王洪樂，齊連芬，楊超沙，吳志明，李亞棟

(1．河北省農(nóng)林科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，河北 石家莊 050051; 2.承德市農(nóng)林科學(xué)院，河北 承德 067055；3.石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院，河北 石家莊 050041)

掌葉半夏即虎掌，又名獨角蓮，隸屬天南星科半夏屬，是我國傳統(tǒng)的中藥材，主要分布在河北和長江流域及西南各地。其主要藥效成分是掌葉半夏凝集素，是一種從掌葉半夏塊莖中分離出的植物蛋白[1-2]。掌葉半夏凝集素屬于單子葉甘露糖凝集素，能夠?qū)Ｒ坏亟Y(jié)合甘露糖，具有抑菌、殺蟲、凝血、抗腫瘤等生理作用[3-6]。近年來，研究掌葉半夏蛋白對多種害蟲尤其是對同翅目類害蟲的致死作用和掌葉半夏蛋白基因的抗蟲性，已成為抗蟲植物基因工程研究的熱點[7-8]。依托經(jīng)作所生物技術(shù)中心建立的掌葉半夏凝集素基因文庫，篩選到了3個具有典型結(jié)構(gòu)域的凝集素家族基因，可能與植物對蚜蟲的抗性相關(guān)。因此，本研究克隆了這3個掌葉半夏凝集素家族基因，并構(gòu)建其原核表達(dá)載體pET-28b(+)-PPAs，并在大腸桿菌表達(dá)系E.coliBL21(DE3)中實現(xiàn)特異性表達(dá)，為進(jìn)一步研究掌葉半夏凝集素家族蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

掌葉半夏采自河北省農(nóng)林科學(xué)院藥用植物研究中心中藥材種質(zhì)資源圃，表達(dá)載體pET-28b(+)、表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3) 由河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所實驗室保存，克隆載體為pEASY-T。

限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、NdeⅠ均購自美國Fermentas公司；IPTG、卡那霉素(Kanamycin)、蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast extract)為上海生工產(chǎn)品；膠回收試劑盒、克隆載體pEASY-T及大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞均購自北京公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 掌葉半夏基因組DNA的提取 利用CTAB法，從掌葉半夏幼嫩的葉片中提取掌葉半夏基因組DNA。

1.2.2 引物設(shè)計及序列擴(kuò)增 參照基因文庫設(shè)計特異性擴(kuò)增引物(表1)。PCR 法特異擴(kuò)增基因序列，反應(yīng)條件為：94 ℃ 1 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并純化，連接到pEASY-T載體，經(jīng) PCR 鑒定后將陽性克隆送華大公司測序。

表1 引物Tab.1 Primer

1.2.3 克隆基因的生物信息學(xué)分析 利用網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行Blast分析。使用SignalP-3.1信號肽預(yù)測工具(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析基因的信號肽。利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對基因編碼的蛋白進(jìn)行跨膜域預(yù)測[9-10]。使用DNAman進(jìn)行幾種植物蛋白質(zhì)的同源性分析，采用生物軟件Mega 4.1和Clustal W2對不同植物凝集素氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)分析物中蛋白的聚類分析，并生成系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4PPA基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將pET-28b(+)和pEASY-PPA分別用XhoⅠ和NdeⅠ進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收，回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至克隆菌株DH5α感受態(tài)中，挑取長出的菌落，進(jìn)行菌液PCR鑒定，將檢測出目的條帶的菌液提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)過鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。

1.2.5 重組質(zhì)粒pET-28b(+)-PPA在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 將已成功轉(zhuǎn)化pET-28b(+)-PPA重組質(zhì)粒的菌株以及轉(zhuǎn)化pET-28b(+) 的表達(dá)菌株挑取單克隆菌落接種到5 mL LB(100 mg/L Kan) 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，各取0.5 mL接種到50 mL LB(100 mg/L Kan) 培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，待OD600為0.6時，分別誘導(dǎo)0，3，6，9，12 h。誘導(dǎo)完成后取菌液，10 000 r/min，4 ℃離心5 min棄上清液沉淀加入1 mL PBS吹吸混勻后，超聲波破碎9 s休息，5 s工作，工作次數(shù)50次。將菌液5 000 r/min，4 ℃離心5 min。吸取上清至新的1.5 mL EP管中，沉淀加入100 μL PBS緩沖液，吹吸混勻置-20 ℃。分別取上清和沉淀各50 μL，加入50 μL SDS上樣緩沖液，吹吸混勻。沸水浴10 min，4 ℃保存，待各組均處理完畢，統(tǒng)一點樣進(jìn)行SDS-PAGE(5%積層膠，15%分離膠)。凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色1.5 h，脫色至條帶清晰。

