴(yán)格規(guī)范，所用物品及廢液都要經(jīng)過滅活處理。使用重組FABP4基因慢病毒感染小尾寒羊成纖維細(xì)胞后，應(yīng)用Western Blot分析發(fā)現(xiàn)，在對照組幾乎檢測不到FABP4蛋白的表達(dá)，而在病毒感染組則能夠清晰的觀察到FABP4蛋白的表達(dá)，說明成功制備了穩(wěn)定表達(dá)FABP4的小尾寒羊成纖維細(xì)胞系，從而為小尾寒羊未來的種質(zhì)創(chuàng)新提供了素材。

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