朱春紅，劉宏祥，陶志云，徐文娟，宋衛(wèi)濤，章雙杰，李慧芳

(江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225125)

機(jī)體免疫器官的發(fā)育狀況直接反映出機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，家禽免疫器官(法氏囊、脾臟、胸腺等)的重量發(fā)育是評價家禽免疫力影響的重要指標(biāo)[1]。脾臟作為重要的淋巴器官，也是機(jī)體最大的外周免疫器官，是產(chǎn)生致敏淋巴細(xì)胞和抗體的場所之一，同時具有造血、濾血、清除衰老細(xì)胞和微生物等功能。法氏囊是禽類特有的免疫器官，在70～80日齡時體積最大，以后逐漸消退，性成熟時消失。鴨胸腺有6～7葉，分布于頸靜脈，多葉排列，成年后萎縮退化。家禽免疫器官發(fā)育不良，或者其他原因?qū)е旅庖咭种?，家禽免疫抑制會增?qiáng)機(jī)體對病毒、細(xì)菌以及寄生蟲的易感性，對各種接種疫苗的反應(yīng)能力下降，造成養(yǎng)殖業(yè)的巨大損失[2-3]。

TLRs是一類胚系編碼的模式識別受體，通過識別病原微生物特有的分子，從而識別入侵的微生物，在機(jī)體固有免疫中發(fā)揮重要作用[4-7]。目前，在小鼠中發(fā)現(xiàn)的TLRs有12種，人類有10種[8]。家禽TLRs研究進(jìn)展落后，禽類TLRs的研究基本集中于雞上，鴨種中的研究僅近幾年有增長趨勢。禽類中，在雞中發(fā)現(xiàn)的有10種，分別為TLR1La、TLR1Lb、TLR2A、TLR2B、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15、TLR21[9-10]，在鴨中發(fā)現(xiàn)的為9種，包括TLR1A、TLR1B、TLR2A、TLR2B[11]、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15[12]，未發(fā)現(xiàn)TLR21。其中TLR1、TLR2、TLR4、TLR5主要識別細(xì)菌[13]，TLR3和TLR7主要識別病毒，TLR15和TLR21既可識別病毒又可識別細(xì)菌[14]。Muzio等[15]對TLRs在人類白細(xì)胞中表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，TLR1能在包括單核細(xì)胞、多形核細(xì)胞、T、B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)，TLR2、TLR4、TLR5只在髓源性細(xì)胞(如單核巨噬細(xì)胞)上表達(dá)，而TLR3只特異性表達(dá)于樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DC)。在對抗外來物質(zhì)入侵的過程中，天然免疫發(fā)揮的作用顯得尤為重要，被看作是機(jī)體的第一道防線，TLRs是其中重要一員；不同的TLRs，在不同組織部位的表達(dá)，可能發(fā)揮不同的功能，但其在發(fā)育進(jìn)程中，在水禽中樞器官和外周免疫器官中的表達(dá)分析目前仍無研究報道，本研究對高郵鴨免疫器官發(fā)育進(jìn)行測量，分析TLRsmRNA在高郵鴨免疫器官發(fā)育進(jìn)程中的表達(dá)模式，可以為TLRs在鴨先天免疫和抗感染中的作用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

2×PCR mix、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、DNA純化試劑盒、TRNzol-A+總RNA提取試劑、Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒、SYBR Green SuperRealPreMix試劑盒購自天根生物科技(北京)有限公司，DNA Marker DL2000購自TaKaRa生物有限公司,瓊脂糖和DEPC購自Promega生物有限公司。

組織勻漿機(jī)為瑞士Kinematica PT1200E，高速冷凍離心機(jī)為Eppendorf 5417R,生物分光光度計(jì)為Eppendorf AG 22331Hamburg,PCR儀為Eppendorf mastercycler，紫外分光光度計(jì)為Pharmacia GeneQuant Ⅱ，凝膠成像系統(tǒng)為Tanon 3500R產(chǎn)品，熒光定量分析采用Stratagene公司的Mx3000P型PCR儀。

1.2 試驗(yàn)動物

120只雛鴨(購自江蘇高郵鴨集團(tuán))國家標(biāo)準(zhǔn)正常飼養(yǎng)至1，2，4，6，8周齡，在不同周齡隨機(jī)選取24個個體(公母各半)，個體稱重后解剖，采集免疫器官：脾臟、胸腺、法氏囊，剔除脂肪準(zhǔn)確稱量，記錄絕對質(zhì)量(濕重量)后，立即放入-80 ℃保存待用。

1.3 引物設(shè)計(jì)

