賀 慧，虢 慧，官春云

(國(guó)家油料改良中心湖南分中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

油菜是我國(guó)重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物之一，菜籽油是我國(guó)主要植物食用油之一。菜籽油不僅富含人體所必需的氨基酸和脂肪酸，而且隨著脂肪酸含量的提升增加了植物油的化學(xué)穩(wěn)定性，能較長(zhǎng)時(shí)間地儲(chǔ)存[1]。因此，脂肪酸的含量決定了菜籽油的品質(zhì)。?；d體蛋白(Acyl carrier protein，ACP)參與脂肪酸和甲羥戊酸的合成及脂肪酸的脫氫反應(yīng)[2]，在脂肪酸合成的過(guò)程中酰基載體蛋白是一個(gè)最為關(guān)鍵的蛋白質(zhì)[3]，該蛋白是一個(gè)具有保守絲氨酸殘基的小分子量的可溶酸性蛋白質(zhì)，其輔基4′-磷酸泛酰巰基乙胺與ACP中的絲氨酸殘基通過(guò)磷酸酯鍵相連[4-5]，另一端的-SH自由基通過(guò)硫酯鍵連接脂?；鵞6]，其在酶反應(yīng)過(guò)程中起著運(yùn)輸?shù)淖饔肹7-9]，將脂?；鶑囊粋€(gè)酶反應(yīng)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)酶反應(yīng)[10]。有科學(xué)家指出，在擬南芥中有多種不同的質(zhì)體ACP，其中包括5種質(zhì)體ACP以及3種線粒體ACP[11]，這些ACP有不同的調(diào)控方式和表達(dá)模式[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，ACP異構(gòu)體的種類及差異表達(dá)與植物脂肪酸中不飽和脂肪酸組成及占總脂肪酸的比例有密切關(guān)系[4，14-15]；植物ACP的表達(dá)方式共有組成型表達(dá)和組織特異性表達(dá)及細(xì)胞特異性表達(dá)3種不同的方式[12，16]。目前，植物中ACP基因的研究進(jìn)展十分迅速，研究發(fā)現(xiàn)，將ACP基因轉(zhuǎn)入蕓薹屬作物中，在葉中表達(dá)量增加數(shù)倍，表達(dá)量增加的同時(shí)16∶3的脂肪酸明顯減少，亞麻酸(18∶3)的含量明顯增加，種子中油酸和亞油酸的含量明顯增加[17]，但是在種子內(nèi)總脂肪酸含量沒(méi)有明顯變化[4]。因此，改變ACP基因的表達(dá)有可能改變菜籽油中脂肪酸的組成及含量[8]。然而，現(xiàn)在對(duì)ACP5基因的研究報(bào)道還不多見(jiàn)，其生物信息學(xué)分析很不完善及其在種子中的表達(dá)分析尚未見(jiàn)到報(bào)道。本研究對(duì)BnACP5基因克隆，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)與功能，旨在為高油酸油菜品種選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

湘油15由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料改良中心提供。RNA Kit、 反轉(zhuǎn)錄、熒光定量、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒均在北京全式金生物技術(shù)有限公司購(gòu)買；PrimeSTAR GXL DNA Polymerase、pMD-19T Vector Cloning kit等從TaKaRa公司購(gòu)買。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成 參照 RNA Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取各時(shí)期種子的總RNA，所提RNA用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，用Nanodrop 2000檢測(cè)RNA的純度和濃度，于-80 ℃保存。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒參照說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈及去除gDNA，于-20 ℃保存[18]。

1.2.2 試驗(yàn)引物設(shè)計(jì)及基因克隆 從TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)得到擬南芥AtACP5基因編號(hào)(AT5G27200)，并將該基因編號(hào)于Brassica Database數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//brassicadb.org/brad/index.php)Blast得到一段序列，利用Primer Premier 5軟件在這段序列兩端設(shè)計(jì)一對(duì)引物ACP5-F/ACP5-R(表1)，以30 d種子的cDNA為模板，用引物ACP5-F(CCGCCATCTCTCTCT

