孔維龍，張康達(dá)，吳俊池，張麗平，潘 輝，唐嘉蔚，傅小鵬

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院，園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部華中都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070；2.北京百邁客生物科技有限公司，北京 101300)

MADS-box轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于動(dòng)物、植物和真菌中[1-3]，在植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)方面起重要作用，是研究最廣泛的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[4]。MADS-box轉(zhuǎn)錄因子在N端具有一個(gè)高度保守的MADS結(jié)構(gòu)域(MADS-box domain)，約由58～60個(gè)氨基酸組成，負(fù)責(zé)識(shí)別和綁定靶基因中調(diào)控區(qū)域的CArG盒[CC(A/T)6GG][5]。根據(jù)序列結(jié)構(gòu)，MADS-box轉(zhuǎn)錄因子可以分成type Ⅰ和type Ⅱ兩大類(lèi)。其中，type Ⅰ編碼一個(gè)SRF-like類(lèi)型的MADS域，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，僅含有1～2個(gè)外顯子，可進(jìn)一步劃分為Mα、Mβ、Mγ 3個(gè)組，其功能仍不清楚[1，6-9]。type Ⅱ編碼一個(gè)MEF2-like和MIKC-type類(lèi)型的MADS域，具有半保守的K盒(Keratin-like domain)和保守型較差的Ⅰ盒(Intervening domain)和C盒(C-terminal region)，可進(jìn)一步劃分為MIKCC和MIKC*2個(gè)組，與MIKCC組相比，MIKC*組有更不保守的K盒和更長(zhǎng)的I盒，在擬南芥和水稻中Mδ組相當(dāng)于MIKC*組[6-7，10]。MIKCC組基因可進(jìn)一步劃分為12個(gè)亞組，即AG、AGL6、AGL12、AP3/PI、GGM13、TM3、STMADS11、AGL2、AGL17、AP1/SQUA、AGL15和FLC[2]。隨著研究的不斷深入，MIKCC被重新分成13個(gè)亞組，即AG(C類(lèi)基因)、AGL6、AGL12、AP3-PI(B類(lèi)基因)、Bs、SOC1、SVP、SEP(E類(lèi)基因)、AGL17、AP1-FUL(A類(lèi)基因)、AGL15、FLC和TM8[9，11-16]。大量研究發(fā)現(xiàn)，MADS-box基因參與許多重要的生理和發(fā)育過(guò)程，如調(diào)節(jié)花器官和果實(shí)發(fā)育以及控制開(kāi)花時(shí)間和配子體細(xì)胞分裂[4，17-19]。調(diào)控光合作用和營(yíng)養(yǎng)代謝以及參與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑，與逆境脅迫相關(guān)[20-22]。

研究擬南芥和金魚(yú)草等模式植物發(fā)現(xiàn)，MADS-box轉(zhuǎn)錄因子參與生殖分生組織屬性決定和花器官發(fā)育，提出經(jīng)典的ABCDE花發(fā)育模型。A、E類(lèi)基因調(diào)控萼片發(fā)育，A、B、E類(lèi)基因共同調(diào)控花瓣發(fā)育，B、C、E類(lèi)基因共同調(diào)控雄蕊發(fā)育，C、E類(lèi)基因調(diào)控心皮發(fā)育，D、E類(lèi)基因調(diào)控胚珠發(fā)育[16，23]。ABCDE花發(fā)育模型相關(guān)基因，除了AP2(A類(lèi)基因)之外，其他都屬于MADS-box家族基因[24]。

