郭兆來，白學(xué)貴，李昆志，徐慧妮

(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

一氧化氮(Nitric oxide，NO)是一種在植物生長發(fā)育及脅迫應(yīng)答等方面發(fā)揮重要作用的氣體信號分子[1-7]。低濃度的NO傳導(dǎo)脅迫信號保護植物免受傷害，高濃度的NO具有很強的自由基活性，可以引起一些毒性效應(yīng)。在細胞內(nèi)NO基團可以轉(zhuǎn)移到靶蛋白的巰基上，形成S-亞硝基硫醇(Nitrosthiols，SNOs)，這個過程被稱為S-亞硝基化(S-nitrosylation)[8]。越來越多的證據(jù)表明，蛋白質(zhì)S-亞硝基化是NO發(fā)揮生物活性的主要機制[9-10]。

NO可以與體內(nèi)主要的抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)生成S-亞硝基谷胱甘肽(GSNO)。S-亞硝基谷胱甘肽還原酶(GSNOR)，以前也被命名為還原型谷胱甘肽依賴型甲醛脫氫酶，屬于醇脫氫酶Ⅲ類(ADH3)家族，普遍存在于所有生物中[11]。GSNOR通過促進GSNO代謝、降低NO的生物活性以間接調(diào)控蛋白亞硝基化的水平，進而參與植物生長發(fā)育、氣孔信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、病原菌抵御、高溫耐受性等多種生理過程[12-15]。低溫、高溫、連續(xù)光照、連續(xù)黑暗以及機械傷害處理下豌豆和向日葵中的GSNOR活性降低[16]，砷脅迫下擬南芥中GSNOR活性增加，而鎘脅迫下豌豆葉片GSNOR活性降低，并伴隨NO和GSH含量降低[17]，表明不同的植物受到的脅迫不同，GSNOR活性可能不同，而GSNOR在菠菜中是否存在以及其功能如何未見報道。

為了獲得菠菜中的GSNOR基因序列，通過對已有物種的GSNOR序列分析，設(shè)計兼并引物，采用RT-PCR和RACE技術(shù)獲得菠菜GSNOR基因全長cDNA序列，并命名為SoGSNOR，將SoGSNOR編碼區(qū)重組到pET32a原核表達載體，誘導(dǎo)獲得純化蛋白并制備多克隆抗體，為進一步研究SoGSNOR在菠菜中的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑

基因克隆、電泳檢測、目的片段回收、載體構(gòu)建所用到的分子試劑為大連寶生物公司產(chǎn)品。蛋白純化試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；Western Blot所用試劑為康為世紀生物科技有限公司產(chǎn)品。本研究中所用引物均由上海捷瑞生物公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1SoGSNOR基因的克隆為了克隆菠菜的GSNOR基因，首先在NCBI網(wǎng)站比對其他物種GSNOR基因的同源序列，設(shè)計兼并引物，F(xiàn)1：ATGGC(T/A/G)AC(T/A)CAAGG(C/T)(C/A)A(A/G)GT(C/T/A)AT和R1：CCACC(A/G)AAAGC(T/A)GT(T/A)CC(T/C)TTCC，R2：CT(A/G)TA(G/A)TCAAC(T/A)CC(G/A/T)CCATC(T/A)GT。先用F1和R1進行第1輪擴增，反應(yīng)條件為 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共20個循環(huán)；最后一次循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min。將擴增產(chǎn)物稀釋10倍后用引物F1和R2進行第2輪擴增，反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s， 30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min?；厥漳康臈l帶，連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒進行PCR和酶切檢測，測序獲得基因的5′端序列。根據(jù)獲得的基因序列，利用3′RACE獲得基因的3′端序列。設(shè)計引物F2：TTTGGTCTTGGAACTGTAGG和F3：GTGGTGTATCTACGGGTCT，下游引物為B26：GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTT

TT。反應(yīng)條件與5′端克隆一樣進行巢式PCR，以F2 和B26引物擴增后的產(chǎn)物為模板，利用F3 和B26進行第2輪擴增。然后根據(jù)所得到的序列設(shè)計特異的全長和原核表達載體構(gòu)建引物SoGSNOR-F-BamHⅠ：ggatccATGGCGACACAAGGCCAAG和SoGSNOR-R-XholⅠ：ctcgagTGGTTGATTTATTCATGCGC(小寫字母為酶切位點)進行PCR擴增，得到SoGSNOR基因編碼區(qū)序列。

1.2.2 原核表達載體pET32a-SoGSNOR的構(gòu)建 將pMD18T-SoGSNOR質(zhì)粒和原核表達載體pET32a質(zhì)粒用BamH Ⅰ和XholⅠ進行雙酶切，將回收的SoGSNOR片段與酶切后pET32a空載體用T4DNA連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，測序，判斷所插入的序列是否正確。

