賀 慧，虢 慧，官春云

(國家油料改良中心湖南分中心，湖南 長沙 410128)

油菜是我國重要的油料和經濟作物之一，菜籽油是我國主要植物食用油之一。菜籽油不僅富含人體所必需的氨基酸和脂肪酸，而且隨著脂肪酸含量的提升增加了植物油的化學穩(wěn)定性，能較長時間地儲存[1]。因此，脂肪酸的含量決定了菜籽油的品質。?；d體蛋白(Acyl carrier protein，ACP)參與脂肪酸和甲羥戊酸的合成及脂肪酸的脫氫反應[2]，在脂肪酸合成的過程中酰基載體蛋白是一個最為關鍵的蛋白質[3]，該蛋白是一個具有保守絲氨酸殘基的小分子量的可溶酸性蛋白質，其輔基4′-磷酸泛酰巰基乙胺與ACP中的絲氨酸殘基通過磷酸酯鍵相連[4-5]，另一端的-SH自由基通過硫酯鍵連接脂?；鵞6]，其在酶反應過程中起著運輸的作用[7-9]，將脂酰基從一個酶反應轉移到另一個酶反應[10]。有科學家指出，在擬南芥中有多種不同的質體ACP，其中包括5種質體ACP以及3種線粒體ACP[11]，這些ACP有不同的調控方式和表達模式[12-13]。研究發(fā)現，ACP異構體的種類及差異表達與植物脂肪酸中不飽和脂肪酸組成及占總脂肪酸的比例有密切關系[4，14-15]；植物ACP的表達方式共有組成型表達和組織特異性表達及細胞特異性表達3種不同的方式[12，16]。目前，植物中ACP基因的研究進展十分迅速，研究發(fā)現，將ACP基因轉入蕓薹屬作物中，在葉中表達量增加數倍，表達量增加的同時16∶3的脂肪酸明顯減少，亞麻酸(18∶3)的含量明顯增加，種子中油酸和亞油酸的含量明顯增加[17]，但是在種子內總脂肪酸含量沒有明顯變化[4]。因此，改變ACP基因的表達有可能改變菜籽油中脂肪酸的組成及含量[8]。然而，現在對ACP5基因的研究報道還不多見，其生物信息學分析很不完善及其在種子中的表達分析尚未見到報道。本研究對BnACP5基因克隆，并進行生物信息學分析，預測其結構與功能，旨在為高油酸油菜品種選育提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

湘油15由湖南農業(yè)大學油料改良中心提供。RNA Kit、 反轉錄、熒光定量、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒均在北京全式金生物技術有限公司購買；PrimeSTAR GXL DNA Polymerase、pMD-19T Vector Cloning kit等從TaKaRa公司購買。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成 參照 RNA Kit試劑盒說明書分別提取各時期種子的總RNA，所提RNA用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，用Nanodrop 2000檢測RNA的純度和濃度，于-80 ℃保存。用反轉錄試劑盒參照說明書反轉錄合成cDNA第一鏈及去除gDNA，于-20 ℃保存[18]。

1.2.2 試驗引物設計及基因克隆 從TAIR數據庫得到擬南芥AtACP5基因編號(AT5G27200)，并將該基因編號于Brassica Database數據庫(http：//brassicadb.org/brad/index.php)Blast得到一段序列，利用Primer Premier 5軟件在這段序列兩端設計一對引物ACP5-F/ACP5-R(表1)，以30 d種子的cDNA為模板，用引物ACP5-F(CCGCCATCTCTCTCT

CTTGATC)/ACP5-R(GAACAGAGGCACATTTAAGC

GG)進行PCR擴增。PCR反應體系：模板1 μL，dNTPs 4 μL，5×Buffer 10 μL，ACP5-F/ACP5-R各1 μL， DNA聚合酶1 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性50 s，52 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，設35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測到的目的條帶用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒回收，將回收產物連接到pMD-19T載體后轉化大腸桿菌，并測序。

1.2.3 甘藍型油菜BnACP5基因的序列對比及聚類分析、生物信息學分析 利用DNAMAN軟件對BnACP5基因的序列進行對比；結合Mega 6.06軟件、NCBI的CDD在線工具、ExPASy蛋白質分析系統(tǒng)中的ProtParam在線工具、ProtScale在線分析軟件、在線軟件Signalp 4.1 server、TMHMM Server v 2.0在線軟件、SOPMA、Netphos 2.0 server、Psort Ⅱ Prediction分別對BnACP5基因進行聚類分析及其編碼蛋白的結構域、基因編碼蛋白的理化性質、疏水性/親水性、信號肽、跨膜結構、二級結構、磷酸化位點、亞細胞定位分析及預測[19]。

1.2.4 甘藍型油菜BnACP5基因相對表達量分析 以湘油15不同生長時期的種子的cDNA為模板，從已獲得的BnACP5基因中設計熒光定量PCR引物QPCR-F(GACATCCCATCCCTGCTC)/QPCR-R(ATC