目前，很多甜菜品種如紅葉甜菜、紅甜菜等，越來(lái)越多用于綠化與裝飾，但觀賞甜菜在栽培綠化過(guò)程中容易過(guò)早抽薹，同時(shí)易受到各種非生物脅迫的影響，嚴(yán)重影響了其觀賞壽命和觀賞效果。MADS-box轉(zhuǎn)錄因子參與花器官鑒定、生長(zhǎng)發(fā)育及影響種子發(fā)育，這對(duì)推遲觀賞甜菜開(kāi)花進(jìn)而延長(zhǎng)觀賞時(shí)限、改變育性及提升整體觀賞價(jià)值、提高觀賞甜菜逆境生理等多個(gè)方面均有重要作用。此外，石竹目觀賞花卉眾多，如香石竹、石竹和須苞石竹等，但是卻缺乏高質(zhì)量的基因和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，系統(tǒng)地研究MADS-box基因比較困難，改變、提升這些觀賞花卉的觀賞效果與抗性，只能借助于甜菜已發(fā)表的高質(zhì)量的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。此外，石竹目屬于基部雙子葉植物類(lèi)群，對(duì)其MADS-box家族的系統(tǒng)研究，也可進(jìn)一步闡明MADS-box家族基因的進(jìn)化。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析手段，基于已公開(kāi)的基因組及RNA-seq數(shù)據(jù)[25-27]，對(duì)甜菜MADS-box轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了全基因組鑒定，以期為進(jìn)一步解析MADS-box轉(zhuǎn)錄因子功能，以及通過(guò)基因工程手段改良觀賞甜菜觀賞性狀和提高逆境抗性奠定基礎(chǔ)。同時(shí)為石竹目觀賞花卉MADS-box基因的鑒定、進(jìn)化及基因功能研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

擬南芥MADS-box基因家族的氨基酸序列來(lái)自TAIR(http://www.arabidopsis.org/)；甜菜KWS2320參考基因組氨基酸序列、CDS序列和基因組序列均來(lái)源于AnnoBeet(http://genomforschung.uni-bielefeld.de/en/projects/annobeet)；MADS-box家族基因Pfam種子文件：SRF-TF結(jié)構(gòu)域信息(PF00319)來(lái)源于Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)；甜菜RNA-seq數(shù)據(jù)來(lái)自SRA(SRX287608-287615；SRX647324；SRX647712；SRX647714) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)。

其中，SRX287608-287615包括葉片、直根、花序、幼苗和種子RNA-seq數(shù)據(jù)，SRX647712為熱脅迫幼葉，SRX647714為鹽脅迫幼葉，SRX647324為對(duì)照幼葉[26]。RNA-seq測(cè)序用KWS2320植株生長(zhǎng)于沙灘，生長(zhǎng)溫度21 ℃，光照時(shí)間10 h/14 h，光照強(qiáng)度80～120 μmol/(m2·s)，相對(duì)濕度60%。測(cè)序樣品為花序、直根、葉片、種子，幼苗(20 ℃培養(yǎng)2 d的出芽苗)[25，27]。鹽脅迫處理為：植株全營(yíng)養(yǎng)液水培，23 d苗齡時(shí)轉(zhuǎn)入含50 mmol/L NaCl的全營(yíng)養(yǎng)液，每天增加50 mmol/L NaCl濃度，逐漸增加NaCl濃度到300 mmol/L，此后保持300 mmol/L NaCl全營(yíng)養(yǎng)液脅迫2 d，于第30天采取幼葉樣品(頂端第3，4片幼葉不含葉中脈)。熱脅迫為：植株全營(yíng)養(yǎng)液水培30 d，幼葉樣品采摘前進(jìn)行35 ℃高溫脅迫3 h。對(duì)照幼葉取材于全營(yíng)養(yǎng)水培30 d的植株。所有樣品使用Nucleospin RNA Plant kit試劑盒(Macherey-Nagel，德國(guó))提取RNA，利用Hiseq 1500測(cè)序儀進(jìn)行雙末端測(cè)序[25，27]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甜菜MADS-box家族基因的鑒定 使用hmm和Blast同源性搜索2種方法來(lái)鑒定MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，以PF00319為種子文件，借助HMMER 3.0軟件在甜菜氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源對(duì)比搜索，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)[5，10]。以擬南芥MADS-box氨基酸序列為種子序列，借助在線(xiàn)基因組BlastP在線(xiàn)工具再次搜索。去除重復(fù)序列后，利用Pfam和SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de/)對(duì)候選基因進(jìn)一步確認(rèn)，最終獲得甜菜MADS-box家族基因。