1.2.3 SoGSNOR重組蛋白的原核表達 測序正確后的pET32a-SoGSNOR質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，根據(jù)郭兆來等[18]方法進行原核表達，SDS-PAGE檢測SoGSNOR重組蛋白的表達情況。

1.2.4 pET32a-SoGSNOR融合蛋白的純化及多克隆抗體的制備 首先對蛋白表達條件進行優(yōu)化，然后對大量培養(yǎng)的含pET32a-SoGSNOR的表達菌株進行誘導(dǎo)，離心回收沉淀，超聲波破碎5 min，粗裂解液經(jīng)10 000 r/min離心15 min，收集上清液，利用Ni2+NTA親和柱按照說明書純化回收目的蛋白，最后進行SDS-PAGE分析。用純化得到的融合蛋白為抗原，免疫昆明小鼠獲得抗血清。

1.2.5 Western Blot檢測SoGSNOR多克隆抗體 將誘導(dǎo)后的原核表達樣品蛋白進行SDS-PAGE電泳后，經(jīng)Biorad電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)膜進行Western Blot 操作，具體步驟根據(jù)郭兆來等[18]方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 SoGSNOR的克隆及序列分析

根據(jù)其他物種的GSNOR基因序列，設(shè)計兼并引物，通過RT-PCR和3′RACE技術(shù)擴增菠菜SoGSNOR的編碼框(ORF)序列(圖1)。通過5′端的克隆，獲得了780 bp的片段(圖1-A)，通過3′端的克隆，獲得850 bp的片段。在拼接序列兩端設(shè)計特異引物SoGSNOR-F-BamH Ⅰ和SoGSNOR-R-Xhol Ⅰ進行PCR擴增(圖1-C)，測序序列與基因的3′端和5′端拼接的結(jié)果一致，確定該3′端和5′端為同一基因的兩段序列。

SoGSNORcDNA序列全長1 378 bp，編碼框1 140 bp，編碼379個氨基酸(圖2)，預(yù)測分子量為40.7 ku，等電點為6.82。將序列在NCBI網(wǎng)站注冊，獲得GenBank登錄號為KR381778。

Marker.DNA ladder Marker.

2.2 pET32a-SoGSNOR原核表達載體的構(gòu)建

提取pMD18T-SoGSNOR和原核表達載體pET32a

的質(zhì)粒，利用BamH Ⅰ和Xhol Ⅰ進行雙酶切、回收目的片段，連接，獲得重組載體pET32a-SoGSNOR。將重組載體質(zhì)粒進行BamH Ⅰ和Xhol Ⅰ雙酶切，從圖3可以看出，可切出目的條帶。此外，測序結(jié)果也表明原核表達載體pET32a-SoGSNOR成功構(gòu)建。

2.3 pET32a-SoGSNOR原核表達

將構(gòu)建好的pET32a-SoGSNOR原核表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。分別在16，28，37 ℃將含有pET32a-SoGSNOR菌株用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)0，2，4，6，8 h后，SDS-PAGE分析大腸桿菌總蛋白的表達情況。如圖4所示，重組質(zhì)粒pET32a-SoGSNOR在接近66.2 ku處表達出1條特異蛋白條帶，且在16 ℃時，其表達量在0～8 h內(nèi)隨處理時間的增加而增加。

圖2 SoGSNOR cDNA序列及其編碼的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of the SoGSNOR

圖3 pET32a-SoGSNOR重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.3 The restriction endonuclease digestof pET32a-SoGSNOR plasmid

Marker.蛋白Marker。Marker.Protein molecular weight Marker.

2.4 pET32a-SoGSNOR原核表達蛋白的純化

以16 ℃為誘導(dǎo)溫度，用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)擴大培養(yǎng)的pET32a-SoGSNOR菌株后超聲波處理，分別收集上清液和沉淀。SDS-PAGE分析表明，上清液和沉淀中均有目的蛋白的表達。利用Ni2+NTA親和柱對上清液進行純化，用10，200 mmol/L的咪唑洗脫液洗脫，如圖5所示，SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)200 mmol/L的咪唑洗脫液洗脫后，有1條單一條帶，大小約為65 ku，表明獲得了純化的SoGSNOR蛋白。

Marker.蛋白Marker；Wash1.第1次10 mmol/L咪唑洗脫；Wash2.第2次10 mmol/L咪唑洗脫；Elution1.第1次200 mmol/L咪唑洗脫；Elution2.第2次200 mmol/L咪唑洗脫。

Marker.Protein molecular weight Marker; Wash1，2.The fraction was eluted with 10 mmol/L imidazole Buffer for the first and second time; Elution 1，2.The fraction was eluted with 200 mmol/L imidazole Buffer for the first and second time.