CCGAACTCTTCCTCC)，從Brassica Database中得到甘藍型油菜BnUBC21基因序列并設計一對內參引物UBC21-F(CCTCTGCAGCCTCCTCAAGT)/UBC21-R(TATCTCCCCTGTCTTGAAATGC)。具體操作參照熒光定量試劑盒的說明書進行，數據采用CFX Manager 軟件中-ΔΔCT法進行分析。

2 結果與分析

2.1 BnACP5基因的克隆

以提取湘油15號30 d種子中的RNA為模板，通過RT-PCR反轉錄成cDNA第一條鏈，用引物ACP5-F/ACP5-R PCR進行PCR擴增，擴增出長度約為500 bp的基因片段(圖1)。用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒將檢測到的目的基因條帶回收，將回收產物連接pMD-19T載體并轉化大腸桿菌，經菌落PCR檢測呈陽性，即獲得陽性克隆。將其與Brassica Database比對的一段417 bp的CDs序列命名為BnACP5。

M.Trans2K DNA Markers；1.PCR產物。M.Trans2K DNA Markers；1.PCR results.

2.2 BnACP5蛋白生物信息學分析

2.2.1 甘藍型油菜ACP5氨基酸序列分析 通過NCBI的CDD在線工具分析該蛋白的結構域，結果顯示，該蛋白含有acyl_carrier結構域(57-133)。結構域中有磷酸泛酰巰基乙胺結合位點(Phosphopantetheine attachment site)，該位點包含在保守的Asp-Ser-Leu (DSL)基序中，該基序為磷酸泛酞琉基乙胺基轉移酶家族成員識別。該保守結構域屬于磷酸泛酰巰基乙胺結合蛋白超家族(PP-binding superfamily)。通過NCBI對BnACP5進行BlastX比對，結果顯示，BnACP5共編碼138個氨基酸，BnACP5與白菜型油菜的ACP5序列相似性最高，達到98%。利用DNAMAN軟件將BnACP5蛋白與擬南芥(NP_198072.1)、甘藍(XP_013607498.1)、白菜型油菜(XP_009111933.1)的氨基酸序列進行比對(圖2)，結果發(fā)現，這4個物種的氨基酸序列中的acyl_carrier結構域具有高度的相似性；ACP氨基酸序列比對表明，植物ACP磷酸泛酰巰基乙胺結合位點周圍的氨基酸序列高度保守。

2.2.2 甘藍型油菜ACP5氨基酸聚類分析 為了分析BnACP5的進化發(fā)育，結合Mega 6.06軟件將BnACP5的氨基酸序列與從NCBI的nr數據庫中選取了9個相似性高的氨基酸序列：擬南芥(NP_198072.1)、白菜型油菜(XP_009111933.1)、甘藍(XP_013607498.1)、山葵(XP_006394987.1)、亞麻薺(XP_010455149.1)、醉蝶花(XP_010524895.1)、玉山筷子芥(XP_002874402.1)、薺菜(XP_006289890.1)、高山南芥(KFK26465.1)，進行UPGMA聚類分析，結果見圖3。根據親緣關系的遠近可分為4類：甘藍型油菜、白菜型油菜與甘藍為一類，醉蝶花為一類，其他物種共為一類，其中，甘藍型油菜與白菜型油菜親緣關系最近。

實線代表acyl_carrier結構域；方框代表DSL基序。The acyl_carrier-domain marked with solid line；The DSL motif marked with box.

2.2.3 甘藍型油菜BnACP5氨基酸的理化性質分析 利用ProtParam分析BnACP5基因編碼的蛋白的理化性質，結果顯示，BnACP5由138個氨基酸組成，分子式為C667H1093N183O211S6，相對分子質量為15.25 ku，理論等電點(pI)為5.94，其不穩(wěn)定參數為43.03，屬于不穩(wěn)定蛋白。該基因編碼的多肽含丙氨酸(Ala，A)最多，占總氨基酸的11.6%；其次是谷氨酸(Glu，E)，占總氨基酸的10.9%。其中，不含色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)、甲硫胺酸(Pyl，O)、硒半胱氨酸(Sec，U)，其總疏水平均系數(GRAVY)為-0.148，屬親水性蛋白。為了進一步說明BnACP5基因編碼的蛋白是一個親水蛋白，運用ProtScale軟件進一步分析(圖4)，結果顯示，基線上部曲線明顯少于下部曲線，說明大部分氨基酸為親水性氨基酸，這也說明該蛋白為親水蛋白。

NP_198072.1.擬南芥；XP_009111933.1.白菜型油菜；XP_013607498.1.甘藍；XP_006394987.1.山葵；XP_010455149.1.亞麻薺；XP_010524895.1.醉蝶花；XP_002874402.1.玉山筷子芥；XP_006289890.1.薺菜；KFK26465.1.高山南芥。

NP_198072.1.Arabidopsisthaliana; XP_009111933.1.Brassicarapa;XP_013607498.1.Brassicaoleracea; XP_006394987.1.Wasabijaponica;XP_010455149.1.CamelinasativaL.Crantz. ; XP_010524895.1.CleomespinosaL.; XP_002874402.1.ArabislyrataL.; XP_006289890.1.Capsellabursa-pastoris; KFK26465.1.Arabisalpine.