1.2.2 甜菜MADS-box家族基因的生物信息分析 甜菜MADS-box家族基因內(nèi)含子、外顯子和基因組定位信息均來(lái)自于甜菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，利用在線(xiàn)軟件GSDS2.0(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)繪制基因結(jié)構(gòu)圖，運(yùn)用MapInspect工具繪制染色體定位圖；利用在線(xiàn)軟件MEME(http：//meme-suite.org/tools/meme)對(duì)甜菜MADS-box蛋白進(jìn)行基序預(yù)測(cè)，參數(shù)中預(yù)測(cè)數(shù)目設(shè)置為10，其余參數(shù)均為默認(rèn)設(shè)置；利用MEGA 5.0軟件對(duì)甜菜MADS-box家族蛋白序列與擬南芥MADS-box蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，用鄰位(Neighbor-Joining)算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap重復(fù)1 000次；利用Plant-mPLoc server在線(xiàn)軟件(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)進(jìn)行各MADS-box基因的亞細(xì)胞定位分析；利用ProtParam在線(xiàn)程序(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)氨基酸序列分子量及等電點(diǎn)[4，28]。

1.2.3 甜菜MADS-box家族基因表達(dá)分析 利用RNA-seq數(shù)據(jù)分析甜菜MADS-box基因在不同組織(幼苗、直根、幼葉、葉、花序、種子)中的表達(dá)情況以及各MADS-box基因在鹽脅迫、熱脅迫下幼葉中的表達(dá)變化。具體方法：用HISAT2將reads比對(duì)到參考基因組上，用StringTie計(jì)算基因表達(dá)量，根據(jù)各基因表達(dá)量在各組織中的結(jié)果利用R語(yǔ)言作熱圖。計(jì)算熱、鹽脅迫下各基因相對(duì)表達(dá)量，相對(duì)表達(dá)量=log2(脅迫組表達(dá)量/對(duì)照組表達(dá)量)，計(jì)算結(jié)果作熱圖[27]。

1.2.4 甜菜MADS-box蛋白功能聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)分析 利用String蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//string-db.org/)中特異性比較高的蛋白模式對(duì)34個(gè)MADS蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。此外，將BvMADS19、BvMADS32蛋白序列提交至STRING網(wǎng)站，預(yù)測(cè)BvMADS19、BvMADS32蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。所有操作物種參數(shù)均選擇模式植物擬南芥[29-30]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜MADS-box家族基因的鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

共篩選得到34個(gè)甜菜MADS-box基因，MADS-box轉(zhuǎn)錄因子序列為66～1 061個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，分子量為7.63～119.43 ku，等電點(diǎn)為5.44～11.00，亞細(xì)胞定位顯示所有MADS-box基因均定位于細(xì)胞核上(表1)，表明雖然MADS-box轉(zhuǎn)錄因子理化性質(zhì)差異較大，但亞細(xì)胞定位十分保守。聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，MADS-box轉(zhuǎn)錄因子可分為type Ⅰ和type Ⅱ兩大類(lèi)，其中，type Ⅰ成員7個(gè)和type Ⅱ成員27個(gè)。根據(jù)進(jìn)化關(guān)系，type Ⅰ進(jìn)一步分為Mα(3)、Mβ(1)、Mγ(3)3個(gè)組(圖1)；type Ⅱ進(jìn)一步分為MIKCC(22)和MIKC*(5)2個(gè)組，MIKCC組可進(jìn)一步分為AG(2)、AGL12(2)、AP3-PI(4)、Bs(2)、SOC1(1)、SVP(1)、SEP(3)、AGL17(5)、AP1-FUL(1)和FLC(1) 10個(gè)亞組，無(wú)AGL6、AGL15、TM8亞組成員被發(fā)現(xiàn)(圖2)。

表1 甜菜MADS-box家族基因信息Tab.1 The information of MADS-box genes in Beta vulgaris

表1(續(xù))