圖5pET32a-SoGSNOR融合蛋白的純化分析
Fig.5TheanalysisofpurifiedSoGSNORfusionprotein

2.5 Western Blot檢測SoGSNOR多克隆抗體

為了檢測SoGSNOR抗體的特異性和靈敏度，對pET32a-SoGSNOR原核表達菌體總蛋白、純化的蛋白進行Western Blot檢測(圖6)，結(jié)果顯示均出現(xiàn)一條條帶，大小與蛋白一致。多克隆抗體的效價較高，抗體稀釋倍數(shù)可以達到1∶10 000，為SoGSNOR蛋白功能研究提供了可靠的抗體，可以用于后續(xù)試驗。

1.原核表達總蛋白；2.純化后的原核表達蛋白。1.The crude protein of pET32a-SoGSNOR;2.The purified protein of pET32a-SoGSNOR.

3 討論

GSNOR在植物界廣泛存在，前人已經(jīng)在擬南芥[11]、豌豆[17，19]、玉米[20]、水稻[21]、向日葵[22]、辣椒[23]和番茄[15]等發(fā)現(xiàn)GSNOR。李國鈞[24]分別從水稻和番茄中克隆GSNOR基因OsGSNOR1和LeGSNOR1。馬沅和陳放[25]克隆了麻風(fēng)樹JcGSNOR的全長序列，發(fā)現(xiàn)其在麻風(fēng)樹根、莖、葉及種子中均有表達，并在各部位持續(xù)表達可能是為維持體內(nèi)NO在無害水平。本試驗利用RT-PCR和RACE技術(shù)首次獲得菠菜GSNOR基因的全長序列，編碼框1 140 bp，編碼379個氨基酸。

GSNOR參與植物生長發(fā)育、抵御生物和非生物脅迫等多種生理過程。擬南芥GSNOR完全缺失突變體表現(xiàn)出極度缺乏側(cè)根原基，且回補系能完全恢復(fù)突變體的側(cè)根表型[26]。番茄GSNOR調(diào)控的氧化還原信號控制番茄對堿脅迫的應(yīng)答[27]。鹽脅迫下向日葵中S-亞硝基還原酶活性降低[28]。初叢[29]研究發(fā)現(xiàn)煙草屬的GSNOR1是煙草細胞死亡的負調(diào)控因子。GSNOR介導(dǎo)的去亞硝基化改變生長素信號和生長素的運輸，是gsnor1-3突變體植物表型的主要原因[30]。菠菜GSNOR的表達特性和功能需要進一步研究。

大腸桿菌原核表達系統(tǒng)制備重組蛋白質(zhì)具備很多優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于植物蛋白表達研究中[31]。本研究在大腸桿菌中高效表達了SoGSNOR蛋白，通過Ni2+NTA親和層析法獲得純化的目的蛋白，將該蛋白免疫小鼠制備了多克隆抗體。利用Western Blot分析發(fā)現(xiàn)，制備的多克隆抗體可以和抗原特異結(jié)合，表明成功制備了SoGSNOR的多克隆抗體，為后續(xù)進一步研究SoGSNOR的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

[1] Beligni M V，Lamattina L.Nitric oxide stimulates seed germination and de-etiolation，and inhibits hypocotyl elongation，three light-inducible responses in plants[J].Planta，2000，210(2)：211-215.

[2] He Y，Tang R H，Hao Y，et al.Nitric oxide represses theArabidopsisfloral transition[J].Science，2004，305(5692)：1968-1971.

[3] Manoli A，Begheldo M，Genre A，et al.NO homeostasis is a key regulator of early nitrate perception and root elongation in maize[J].Journal of Experimental Botany，2014，65(1)：185-200.

[4] Ziogas V，Tanou G，Belghazi M，et al.Roles of sodium hydrosulfide and sodium nitroprusside as priming molecules during drought acclimation in citrus plants[J].Plant Molecular Biology，2015，89(4/5)：433-450.

[5] Silveira N M，Hancock J T，F(xiàn)rungillo L A，et al.Evidence towards the involvement of nitric oxide in drought tolerance of sugarcane[J].Plant Physiology and Biochemistry，2017，115：354-359.

[6] Yun B W，Skelly M J，Yin M H，et al.Nitric oxide and S-nitrosoglutathione function additively during plant immunity[J].New Phytologist，2016，211(2)：516-526.

[7] Chen X，Tian D，Kong X，et al.The role of nitric oxide signalling in response to salt stress inChlamydomonasreinhardtii[J].Planta，2016，244(3)：651-669.

[8] Liu L M，Hausladen A，Zeng M，et al.A metabolic enzyme for S-nitrosothiol conserved from bacteria to humans[J].Nature，2001，410(6827)：490-494.

[9] Besson-Bard A，Pugin A，Wendehenne D.New insights into nitric oxide signaling in plants[J].Annual Review of Plant Biology，2008，59：21-39.