參考GenBank收錄的鴨TLRsmRNA基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見表1。

表1 PCR用引物Tab.1 Primers used for the PCR

1.4 RNA的提取，反轉(zhuǎn)錄

將采集的組織樣品分別稱取30 mg左右，置于含1 mL TRNzol的2 mL離心管中，用小剪刀剪碎，組織勻漿機(jī)勻漿，按照TRNzol-A+試劑說明書提取總RNA，總RNA置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)FastKing RT kit(with gDNase)(KR116) 第一鏈cDNA合成試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄分兩步進(jìn)行，第一步先去除gDNA，反應(yīng)體系為：5×gDNA Buffer 2 μL，總RNA 1 μg，加水補(bǔ)足到10 μL，混勻后簡短離心，置于42 ℃，孵育3 min，置于冰上放置。第二步即反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為：10×King RT Buffer 2 μL，F(xiàn)astKing RT Enzyme Mix 1 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μL，Rnase-Free ddH2O 補(bǔ)足至10 μL，然后將此混合液加入到gDNA去除步驟的反應(yīng)液中，充分混勻，42 ℃孵育15 min；95 ℃孵育3 min后放于冰上，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 基因TLRs及β-actin mRNA擴(kuò)增及測序

PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，其中2×PCR mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA產(chǎn)物1 μL, ddH2O 補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。檢測為單一條帶并在相應(yīng)的片段區(qū)間內(nèi)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收和純化后送上海生工生物科技有限公司測序。測序結(jié)果用在線BlastN軟件與相應(yīng)的基因序列進(jìn)行比對。

1.6 高郵鴨TLRs mRNA及β-actin熒光定量PCR擴(kuò)增

將采集的樣品進(jìn)行RNA提取和反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，每個樣品吸取1 μL制成mix樣品，然后將mix樣品進(jìn)行2倍梯度稀釋制成標(biāo)準(zhǔn)樣品，以此為模板熒光定量PCR擴(kuò)增相應(yīng)的鴨TLRs和β-actin基因，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系為：SYBR Premix(2×)10 μL，上下游引物(10 μmol/L) 0.8 μL,50×ROX 0.4 μL，cDNA模板2 μL,ddH2O補(bǔ)足至20 μL。實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃變性5 min；95 ℃變性25 s，60 ℃復(fù)性25 s，72 ℃延伸25 s，40個循環(huán)；95 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性30 s，95 ℃延伸30 s，收集溶解曲線。

1.7 數(shù)據(jù)分析

熒光定量試驗(yàn)結(jié)果采用相對比較2-ΔΔCt法分析，首先計(jì)算出各樣品目的基因與內(nèi)參基因的Ct差值(ΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt內(nèi)參基因)，分別選取表達(dá)量最低的組織為對照，以其他組織Ct差值減去對照Ct差值，即為ΔΔCt，即ΔΔCt=(ΔCt目的基因-ΔCt內(nèi)參基因)試驗(yàn)組-(ΔCt目的基因-ΔCt內(nèi)參基因)對照組。數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 高郵鴨體重和免疫器官的發(fā)育及其相關(guān)性分析

高郵鴨體重發(fā)育和品種志中該品種性能觀測記錄值相當(dāng)，不同周齡間的體重變化表現(xiàn)出顯著差異，說明本試驗(yàn)群體在試驗(yàn)周期內(nèi)表現(xiàn)為正常飼養(yǎng)狀態(tài)。胸腺發(fā)育在前4周育雛期內(nèi)，有緩慢增重表現(xiàn)，但未表現(xiàn)出顯著差異，隨后發(fā)育明顯，6周齡，8周齡時展示出顯著的增重變化(P<0.05)；脾臟發(fā)育在1周齡和2周齡時表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)，本次測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)脾臟在2周齡和4周齡之間增重緩慢，6周齡和8周齡之間增重也未有顯著性差異。脾臟增重和法氏囊的增重結(jié)果在8周齡內(nèi)表現(xiàn)一致，詳細(xì)結(jié)果見表2。

表2 高郵鴨8周齡內(nèi)體重和免疫器官發(fā)育變化Tab.2 Development changes of body weight and immune tissues in Gaoyou duck g

注：不同小寫字母表示顯著水平差異(P<0.05)。表4同。

Note： Different lowercases indicate significant difference inP<0.05 level. The same as Tab.4.