圖1 甜菜和擬南芥MADS-box蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)(typeⅠ)Fig.1 Phylogenetic tree of beet and Arabidopsis MADS-box proteins(typeⅠ)

圖2 甜菜和擬南芥MADS-box蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)(type Ⅱ)Fig.2 Phylogenetic tree of beet and Arabidopsis MADS-box proteins(type Ⅱ)

2.2 甜菜MADS-box基因內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)分析

基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示(圖3)，甜菜MADS-box type Ⅱ基因外顯子數(shù)目具有高變異性(1～13個(gè)外顯子)，其中，AP3-PI亞組的BvMADS20具有13個(gè)外顯子，數(shù)量最多，區(qū)別于該亞組其他成員(外顯子為7個(gè))；AG亞組和FLC亞組含1～2外顯子，數(shù)量較少；AGL17亞組的BvMADS12只具有1個(gè)外顯子，區(qū)別于亞組內(nèi)其他成員(含有7～8個(gè)外顯子)。類(lèi)似地，MIKC*組內(nèi)成員外顯子含量普遍較高(不少于11個(gè))。表明即使同一組、甚至同一亞組類(lèi)，基因結(jié)構(gòu)差別也很大。相對(duì)于typeⅡ基因，MADS-box typeⅠ基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，只含有1個(gè)外顯子。

2.3 甜菜MADS-box基因染色體定位

染色體定位分析結(jié)果顯示(圖4)，MADS-box基因在各染色體上呈不均勻分布，在同一條染色體上的基因呈密集簇狀分布。其中，第6號(hào)染色體上分布最多，為9條；第1，9號(hào)染色體上分布次之，為7條；第3號(hào)染色體上分布4條；第4，5染色體上分別分布3，2條；第2，8染色體上各分布1條，第7號(hào)染色體無(wú)MADS-box基因分布。

2.4 甜菜MADS-box蛋白序列保守元件

分析保守元件預(yù)測(cè)結(jié)果(圖5)，發(fā)現(xiàn)Motif1為MADS盒，Motif2和Motif9為K盒，其他為未知盒。Motif1存在于所有的MADS-box蛋白序列類(lèi)，為MADS-box蛋白特征motif。Motif2存在于大部分MIKCC類(lèi)型的蛋白序列內(nèi)，但是不存在MIKC*類(lèi)型的蛋白序列內(nèi)。MIKC*類(lèi)型的蛋白序列除含有Motif1外，還具有其他組不具有的Motif3、4、5、7、8、9、10。Motif6僅出現(xiàn)在SEP亞組中，為該亞組所特有。

2.5 甜菜MADS-box基因的表達(dá)分析

RNA-seq數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示(圖6)，大部分MADS-box基因優(yōu)勢(shì)表達(dá)于花序分生組織，且在花序分生組織中typeⅡ基因表達(dá)量高于typeⅠ，MIKCC組基因表達(dá)量普遍高于MIKC*組。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)量最顯著的是typeⅡ基因成員中A、B、C、E類(lèi)花發(fā)育相關(guān)基因，如SEP亞組(E類(lèi)基因)的BvMADS1、BvMADS2、BvMADS3；AP1-FUL亞組(A類(lèi)基因)的BvMADS4；AG亞組(C類(lèi)基因)的BvMADS6，AP3-PI亞組(B類(lèi)基因)的BvMADS17、BvMADS18、BvMADS19。而C類(lèi)基因BvMADS5和B類(lèi)基因BvMADS20表達(dá)并不是很高。除此之外，AGL12亞組基因亦有較高表達(dá)量。BvMADS3基因區(qū)別于其他2個(gè)E類(lèi)基因(BvMADS1、BvMADS2)，在葉、幼葉與種子中也有較高表達(dá)，表明其可能參與種子發(fā)育和葉片生理活動(dòng)。BvMADS8在幼嫩組織(幼苗、幼葉)和種子中表達(dá)高于其他組織，表明可能其在分生組織、細(xì)胞增殖分化方面扮演重要角色，同時(shí)與種子成熟發(fā)育有關(guān)。BvMADS14與BvMADS8表達(dá)模式類(lèi)似，但其在根中亦有較高表達(dá)，表明其可能在根的生理活動(dòng)中起一定作用。BvMADS18優(yōu)勢(shì)表達(dá)于花序和種子，暗示其可能參與從花發(fā)育到果實(shí)成熟的全過(guò)程。MIKC*組的BvMADS23特異表達(dá)于直根，可能與直根發(fā)育有關(guān)。type Ⅰ基因普遍表達(dá)量極低，只有極個(gè)別基因在某些組織中有較高表達(dá)。如BvMADS29優(yōu)勢(shì)表達(dá)于幼苗和種子，該基因可能與苗期生長(zhǎng)與種子發(fā)育密切相關(guān)。