[10] Lin A，Wang Y，Tang J，et al.Nitric oxide and protein S-nitrosylation are integral to Hydrogen peroxide-induced leaf cell death in rice[J].Plant Physiology，2012，158(1)：451-464.

[11] Martinez M C，Achkor H，Persson B，et al.Arabidopsisformaldehyde dehydrogenase-Molecular properties of plant class Ⅲ alcohol dehydrogenase provide further insights into the origins，structure and function of plant class P and liver class Ⅰ alcohol dehydrogenases[J].European Journal of Biochemistry / FEBS，1996，241(3)：849-857.

[12] Ticha T，Cincalova L，Kopecny D，et al.Characterization of S-nitrosoglutathionereductase fromBrassicaandLactucaspp.and its modulation during plant development[J].Nitric Oxide，2017，68：68-76.

[13] Wang P C，Du Y Y，Hou Y J，et al.Nitric oxide negatively regulates abscisic acid signaling in guard cells by S-nitrosylation of OST1[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2015，112(2)：613-618.

[14] 張 揚.番茄S-亞硝基谷胱甘肽還原酶基因SlGSNOR沉默對番茄高溫抗性的影響[D].杭州：浙江大學(xué)，2013.

[16] Chaki M，Valderrama R，F(xiàn)ernández-Ocaňa A M，et al.Mechanical wounding induces a nitrosative stress by down-regulation of GSNO reductase and an increase in S-nitrosothiols in sunflower(Helianthusannuus)seedlings[J].Journal of Experimental Botany，2011，62(6)：1803-1813.

[17] Barroso J B，Corpas F J，Carreras A，et al.Localization of S-nitrosoglutathione and expression of S-nitrosoglutathionereductase in pea plants under cadmium stress[J].Journal of Experimental Botany，2006，57(8)：1785-1893.

[18] 郭兆來，白學(xué)貴，嚴金平，等.菠菜SoHb基因的原核表達及功能分析[J].中國生物工程雜志，2015，35(4)：54-59.

[19] Shafqat J，Elahmad M，Danielsson O，et al.Pea formaldehyde-active class Ⅲ alcohol dehydrogenase：Common derivation of the plant and animal forms but not of the corresponding ethanol-active forms (classes Ⅰ and P) [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1996，93(11)：5595-5599.

[20] Fliegmann J，Sandermann H J.Maize glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase cDNA：a novel plant gene of detoxification[J].Plant Molecular Biology，1997，34(6)：843-854.

[21] Dolferus R，Osterman J C，Peacock W J，et al.Cloning of the arabidopsis and rice formaldehyde dehydrogenase genes：implications for the origin of plant ADH enzymes[J].Genetics，1997，146(3)：1131-1141.

[22] Chaki M，F(xiàn)ernandez-Ocana A M，Valderrama R A，et al.Involvement of reactive nitrogen and oxygen species (RNS and ROS) in sunflower mildew interaction[J].Plant and Cell Physiology，2009，50(2)：265-279.

[23] Airaki M，Leterrier M，Mateos R M，et al.Metabolism of reactive oxygen species and reactive nitrogen species in pepper (CapsicumannuumL.) plants under low temperature stress[J].Plant Cell and Environment，2012，35(2)：281-295.

[24] 李國鈞.水稻和番茄S-亞硝基谷胱甘肽還原酶基因的克隆鑒定與生化功能分析[D].杭州：浙江大學(xué)，2007.

[25] 馬 沅，陳 放.麻瘋樹亞硝基谷胱甘肽還原酶(JcGSNOR)的克隆與功能分析[J].四川大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2013，50(6)：1355-1362.

[26] 孫艷艷.GSNOR在擬南芥?zhèn)雀l(fā)育中的調(diào)控機理[D].蘭州：蘭州大學(xué)，2015.

[27] Gong B，Wen D，Wang X，et al.S-nitrosoglutathione reductase-modulated redox signaling controls sodic alkaline stress responses inSolanumlycopersicumL.[J].Plant & Cell Physiology，2015，56(4)：790-802.

[28] Jain P，Von T C，Lindermayr C，et al.S-nitrosylation/denitrosylation as a regulatory mechanism of salt stress sensing in sunflower seedlings[J].Physiologia Plantarum,2018,162(1):49-72.

[29] 初 叢.煙草屬亞硝基谷胱甘肽還原酶在調(diào)控細胞死亡中作用的研究[D].金華：浙江師范大學(xué)，2015.

[30] Shi Y F，Wang D L，Wang C，et al.Loss of GSNOR1 function leads to compromised auxin signaling and polar auxin transport[J].Molecular Plant，2015，8(9)：1350-1365.

[31] 劉曉慶，徐照龍，許 玲，等.大豆GmNAC8基因克隆與原核表達[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，29(4)：734-737.