CTTGATC)/ACP5-R(GAACAGAGGCACATTTAAGC

GG)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：模板1 μL，dNTPs 4 μL，5×Buffer 10 μL，ACP5-F/ACP5-R各1 μL， DNA聚合酶1 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性50 s，52 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，設(shè)35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將檢測(cè)到的目的條帶用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒回收，將回收產(chǎn)物連接到pMD-19T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并測(cè)序。

1.2.3 甘藍(lán)型油菜BnACP5基因的序列對(duì)比及聚類分析、生物信息學(xué)分析 利用DNAMAN軟件對(duì)BnACP5基因的序列進(jìn)行對(duì)比；結(jié)合Mega 6.06軟件、NCBI的CDD在線工具、ExPASy蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)中的ProtParam在線工具、ProtScale在線分析軟件、在線軟件Signalp 4.1 server、TMHMM Server v 2.0在線軟件、SOPMA、Netphos 2.0 server、Psort Ⅱ Prediction分別對(duì)BnACP5基因進(jìn)行聚類分析及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域、基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、疏水性/親水性、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)、亞細(xì)胞定位分析及預(yù)測(cè)[19]。

1.2.4 甘藍(lán)型油菜BnACP5基因相對(duì)表達(dá)量分析 以湘油15不同生長(zhǎng)時(shí)期的種子的cDNA為模板，從已獲得的BnACP5基因中設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物QPCR-F(GACATCCCATCCCTGCTC)/QPCR-R(ATC

CCGAACTCTTCCTCC)，從Brassica Database中得到甘藍(lán)型油菜BnUBC21基因序列并設(shè)計(jì)一對(duì)內(nèi)參引物UBC21-F(CCTCTGCAGCCTCCTCAAGT)/UBC21-R(TATCTCCCCTGTCTTGAAATGC)。具體操作參照熒光定量試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，數(shù)據(jù)采用CFX Manager 軟件中-ΔΔCT法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BnACP5基因的克隆

以提取湘油15號(hào)30 d種子中的RNA為模板，通過(guò)RT-PCR反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一條鏈，用引物ACP5-F/ACP5-R PCR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為500 bp的基因片段(圖1)。用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒將檢測(cè)到的目的基因條帶回收，將回收產(chǎn)物連接pMD-19T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)菌落PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性，即獲得陽(yáng)性克隆。將其與Brassica Database比對(duì)的一段417 bp的CDs序列命名為BnACP5。

M.Trans2K DNA Markers；1.PCR產(chǎn)物。M.Trans2K DNA Markers；1.PCR results.

2.2 BnACP5蛋白生物信息學(xué)分析

2.2.1 甘藍(lán)型油菜ACP5氨基酸序列分析 通過(guò)NCBI的CDD在線工具分析該蛋白的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，該蛋白含有acyl_carrier結(jié)構(gòu)域(57-133)。結(jié)構(gòu)域中有磷酸泛酰巰基乙胺結(jié)合位點(diǎn)(Phosphopantetheine attachment site)，該位點(diǎn)包含在保守的Asp-Ser-Leu (DSL)基序中，該基序?yàn)榱姿岱禾鸹野坊D(zhuǎn)移酶家族成員識(shí)別。該保守結(jié)構(gòu)域?qū)儆诹姿岱乎€基乙胺結(jié)合蛋白超家族(PP-binding superfamily)。通過(guò)NCBI對(duì)BnACP5進(jìn)行BlastX比對(duì)，結(jié)果顯示，BnACP5共編碼138個(gè)氨基酸，BnACP5與白菜型油菜的ACP5序列相似性最高，達(dá)到98%。利用DNAMAN軟件將BnACP5蛋白與擬南芥(NP_198072.1)、甘藍(lán)(XP_013607498.1)、白菜型油菜(XP_009111933.1)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)(圖2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這4個(gè)物種的氨基酸序列中的acyl_carrier結(jié)構(gòu)域具有高度的相似性；ACP氨基酸序列比對(duì)表明，植物ACP磷酸泛酰巰基乙胺結(jié)合位點(diǎn)周圍的氨基酸序列高度保守。