圖3 甜菜MADS-box內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)Fig.3 Intron and exon structure of beet MADS-box genes

圖4 甜菜MADS-box基因染色體定位Fig.4 Chromosome location of beet MADS-box genes

分析脅迫幼葉RNA-seq發(fā)現(xiàn)(圖6)，響應(yīng)鹽脅迫、熱脅迫的MADS-box基因極少，只有BvMADS8和BvMADS12響應(yīng)鹽脅迫而輕微上調(diào)，BvMADS8、BvMADS19、BvMADS32響應(yīng)熱脅迫而輕微上調(diào)。表明MADS-box基因也起作用于熱、鹽脅迫調(diào)控路徑。AP3-PI亞組(BvMADS19)不僅對(duì)花發(fā)育有調(diào)控作用，也在逆境生理調(diào)控過(guò)程中起作用，Mγ組個(gè)別基因(BvMADS32)與甜菜抵御外界熱脅迫密切相關(guān)。

圖5 甜菜MADS-box蛋白保守元件預(yù)測(cè)Fig.5 Conserved element prediction of beet MADS-box proteins

2.6 MADS-box蛋白功能聯(lián)系預(yù)測(cè)

利用String蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)的蛋白(Protein)模式對(duì)甜菜MADS-box蛋白之間的功能關(guān)系進(jìn)行了分析預(yù)測(cè)(圖7)。從圖7可以看出，typeⅡ基因形成一個(gè)聯(lián)系密切的關(guān)系網(wǎng)，B類(lèi)基因(AP3、PI)、C類(lèi)基因(AG、SHP1)、E類(lèi)基因(SEP2、SEP3)、AGL17亞組的(AGL16、AGL21、AGL44)以及SVP亞組的SVP形成彼此密切聯(lián)系的互作網(wǎng)絡(luò)，說(shuō)明以A、B、C、D、E類(lèi)基因?yàn)榛A(chǔ)的花發(fā)育模型基因，與MADS-box基因家族內(nèi)的其他基因共同作用調(diào)控植物花發(fā)育。推測(cè)甜菜中對(duì)應(yīng)的MADS-box蛋白也存在類(lèi)似的調(diào)控網(wǎng)路。此外，MIKC*組AGL104與AGL65也彼此互作，type Ⅰ基因AGL62、AGL80與AGL30存在線(xiàn)性互作關(guān)系。