體重和各免疫臟器重相關(guān)性結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體重和免疫器官重相關(guān)性較高，和脾臟、胸腺的相關(guān)系數(shù)為0.92，和法氏囊的相關(guān)性最小，為0.76；免疫器官發(fā)育之間的相關(guān)性較小，脾臟與法氏囊和胸腺發(fā)育的相關(guān)指數(shù)分別為0.71，0.89，法氏囊和胸腺重發(fā)育的相關(guān)指數(shù)最小，為0.64。詳細(xì)結(jié)果見表3。

2.2 鴨TLRs基因片段的PCR擴(kuò)增，實(shí)時熒光定量PCR產(chǎn)物特異性，標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

對所提取的組織總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，分別得到與預(yù)期大小相符的單一擴(kuò)增條帶，將所擴(kuò)增的鴨TLRs基因片段純化后測序，BlastN比對相應(yīng)的目的基因，證實(shí)為對應(yīng)的TLR1/2/4/5基因。

表3 高郵鴨體重和免疫器官重的發(fā)育相關(guān)系分析Tab.3 Correlation of body weight and immune tissue weights in Gaoyou duck

經(jīng)溶解曲線分析，高郵鴨TLR1/2/4/5和內(nèi)參基因β-actin的溶解曲線均呈單峰，無引物二聚體或其他雜峰。TLR1/2/4/5和β-actin的溶解溫度分別為81.0，88.0，85.0，82.5，87.5 ℃。

以梯度稀釋后的樣品為模板進(jìn)行鴨TLR1/2/4/5和內(nèi)參基因β-actin熒光定量PCR，獲得相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，各基因的擴(kuò)增效率(Eff)分別為104.6%，102.8%，101.4%，105.0%和104.6%，相關(guān)系數(shù)(Rsq)分別為0.992，0.987，1.000，1.000和0.994。

A. TLR1; B.TLR2; C. TLR4; D. TLR5; E.β-actin。

2.3 高郵鴨TLRs基因在不同發(fā)育時期免疫組織中的相對表達(dá)量

在本研究測定的范圍內(nèi)，胸腺中TLR1/2/4/5在1周齡時的表達(dá)量較高，TLR1/4在1周齡時的表達(dá)量顯著高于其他周齡(P<0.05)；TLR1/2/4在2，4，6，8周齡時表達(dá)差異不顯著；TLR5在2周齡時表達(dá)量最低，顯著低于1周齡和8周齡(P<0.05)。脾臟組織中各基因的表達(dá)變化如表4所示，TLR1/2/5在8周齡時的表達(dá)量顯著高于其他周齡(P<0.05)，2周齡時表達(dá)量最低；TLR4在1，2周齡時表達(dá)量較高，1周齡時表達(dá)量顯著高于4，6，8周齡表達(dá)量(P<0.05)。法氏囊中各基因表達(dá)結(jié)果顯示TLR1/5在8周齡時表達(dá)水平相對較高，TLR4在1周齡時，表達(dá)水平較高，顯著高于其在4，6，8周齡時的表達(dá)水平(P<0.05)。

表4 高郵鴨不同發(fā)育時期TLRs在免疫組織中的相對表達(dá)量Tab.4 The relative expression level of TLRs during different development periods in Gaoyou duck

2.4 體重和免疫器官重與基因表達(dá)水平相關(guān)性分析

免疫器官重量發(fā)育和對應(yīng)器官中TLR1/2/4/5基因的表達(dá)量相關(guān)系數(shù)較低，除法氏囊中TLR1表達(dá)量與體重、法氏囊重相關(guān)系數(shù)分別為0.78，0.56；脾臟TLR1的表達(dá)量與體重、脾臟重變化的相關(guān)系數(shù)分別為0.75，0.73，TLR5的表達(dá)量與體重的相關(guān)系數(shù)為0.53；其他對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)值均小于0.50。具體結(jié)果如表5所示。

不同免疫器官內(nèi)TLR1/2/4/5基因表達(dá)水平的相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表6)，不同免疫組織中TLR1/2/5基因表達(dá)量之間表現(xiàn)為正相關(guān)。法氏囊中各基因的表達(dá)量兩兩之間的相關(guān)系數(shù)較??；在脾臟組織中，TLR1的表達(dá)量和TLR2以及TLR5表達(dá)量相關(guān)系數(shù)值較高，分別為：0.74，0.73，TLR2和TLR5表達(dá)量之間的相關(guān)系數(shù)為0.58；在胸腺組織中，不同TLRs基因表達(dá)量的兩兩相關(guān)系數(shù)值相對較高，不同TLRs基因兩兩之間的相關(guān)系數(shù)值均大于0.50，最高值為0.89。

表5 高郵鴨體重和免疫器官重與TLR1/2/4/5相關(guān)性分析Tab.5 The correlation analysis of expression level TLR1/2/4/5 and body weight, immune tissue weights in Gaoyou duck

表6 高郵鴨不同免疫器官內(nèi)各基因表達(dá)水平的相關(guān)性分析Tab.6 The correlation analysis of expression levels in different TLRs in Gaoyou duck

