尹 國(guó)，路正營(yíng)，李世云，韓永亮，張朝軍，李付廣

(1.邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河北 邯鄲 056001；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 棉花研究所，河南 安陽 455000)

棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生是棉花轉(zhuǎn)基因工程中的重點(diǎn)和難點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)研究對(duì)促進(jìn)棉花遺傳工程改良具有極其重要的意義[1]。進(jìn)一步研究棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生時(shí)相關(guān)調(diào)控因子發(fā)揮的作用，對(duì)陸地棉體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中特異表達(dá)的特定基因沉默或者超表達(dá)，可在一定程度上提高或降低棉花體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)率，提高棉花遺傳轉(zhuǎn)化的速度與規(guī)模，進(jìn)而加速棉花遺傳育種進(jìn)程，這對(duì)于突破棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生對(duì)基因型的依賴，擴(kuò)大種質(zhì)資源創(chuàng)制速度和利用范圍，加速棉花遺傳改良具有重大意義[2-3]。棉花胚胎發(fā)生率及植株再生率低在很大程度上限制了棉花轉(zhuǎn)基因工程的進(jìn)程。王志才等[4]從棉花高體胚能力種子的選育、高質(zhì)量外植體的制備及愈傷組織的誘導(dǎo)、激素和調(diào)節(jié)物質(zhì)的選擇、畸形胚的發(fā)生和控制等多個(gè)方面系統(tǒng)分析了棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生中多種因素。王彥霞等[5]也對(duì)影響棉花幼胚(珠)離體培養(yǎng)及植株建成的因素進(jìn)行了系統(tǒng)分析。目前，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所李付廣研究員的科研團(tuán)隊(duì)已成功攻克了限制棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的外部因素[6-7]，例如培養(yǎng)基的種類和激素水平等，但是對(duì)于陸地棉體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)過程內(nèi)在因素所發(fā)揮的分子機(jī)制的研究仍然較少。武秀明[8]以中棉所24的高分化率株系W10為材料，通過抑制性消減雜交法構(gòu)建了棉花愈傷組織的抑制性消減雜交文庫，即SSH文庫(Suppression subtractive hybridization，SSH)，包含368個(gè)差異表達(dá)的ESTs(Expressed sequence tags)，部分ESTs與棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生密切相關(guān)。但是，使用常規(guī)手段對(duì)海量ESTs進(jìn)行正向探索是一項(xiàng)相當(dāng)復(fù)雜的工程。RNAi(RNA interference)干涉作為一種高效易于操作、試驗(yàn)結(jié)果易于顯現(xiàn)的新技術(shù)，為研究海量ESTs提供了有效的實(shí)用方法[9-14]。當(dāng)前，利用RNAi技術(shù)對(duì)特定基因的表達(dá)進(jìn)行干涉已逐漸成為轉(zhuǎn)基因研究的熱點(diǎn)[15-19]。其中，以EST-SSR標(biāo)記為代表的新技術(shù)的成功利用，使得我們對(duì)于植物的微觀世界有了更進(jìn)一步的了解[20-24]。

本研究采用RNAi技術(shù)，篩選武秀明[8]構(gòu)建的SSH文庫中在棉花愈傷組織分化過程中上調(diào)表達(dá)的4個(gè)ESTs[25-28]。利用pCRI1210雙元表達(dá)載體，構(gòu)建針對(duì)這4個(gè)ESTs的干涉載體，以棉花無菌苗下胚軸切段為受體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化pCRI1210-EST干涉載體，通過在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行分化，從而研究這4個(gè)ESTs對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。研究結(jié)果可為分離棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)基因提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

棉花種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供，來自于中24篩選出的體細(xì)胞胚胎分化率較高的株系W10。所用載體pCRI1210、根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404和ESTs由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所李付廣老師提供，購自天根生物制品公司。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞和連接酶等生物制劑，購自TaKaRa公司。其他化學(xué)藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 引物和測(cè)序

測(cè)序工作由深圳華大基因科技有限公司完成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 ESTs的選擇 本研究挑選了SSH文庫中4個(gè)在體細(xì)胞胚胎分化過程中上調(diào)表達(dá)的ESTs，文庫編號(hào)分別為rmhcya0_000418、rmhcya0_000447、rmhcya0_000496、rmhcya0_000653(以下簡(jiǎn)稱418、447、496和653)，各ESTs信息如表1所示。

表1 ESTs信息表Tab.1 The information of each ESTs

1.3.2 ESTs序列分析 利用DNAMAN軟件和NCBI Blast搜索程序?qū)Ω鱁STs序列進(jìn)行組裝、分析和搜索。

1.3.3 ESTs序列的獲得 根據(jù)ESTs序列信息 設(shè)計(jì)引物(表2)。ESTs擴(kuò)搖后提取質(zhì)粒。PCR擴(kuò)增ESTs序列cds區(qū)的正向和反向片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收，與pMD19-T simple載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌落PCR和酶切驗(yàn)證后進(jìn)行測(cè)序。