2.2.2 甘藍(lán)型油菜ACP5氨基酸聚類分析 為了分析BnACP5的進(jìn)化發(fā)育，結(jié)合Mega 6.06軟件將BnACP5的氨基酸序列與從NCBI的nr數(shù)據(jù)庫(kù)中選取了9個(gè)相似性高的氨基酸序列：擬南芥(NP_198072.1)、白菜型油菜(XP_009111933.1)、甘藍(lán)(XP_013607498.1)、山葵(XP_006394987.1)、亞麻薺(XP_010455149.1)、醉蝶花(XP_010524895.1)、玉山筷子芥(XP_002874402.1)、薺菜(XP_006289890.1)、高山南芥(KFK26465.1)，進(jìn)行UPGMA聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。根據(jù)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近可分為4類：甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜與甘藍(lán)為一類，醉蝶花為一類，其他物種共為一類，其中，甘藍(lán)型油菜與白菜型油菜親緣關(guān)系最近。

實(shí)線代表acyl_carrier結(jié)構(gòu)域；方框代表DSL基序。The acyl_carrier-domain marked with solid line；The DSL motif marked with box.

2.2.3 甘藍(lán)型油菜BnACP5氨基酸的理化性質(zhì)分析 利用ProtParam分析BnACP5基因編碼的蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，BnACP5由138個(gè)氨基酸組成，分子式為C667H1093N183O211S6，相對(duì)分子質(zhì)量為15.25 ku，理論等電點(diǎn)(pI)為5.94，其不穩(wěn)定參數(shù)為43.03，屬于不穩(wěn)定蛋白。該基因編碼的多肽含丙氨酸(Ala，A)最多，占總氨基酸的11.6%；其次是谷氨酸(Glu，E)，占總氨基酸的10.9%。其中，不含色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)、甲硫胺酸(Pyl，O)、硒半胱氨酸(Sec，U)，其總疏水平均系數(shù)(GRAVY)為-0.148，屬親水性蛋白。為了進(jìn)一步說(shuō)明BnACP5基因編碼的蛋白是一個(gè)親水蛋白，運(yùn)用ProtScale軟件進(jìn)一步分析(圖4)，結(jié)果顯示，基線上部曲線明顯少于下部曲線，說(shuō)明大部分氨基酸為親水性氨基酸，這也說(shuō)明該蛋白為親水蛋白。

NP_198072.1.擬南芥；XP_009111933.1.白菜型油菜；XP_013607498.1.甘藍(lán)；XP_006394987.1.山葵；XP_010455149.1.亞麻薺；XP_010524895.1.醉蝶花；XP_002874402.1.玉山筷子芥；XP_006289890.1.薺菜；KFK26465.1.高山南芥。

NP_198072.1.Arabidopsisthaliana; XP_009111933.1.Brassicarapa;XP_013607498.1.Brassicaoleracea; XP_006394987.1.Wasabijaponica;XP_010455149.1.CamelinasativaL.Crantz. ; XP_010524895.1.CleomespinosaL.; XP_002874402.1.ArabislyrataL.; XP_006289890.1.Capsellabursa-pastoris; KFK26465.1.Arabisalpine.

圖3甘藍(lán)型油菜ACP5氨基酸與其他相似性高的氨基酸聚類
Fig.3PhylogenetictreeofaminoacidofACP5ofB.napusandothersimilaraminoacids

圖4 BnACP5基因編碼蛋白的親疏水性預(yù)測(cè)Fig.4 Hydrophilicity and hydrophobicity prediction of BnACP5 gene coding protein

2.2.4 甘藍(lán)型油菜BnACP5信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 在Signa1p 4.1在線軟件上對(duì)其編碼蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖5)，結(jié)果顯示，第18個(gè)氨基酸處為信號(hào)肽C和Y的最大切割點(diǎn)，分值分別為0.260和0.239，第4個(gè)氨基酸處為信號(hào)肽S的最大切割點(diǎn)，分值為0.305。由此可知，BnACP5無(wú)信號(hào)肽序列，屬于非分泌蛋白。從TMHMM Server v 2.0對(duì)BnACP5跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，該蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)，為非跨膜蛋白。