3 討論

本試驗(yàn)過程中，飼養(yǎng)群體體重發(fā)育和品種志中記錄數(shù)據(jù)一致，說明本飼養(yǎng)群體狀態(tài)良好，可以進(jìn)行發(fā)育性各項(xiàng)指標(biāo)測定。胸腺和法氏囊均表現(xiàn)為性成熟后重量開始下降，體積逐漸縮小，到成年時僅剩下痕跡，或完全消失。胸腺、法氏囊退化發(fā)生的時間與物種、性別及飼養(yǎng)方式等有關(guān)。法氏囊作為中樞免疫器官，不僅是B細(xì)胞及抗體生成的主要場所，也是大量影響其發(fā)育、功能形成及與免疫功能發(fā)育關(guān)鍵基因的聚集地，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中扮演著重要角色。本研究中免疫器官發(fā)育狀態(tài)的數(shù)據(jù)測定和相關(guān)性分析檢測，為高郵鴨生長發(fā)育狀態(tài)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

反轉(zhuǎn)錄實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、自動化程度高等特點(diǎn)，目前廣泛用于基因表達(dá)的研究。本試驗(yàn)采用該方法進(jìn)行TLR1/2/4/5基因在高郵鴨發(fā)育過程中免疫器官的表達(dá)水平分析[12]。包括β-actin在內(nèi)的5個基因其擴(kuò)增產(chǎn)物溶解溫度均呈現(xiàn)單一特異性單峰，說明本試驗(yàn)中設(shè)計(jì)的引物特異性較強(qiáng)，可以用于定量測定。Comparative Delta-delta Ct法相對定量結(jié)果分析要求，目的基因和看家基因的擴(kuò)增效率相似，越接近100%越好[16]，水禽課題組利用上述方法建立多個鴨相關(guān)基因表達(dá)模式的檢測[17-18]。TLR1/2/4/5基因與β-actin的擴(kuò)增效率在101.4%～105.0%，均接近100%，且TLR1/2/4/5基因與β-actin的熒光定量PCR反應(yīng)相關(guān)系數(shù)在0.987～1.000，說明本試驗(yàn)中建立的熒光定量PCR方法穩(wěn)定可靠。因此，可以用此方法進(jìn)行4種基因的相對定量結(jié)果分析。

關(guān)于TLRs基因在組織中的表達(dá)已有較多研究報道，例如，雞上的研究結(jié)果表明，雛雞TLR1、TLR2、TLR4、TLR5在脾臟、法氏囊、胸腺和各段腸道組織中均有轉(zhuǎn)錄，但不同臟器組織中的表達(dá)水平不一[13]。采用熒光定量PCR法對牦牛TLR2和TLR4在不同組織中的研究表明，TLR2和TLR4在所有組織中均有表達(dá)，TLR2在小腸中表達(dá)量最高，而TLR4在乳腺中表達(dá)量最高[19]。在蒙古馬中的研究表明，TLR1、TLR2、TLR4、和TLR6 4種TLRs在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、十二指腸、空腸、盲腸和骨髓中均有轉(zhuǎn)錄[20]。上述研究表明，在不同物種中各TLRs在不同組織中表達(dá)水平不一。但在物種發(fā)育進(jìn)程中的表達(dá)水平變化報道則相對較少。本研究結(jié)果表明，鴨TLR1、TLR2、TLR4、TLR5在發(fā)育中的免疫臟器中均有表達(dá)，表達(dá)模式不同。

脾臟和法氏囊中TLR1表達(dá)在8周齡時表達(dá)量最高，在前4周內(nèi)表達(dá)量則相對較低，但在胸腺中則是在1周齡時表達(dá)量最高，其他周齡點(diǎn)表達(dá)水平則差異不顯著。TLR2在法氏囊中表達(dá)水平較胸腺和脾臟中表達(dá)水平稍低，且在不同周齡中表達(dá)水平差異不顯著。 在胸腺和脾臟中分別是在1周齡和8周齡時表達(dá)量顯著高于其他周齡，總的來說在不同組織中的表達(dá)水平不一。而TLR4均表現(xiàn)為在1周齡時表達(dá)水平較高。TLR5在不同臟器中則表現(xiàn)為不同表達(dá)趨勢，胸腺中1周齡時表達(dá)量最高，而在脾臟和法氏囊中則是8周齡時表達(dá)量最高。上述這些非規(guī)律性表達(dá)變化對宿主免疫水平的影響如何，是后期研究的重點(diǎn)。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，上述基因的表達(dá)和體重以及免疫器官重的相關(guān)性不大，比較而言，脾臟中各基因的表達(dá)水平相關(guān)性系數(shù)稍高，最高為TLR2和TLR4表達(dá)水平相關(guān)系數(shù)為0.89。上述結(jié)果是否意味著脾臟中這些基因的網(wǎng)路功能更強(qiáng)。脾臟作為重要免疫器官，TLRs是在高郵鴨或者其他鴨品種中作為天然免疫的重要組成部分，在抗感染過程中起著重要作用。

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