為了探究BvMADS19與BvMADS32響應(yīng)熱脅迫的根源，驗(yàn)證RNA-seq分析結(jié)果，對(duì)這2個(gè)蛋白進(jìn)行了單獨(dú)的String蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(圖7)。BvMADS19共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)顯示，BvMADS19蛋白與MADS-box蛋白AP1、AP3、AG、SEP3和SEP1存在較強(qiáng)的蛋白互作，與TRP-like蛋白也存在強(qiáng)互作關(guān)系，與MADS-box蛋白AP2存在弱強(qiáng)度互作。此外，與CO、LFY、UFO轉(zhuǎn)錄因子存在一定互作。表明MADS-box基因在控制花發(fā)育的過(guò)程中存在協(xié)同作用。BvMADS19屬于AP3-PI亞組(B類(lèi))，與A類(lèi)(AP1、AP2)、C類(lèi)(AG)以及E類(lèi)(SEP1、SEP3)均發(fā)生強(qiáng)互作，符合ABCDE花發(fā)育模型理論。TRP-like蛋白把這些蛋白聯(lián)合在一起，有強(qiáng)互作關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，此基序通過(guò)形成特殊的空間結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)蛋白質(zhì)的相互作用，并在一些重要的蛋白復(fù)合物形成中非常重要[31]，推測(cè)TRP-like蛋白在MADS-box互作模型中起重要粘連作用。CO是光周期途徑中的關(guān)鍵基因，位于生物鐘的輸出途徑，參與長(zhǎng)日照植物開(kāi)花途徑，受生物鐘調(diào)控。此外，CO還調(diào)節(jié)P5CS2和ACS10基因，這2個(gè)基因參與脯氨酸和乙烯生物合成[32]，推測(cè)BvMADS19通過(guò)與CO互作，也參與植物光周期調(diào)控路徑，此外，其對(duì)熱脅迫的響應(yīng)可能是由于與CO蛋白互作，影響了脯氨酸和乙烯的合成。LFY是調(diào)控開(kāi)花及花發(fā)育的關(guān)鍵因子，起著聯(lián)系環(huán)境信號(hào)和激活下游基因的樞紐作用，激活B類(lèi)基因AP3和PI表達(dá)，控制花瓣和雄蕊的形成[33-34]。UFO作為輔助因子，和LFY基因一起激活B類(lèi)基因的表達(dá)[35]。BvMADS19亦屬于PI基因，推測(cè)在甜菜中同樣受LFY、UFO的調(diào)控，控制花瓣和雄蕊形成。

圖6 甜菜MADS-box基因表達(dá)譜Fig.6 Expression profile of MADS-box genes

A.MADS-box蛋白功能聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)；B.BvMADS19和MADS32蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。A.MADS-box protein function link network; B.BvMADS19 and MADS32 protein co-expression network.

Mγ組的BvMADS32與屬于Mα組的AGL23、AGL61、AGL62存在蛋白互作，與組蛋白脫乙酰化酶HDA05、HDA08、HDA14、HDA15和HDA18存在蛋白互作，此外還與TRP-like蛋白以及一個(gè)未知蛋白互作(圖7)。暗示type Ⅰ基因之間也存在蛋白互作，但是功能至今還不明確。在擬南芥中，HDA蛋白參與多種生物過(guò)程，包括調(diào)控鹽脅迫、開(kāi)花時(shí)間、免疫響應(yīng)、ABA、SA、油菜素內(nèi)酯和干旱響應(yīng)等方面[36]。在鹽、高溫、低溫脅迫下蘋(píng)果也會(huì)改變HDA基因表達(dá)水平來(lái)抵抗脅迫[37]。結(jié)合BvMADS32表達(dá)量也受熱脅迫而上調(diào)的表達(dá)譜分析，BvMADS32可能與HAD蛋白共同作用進(jìn)而提高甜菜熱抗性。

3 討論

甜菜屬于真雙子葉植物的基部類(lèi)群，對(duì)其MADS-box轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)的鑒定，填補(bǔ)了被子植物到核心雙子葉植物MADS-box轉(zhuǎn)錄因子無(wú)人報(bào)道的空缺。本研究共鑒定出34個(gè)甜菜MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，不存在組缺失的情況，但無(wú)AGL6、AGL15、TM8亞組成員。甜菜MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量多于低等植株江南卷柏(19個(gè))、小立碗蘚(24個(gè))[38-40]，但遠(yuǎn)少于核心雙子葉植物擬南芥(108個(gè))、楊樹(shù)(105)、番茄(95)、白菜(160)[9，14，41-42]。究其原因，發(fā)現(xiàn)數(shù)目較多的這些物種均屬高等植物，都經(jīng)歷過(guò)基因重復(fù)事件，包括全基因組復(fù)制、串聯(lián)復(fù)制和片段復(fù)制。如白菜在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷六倍體階段，由全基因組復(fù)制事件產(chǎn)生3個(gè)亞基因組，導(dǎo)致白菜大量基因發(fā)生擴(kuò)張[42]。相比于其他植物，甜菜進(jìn)化地位相對(duì)保守，沒(méi)有經(jīng)歷過(guò)全基因組復(fù)制，所以，MADS-box轉(zhuǎn)錄因子相對(duì)較少，更接近于低等物種。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示，甜菜各組齊全，比低等物種亞組多，但相比于擬南芥、水稻、葡萄等高等植物，卻缺失AGL6、AGL15、TM8亞組。表明在石竹目被分出來(lái)之前，MADS-box基因就完成了目前組的劃分，部分亞組是在后期進(jìn)化逐漸形成的。