2 結(jié)果與分析

2.1 掌葉半夏凝集素家族成員基因CDS序列的擴(kuò)增及生物信息學(xué)分析

2.1.1 掌葉半夏凝集素家族成員基因CDS序列的擴(kuò)增 通過對河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所生物技術(shù)研究中心前期所構(gòu)建掌葉半夏凝集素cDNA文庫分析，設(shè)計引物，提取掌葉半夏總RNA，并利用RT-PCR擴(kuò)增獲得3個掌葉半夏凝集素家族基因PPA15、PPA324、PPA533(圖1)。

A：1.Marker DM2000；2～4.PPA15擴(kuò)增片段；5.雙蒸水。B：1.Marker DM2000；2～4.PPA324擴(kuò)增片段；5.雙蒸水。C：1.Marker DM2000；2.雙蒸水；3～6.PPA533擴(kuò)增片段。A：1.Marker DM2000；2-4.PPA15 sequence；5.ddH2O. B：1.Marker DM2000；2-4.PPA324 sequence；5.ddH2O. C：1.Marker DM2000；2.ddH2O；3-6.PPA533 sequence.

2.1.2 掌葉半夏凝集素家族成員基因生物信息學(xué)分析PPA15基因全長729 bp，編碼一個由243個氨基酸構(gòu)成的多肽，理論分子量為27 ku；信號肽由N端25個氨基酸殘基組成，具有典型的跨膜結(jié)構(gòu)域，推測定位于胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)(圖2-A、B)；具有單子葉甘露糖結(jié)合位點QDNVY和血球型凝集素結(jié)構(gòu)域(圖2-C)。

A.信號肽分析；B.跨膜結(jié)構(gòu)域分析；C.基因結(jié)構(gòu)域分析。圖3-4同。A .The analysis of signal peptide; B.The analysis of transmembrane domain; C.The analysis of genetic domain.The same as Fig.3-4.

PPA324基因全長774 bp，編碼一個由258個氨基酸構(gòu)成的多肽，理論分子量為28 ku；信號肽由N端25個氨基酸殘基組成，具有典型的跨膜結(jié)構(gòu)域，推測定位于胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)(圖3-A、B)；具有單子葉甘露糖結(jié)合位點QDNVY和血球型凝集素結(jié)構(gòu)域(圖3-C)。

圖3 PPA324生物信息學(xué)分析Fig.3 The bioinformatics analysis of PPA324

PPA533基因全長777 bp，編碼一個由259個氨基酸構(gòu)成的多肽，理論分子量為28 ku；信號肽由N端25個氨基酸殘基組成，具有典型的跨膜結(jié)構(gòu)域，推測定位于胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)(圖4-A、B)；具有單子葉甘露糖結(jié)合位點QDNVY和血球型凝集素結(jié)構(gòu)域(圖4-C)。

圖4 PPA533生物信息學(xué)分析Fig.4 The bioinformatics analysis of PPA533

2.1.3 掌葉半夏凝集素家族成員基因同源聚類分析 本研究利用DNA分析軟件將得到的序列與GenBank中的序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)具有高度相似性，序列相似度高達(dá)89.35%，且具有一致的保守結(jié)構(gòu)位點。

蛋白聚類分析顯示，PPA15、PPA324與滴水珠凝集素聚成一類，再與三葉半夏、掌葉半夏等凝集素聚成一類；PPA533與異葉天南星凝集素聚成一類(圖5)。

將所測序序列與GenBank中已報道的掌葉半夏序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示，PPA15與報道的掌葉半夏凝集素基因(PPA，KF154981.1)相似性為92%，編碼的氨基酸序列相似性為82%；PPA324與報道的掌葉半夏凝集素基因(PPA，KF154981.1)相似性為93%，編碼的氨基酸序列相似性為88%; PPA324與報道的掌葉半夏凝集素基因(PPA，KF154981.1)相似性為91%，編碼的氨基酸序列相似性為83%。與三葉半夏凝集素基因(PTA，AY4518540)滴水珠凝集素基因(PCA，EF090419)、花南星凝集素基因(ALA，AY557617)、犁頭尖凝集素基因(TDA，EF194099)、異葉天南星基因(AHA，AY338965)、東北南星凝集素基因(AAA，EU409835)、芋頭凝集素基因(CEA，EF541132)和雪花蓮?fù)庠茨鼗?GNA，AF413083)的同源性為84%～89%?？梢姡瑔巫尤~凝集素基因在進(jìn)化過程中是高度保守的，它們具有重要的生物學(xué)功能。

圖5 掌葉半夏凝集素與其他植物凝集素氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)分類樹Fig.5 The systematic classification tree of PPA and other plant lectin amino acid sequence

2.2 融合蛋白原核表達(dá)載體構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

將pET-28b(+)和pEASY-PPA分別用XhoⅠ和NdeⅠ進(jìn)行雙酶切，回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至克隆菌株DH5α中。經(jīng)菌液PCR和雙酶切鑒定，將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)中。用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)菌株，選取0，3，6，9 h菌液，經(jīng)超聲波破碎后提取上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE檢測(圖6)，結(jié)果顯示，在28.0 ku附近，可見明顯的蛋白片段，與預(yù)期一致，融合蛋白成功表達(dá)，可提取用于后續(xù)研究。