2.2.5 甘藍(lán)型油菜BnACP5基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)、亞細(xì)胞定位 利用SOPMA在線軟件預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)類型為：α螺旋為59.42%、無(wú)規(guī)則卷曲為23.19%、延伸鏈為14.49%，β轉(zhuǎn)角比例最小，為2.90%。運(yùn)用Netphos 2.0 server在線軟件對(duì)其編碼蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示(圖6)，該蛋白序列中含有13個(gè)蘇氨酸(Threonine，T)和12個(gè)絲氨酸(Serine，S)，其中18個(gè)可能是磷酸化位點(diǎn)。通過(guò)Psort Ⅱ Prediction預(yù)測(cè)該蛋白位于線粒體內(nèi)。

圖5 BnACP5基因編碼蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.5 Singal peptide prediction of BnACP5 gene coding protein

圖6 BnACP5基因編碼蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.6 Phosphorylation site prediction of BnACP5 gene coding protein

2.3 BnACP5基因相對(duì)表達(dá)分析

由圖7可知，該基因的表達(dá)量在種子發(fā)育的不同時(shí)期呈一定規(guī)律的變化，在授粉后15 d種子相對(duì)表達(dá)量就達(dá)到峰值；在20 d時(shí)，呈下降趨勢(shì)；在25～35 d種子BnACP5基因的相對(duì)表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，之后迅速下降；在45 d，種子BnACP5基因的相對(duì)表達(dá)量已降到最低水平。

不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。Different small letters indicate significant at the 0.05 level.

3 討論

對(duì)BnACP5蛋白的氨基酸序列分析結(jié)果顯示，甘藍(lán)型油菜與白菜型油菜的ACP5同源性最高，為98%，并且該蛋白具有高度保守的PP-binding結(jié)構(gòu)域，也具有與絲氨酸殘基共價(jià)結(jié)合的磷酸泛酸鹽，是一個(gè)典型的?；d體蛋白[20]。對(duì)該家族氨基酸UPGMA聚類分析結(jié)果顯示，BnACP5與白菜型油菜、甘藍(lán)親緣關(guān)系較近，與其他植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，由此可推測(cè)，ACP5在進(jìn)化中相對(duì)保守。對(duì)甘藍(lán)型油菜BnACP5基因編碼的蛋白理化性質(zhì)分析顯示，該蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白，不穩(wěn)定參數(shù)為43.03，是一個(gè)可溶的酸性蛋白，這些與Branen 等[14]研究結(jié)果基本吻合。研究發(fā)現(xiàn)，AtACP具有高度保守特性，對(duì)于脂肪酸的含量和組成具有重要的作用[3]。本研究在甘藍(lán)型油菜克隆出一條BnACP5 CDs序列，對(duì)其蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果也顯示其在線粒體上，這與擬南芥中的AtACP基因研究結(jié)果基本一致[11]。

近年來(lái)，大量的研究表明，ACP基因與脂肪酸合成有關(guān)，因此，研究其在種子的表達(dá)趨勢(shì)，對(duì)其功能的挖掘有重要的意義。組織特異性表達(dá)分析表明，BnACP5基因在甘藍(lán)型油菜種子發(fā)育過(guò)程中高度表達(dá)。由此表明，BnACP5基因可能與種子的發(fā)育有關(guān)。本研究中，BnACP5在15 d達(dá)到峰值，20 d下降，25～35 d呈上升趨勢(shì)，此后迅速下降，45 d表達(dá)量降到最低水平。在擬南芥[4]和芥菜[17]中研究發(fā)現(xiàn)，ACP超表達(dá)改變了不飽和脂肪酸所占的比例，但提高了種子的油酸(18∶1)和亞油酸(18∶2)含量。高建芹[21]、李成磊[22]等研究表明，在甘藍(lán)型油菜種子發(fā)育過(guò)程中的油酸(18∶1)與亞油酸(18∶2)呈極顯著負(fù)相關(guān)。油酸(18∶1)的含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；而亞油酸(18∶2)開(kāi)花后15 d含量最高，隨著角果的發(fā)育進(jìn)程含量下降。驗(yàn)證了本試驗(yàn)前期BnACP5表達(dá)量高，后期總體呈下降趨勢(shì)的結(jié)論。

本研究克隆了甘藍(lán)型油菜BnACP5基因，對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行了qPCR分析，這為后續(xù)開(kāi)展功能驗(yàn)證打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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