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)對(duì)甜菜MADS-box基因進(jìn)行分類(lèi)，比較基因結(jié)構(gòu)和保守元件發(fā)現(xiàn)，即使同一亞組內(nèi)基因結(jié)構(gòu)也差別較大；但是MEME模體分析結(jié)構(gòu)顯示，同一亞組各基因翻譯出的蛋白質(zhì)具有類(lèi)似的Motif。結(jié)合表達(dá)結(jié)果來(lái)看，同一亞組內(nèi)的基因多具有一致的表達(dá)模式，但是也有部分基因表達(dá)模式展示出差異。如AG亞組的BvMADS5和BvMADS6，AP3-PI亞組的BvMADS17、BvMADS18、BvMADS19和BvMADS20。表明在進(jìn)化的過(guò)程中同一起源的旁系基因在表達(dá)時(shí)空特性上發(fā)生趨異分化現(xiàn)象，這可能是由同一起源的旁系基因避免功能冗余，產(chǎn)生亞功能和新功能的內(nèi)在需要導(dǎo)致的。

分析MADS-box基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)甜菜MADS-box基因主要作用于花序分生組織，但是部分MADS-box基因在幼嫩組織、種子、果實(shí)發(fā)育中發(fā)揮重要作用，如BvMADS8、BvMADS14、BvMADS18和BvMADS29。部分MADS-box基因在參與根和葉發(fā)育或生理活動(dòng)，如BvMADS3、BvMADS7、BvMADS14、BvMADS23?？梢?jiàn)，MADS-box家族基因表達(dá)于各個(gè)組織，作用廣泛，對(duì)生長(zhǎng)和發(fā)育都有重要作用。大量研究也證實(shí)了以上猜測(cè)，如番茄MADS-box基因TAGL1影響果皮角質(zhì)層形成[43]；葡萄部分MADS-box基因與胚珠敗育相關(guān)[44]；香蕉MaMADS7參與乙烯合成路徑，對(duì)果實(shí)成熟有重要作用[45]；日本梨PpMADS13-1與種子休眠相關(guān)[46]；脅迫表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，BvMADS19、BvMADS32響應(yīng)熱脅迫而上調(diào)表達(dá)，表明對(duì)脅迫也有重要作用，可以提高甜菜逆境生理。類(lèi)似地，在矮牽牛中也發(fā)現(xiàn)一個(gè)MADS-box基因PMADS9與逆境脅迫相關(guān)。

蛋白功能聯(lián)系預(yù)測(cè)表明，MADS-box基因之間通過(guò)協(xié)同作用來(lái)調(diào)控花發(fā)育，這與大部分MADS-box集中在花序分生組織中優(yōu)勢(shì)表達(dá)RNA-seq分析結(jié)果相吻合。BvMADS19、BvMADS32熱抗性功能被表達(dá)譜和蛋白共表達(dá)分析網(wǎng)絡(luò)所證實(shí)，其抗性功能源于與HDA或CO蛋白互作，影響脯氨酸和乙烯等物質(zhì)含量。本結(jié)果為進(jìn)一步研究MADS-box基因的特點(diǎn)及其在調(diào)控觀賞甜菜花器官發(fā)育、逆境抗性中的作用奠定基礎(chǔ)。

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