圖3甘藍型油菜ACP5氨基酸與其他相似性高的氨基酸聚類
Fig.3PhylogenetictreeofaminoacidofACP5ofB.napusandothersimilaraminoacids

圖4 BnACP5基因編碼蛋白的親疏水性預測Fig.4 Hydrophilicity and hydrophobicity prediction of BnACP5 gene coding protein

2.2.4 甘藍型油菜BnACP5信號肽及跨膜結構預測 在Signa1p 4.1在線軟件上對其編碼蛋白的信號肽進行預測(圖5)，結果顯示，第18個氨基酸處為信號肽C和Y的最大切割點，分值分別為0.260和0.239，第4個氨基酸處為信號肽S的最大切割點，分值為0.305。由此可知，BnACP5無信號肽序列，屬于非分泌蛋白。從TMHMM Server v 2.0對BnACP5跨膜結構進行預測，結果顯示，該蛋白不含跨膜結構，為非跨膜蛋白。

2.2.5 甘藍型油菜BnACP5基因編碼蛋白的二級結構預測及磷酸化位點預測、亞細胞定位 利用SOPMA在線軟件預測其二級結構，結果顯示，該蛋白的二級結構類型為：α螺旋為59.42%、無規(guī)則卷曲為23.19%、延伸鏈為14.49%，β轉角比例最小，為2.90%。運用Netphos 2.0 server在線軟件對其編碼蛋白進行磷酸化位點預測，結果顯示(圖6)，該蛋白序列中含有13個蘇氨酸(Threonine，T)和12個絲氨酸(Serine，S)，其中18個可能是磷酸化位點。通過Psort Ⅱ Prediction預測該蛋白位于線粒體內。

圖5 BnACP5基因編碼蛋白信號肽預測Fig.5 Singal peptide prediction of BnACP5 gene coding protein

圖6 BnACP5基因編碼蛋白磷酸化位點預測Fig.6 Phosphorylation site prediction of BnACP5 gene coding protein

2.3 BnACP5基因相對表達分析

由圖7可知，該基因的表達量在種子發(fā)育的不同時期呈一定規(guī)律的變化，在授粉后15 d種子相對表達量就達到峰值；在20 d時，呈下降趨勢；在25～35 d種子BnACP5基因的相對表達量呈上升趨勢，之后迅速下降；在45 d，種子BnACP5基因的相對表達量已降到最低水平。

不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。Different small letters indicate significant at the 0.05 level.

3 討論

對BnACP5蛋白的氨基酸序列分析結果顯示，甘藍型油菜與白菜型油菜的ACP5同源性最高，為98%，并且該蛋白具有高度保守的PP-binding結構域，也具有與絲氨酸殘基共價結合的磷酸泛酸鹽，是一個典型的酰基載體蛋白[20]。對該家族氨基酸UPGMA聚類分析結果顯示，BnACP5與白菜型油菜、甘藍親緣關系較近，與其他植物親緣關系較遠，由此可推測，ACP5在進化中相對保守。對甘藍型油菜BnACP5基因編碼的蛋白理化性質分析顯示，該蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白，不穩(wěn)定參數為43.03，是一個可溶的酸性蛋白，這些與Branen 等[14]研究結果基本吻合。研究發(fā)現，AtACP具有高度保守特性，對于脂肪酸的含量和組成具有重要的作用[3]。本研究在甘藍型油菜克隆出一條BnACP5 CDs序列，對其蛋白亞細胞定位結果也顯示其在線粒體上，這與擬南芥中的AtACP基因研究結果基本一致[11]。

近年來，大量的研究表明，ACP基因與脂肪酸合成有關，因此，研究其在種子的表達趨勢，對其功能的挖掘有重要的意義。組織特異性表達分析表明，BnACP5基因在甘藍型油菜種子發(fā)育過程中高度表達。由此表明，BnACP5基因可能與種子的發(fā)育有關。本研究中，BnACP5在15 d達到峰值，20 d下降，25～35 d呈上升趨勢，此后迅速下降，45 d表達量降到最低水平。在擬南芥[4]和芥菜[17]中研究發(fā)現，ACP超表達改變了不飽和脂肪酸所占的比例，但提高了種子的油酸(18∶1)和亞油酸(18∶2)含量。高建芹[21]、李成磊[22]等研究表明，在甘藍型油菜種子發(fā)育過程中的油酸(18∶1)與亞油酸(18∶2)呈極顯著負相關。油酸(18∶1)的含量呈現先上升后下降的趨勢；而亞油酸(18∶2)開花后15 d含量最高，隨著角果的發(fā)育進程含量下降。驗證了本試驗前期BnACP5表達量高，后期總體呈下降趨勢的結論。

本研究克隆了甘藍型油菜BnACP5基因，對其表達模式進行了qPCR分析，這為后續(xù)開展功能驗證打下了堅實的基礎。

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