A.融合蛋白pET-28b(+)-PPA15與空載體對照在誘導(dǎo)0，3，6，9 h后表達(dá)；B.融合蛋白pET-28b(+)-PPA324與空載體對照在誘導(dǎo)0，3，6，9 h后表達(dá)；C.融合蛋白pET-28b(+)-PPA533與空載體對照在誘導(dǎo)0，3，6，9 h后表達(dá)。A.The expression of pET-28b(+)-PPA15 and pET-28b(+) at inducing 0，3，6，9 h; B.The expression of pET-28b(+)-PPA324 and pET-28b(+) at inducing 0，3，6，9 h; C.The expression of pET-28b(+)-PPA533 and pET-28b(+) at inducing 0，3，6，9 h.

3 討論

目前，對半夏凝集素基因的研究主要分為兩方面：原核表達(dá)蛋白和轉(zhuǎn)基因植株研究。Yao等[11-12]首次克隆了PTA基因，并且成功地得到相應(yīng)的氨基酸序列。吳志明等[13]克隆并將PTA轉(zhuǎn)化煙草，結(jié)果獲得轉(zhuǎn)基因煙草對蚜蟲的平均抑制率達(dá)到77.02%。

將雪花蓮凝集素基因(GNAs)、中國水仙凝集素基因(NTLs)、半夏凝集素基因(pta)分別轉(zhuǎn)化小麥進(jìn)行田間以及室內(nèi)的抗蟲性鑒定比較。結(jié)果顯示，sGNA與sNTL以及pta基因可以作為培育高抗蟲性小麥的較好選擇[14]。

將PPA2轉(zhuǎn)化并經(jīng)Western Blot鑒定后進(jìn)行抗蚜性分析，結(jié)果表示，不同表達(dá)量的轉(zhuǎn)基因煙草都具有明顯的抗蚜性[15]。而Wu等[16]將掌葉半夏PPAb基因轉(zhuǎn)入煙草，轉(zhuǎn)基因煙草對蚜蟲的平均抑制率達(dá)到了90.28%。

通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這幾個凝集素成員都具有典型的甘露糖結(jié)合位點QDNVY，屬單子葉甘露糖凝集素，并且都具有血球型凝集素結(jié)構(gòu)域。與先前已經(jīng)報道的抗性基因在生物信息學(xué)上極其相似。Blast比對結(jié)果顯示，它與已報道的PPA、PTA、PCA、ALA、TDA、AHA、AAA等具有較高的相似性[17]，其中與三葉半夏相似性最高，采用生物軟件Mega 4.1和Clustal W2對不同植物凝集素氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)分析，這從分子進(jìn)化上證實了掌葉半夏隸屬于天南星科半夏屬植物，同時也為下一步獲得抗蟲植株或其他制劑提供了材料和方法基礎(chǔ)。

已有研究表明，單子葉植物甘露糖凝集素如雪蓮花凝集素(GNA)和大蒜凝集素(Alliumsativumleafagglutinin，ASAL)在蚜蟲腸道中均有共同的結(jié)合位點[18-20]。此外，由于凝集素成員之間存在抗蚜蟲差異，可能從中篩選得到更加高抗蚜活性的凝集素家族成員，豐富凝集素抗蚜基因庫；研究不同成員之間是否存在協(xié)同效應(yīng)等。因此，有必要克隆篩選更多的甘露糖凝集素家族成員，獲得更多的序列和抗蚜特性的數(shù)據(jù)，為深入研究和篩選更高殺蟲活性的凝集素成員提供基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，盡管凝集素家族同源性很高，但通過誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)現(xiàn)在相同的時間、相同濃度的IPTG誘導(dǎo)下，融合蛋白的表達(dá)量各不相同。此外，氨基酸序列的差異會不會導(dǎo)致蛋白功能的不同還需要進(jìn)一步的研究。

本研究應(yīng)用的pET-28b(+)表達(dá)是帶有載體His標(biāo)簽的融合表達(dá)系統(tǒng)，其利用T7啟動子高效表達(dá)目的融合蛋白。而融合蛋白中的His標(biāo)簽不會影響蛋白的活性，便于純化。誘導(dǎo)表達(dá)后的蛋白通常以2種形式存在：可溶性蛋白和包涵體蛋白?？扇苄缘鞍状嬗诰荷锨逡褐校兓饋肀容^容易；而包涵體蛋白存于菌體中，純化較難，而且易使蛋白變性。本試驗通過多次誘導(dǎo)，探索不同的誘導(dǎo)條件，終于得到可溶性蛋白，這為以后純化蛋白、研究該蛋白的性質(zhì)及功能提供了基礎(chǔ)。

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