1.4 各ESTs干涉載體的構(gòu)建

1.4.1 各ESTs正向序列和載體骨干片段的連接 利用KpnⅠ/BamHⅠ雙酶切組合，分別酶切已連接正向片段的pMD19-T simple載體和pCRI1210載體，回收目標(biāo)片段。將正向片段與載體骨干片段連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，然后酶切驗(yàn)證連接是否正確，進(jìn)而確認(rèn)中間連接載體A是否構(gòu)建成功。

表2 各ESTs引物序列信息Tab.2 The primer sequence information of each ESTs

1.4.2 各ESTs反向序列和載體 骨干片段的連接 利用EcoRⅠ/SacⅠ雙酶切組合，分別酶切已連接反向片段的pMD19-T simple載體和上述中間載體A，回收目的片段。構(gòu)建方法同上，4個(gè)ESTs干涉載體分別命名為pCRI1210-418、pCRI1210-447、pCRI1210-496和pCRI1210-653。

1.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化棉花

1.5.1 干涉載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 將空載體pCRI1210和4個(gè)干涉載體的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404。

1.5.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化棉花 W10株系無菌苗培養(yǎng)：將W10株系于培養(yǎng)基上無菌培養(yǎng)6～7 d，得到無菌苗。用手術(shù)刀切去無菌苗的葉片和根部，得到下胚軸，將其切成0.5～0.8 cm的切段，整齊擺放到無菌培養(yǎng)皿中。

浸染和共培養(yǎng)：將攜帶有干涉載體pCRI1210-418、pCRI1210-447、pCRI1210-496和pCRI1210-653質(zhì)粒的農(nóng)桿菌在LB培養(yǎng)基中活化并擴(kuò)搖至OD600=0.3。

再將菌液倒入培養(yǎng)皿中，直至菌液完全淹沒切段，輕輕搖動(dòng)3～4 min，使菌液和切段充分接觸，然后將經(jīng)過浸染的切段用鑷子一段一段整齊地?cái)[放在共培養(yǎng)基上，切段之間保留3～5 mm的間隙，將培養(yǎng)皿用封口膜沿邊緣封口2～3圈，然后將培養(yǎng)皿置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)48 h。

誘導(dǎo)下胚軸愈傷組織：避光培養(yǎng)48 h后，將下胚軸切段轉(zhuǎn)移至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，野生型為對(duì)照，40 d后觀察下胚軸出愈率。出愈率=出愈下胚軸/接種下胚軸×100%。3次重復(fù)。將野生型愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚性愈傷組織。每隔40 d轉(zhuǎn)移繼代一次，連續(xù)繼代3次。繼代3次后仍沒有分化的，按不分化統(tǒng)計(jì)。

1.5.3 PCR檢測(cè) 提取轉(zhuǎn)基因愈傷組織基因組DNA。PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因陽性組織，所用引物如表2所示。

1.5.4 熒光顯微鏡下檢測(cè)GFP熒光蛋白 用無菌鑷子輕輕夾取少量發(fā)育良好的愈傷組織，輕輕壓碎，慢慢蓋上蓋玻片制成水裝片，在熒光顯微鏡下觀察GFP熒光蛋白的表達(dá)量和分布，利用CCD 進(jìn)行圖像的采集。

1.6 Semi-Quantitative RT-PCR

1.6.1 總RNA的提取 利用Column Plant RNAOUT2.0提取試劑盒提取下胚軸愈傷組織總RNA。

1.6.2 下胚軸愈傷組織總RNA的反轉(zhuǎn)錄 利用PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA。

1.6.3 確定Semi-Quantitative RT-PCR指數(shù)擴(kuò)增期 以轉(zhuǎn)化pCRI1210-418 和pCRI1210的陽性愈傷組織以及野生型材料的cDNA為模板，進(jìn)行3輪PCR擴(kuò)增，循環(huán)數(shù)分別設(shè)為28，30，32，確定Semi-Quantitative RT-PCR的指數(shù)擴(kuò)增期。

1.6.4 PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè) PCR擴(kuò)增30 次循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上檢測(cè)，拍照。

1.6.5 干涉結(jié)果分析 將空載體pCRI1210的Semi-Quantitative產(chǎn)物進(jìn)行10倍的倍比稀釋，與pCRI1210-X(X=418、447、496和653)干涉后的Semi-QuantitativeRT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行對(duì)比，估算干涉后mRNA的降低量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ESTs序列的獲得和干涉載體的構(gòu)建

以EST-418和EST-447為例，分析試驗(yàn)結(jié)果。

2.1.1 PCR擴(kuò)增文庫中各ESTs片段 從文庫96孔板中挑取目標(biāo)ESTs，提取質(zhì)粒后PCR擴(kuò)增各ESTs片段。擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，其中，圖1-A、B分別為EST-418和EST-447的正向片段和反向片段的PCR擴(kuò)增條帶。

M.DNA Marker Ⅲ；A.正向片段：1.447正向擴(kuò)增片段；2.447正向片段陰性對(duì)照；3.418正向擴(kuò)增片段；4.418正向片段陰性對(duì)照；B.反向片段：1.447反向擴(kuò)增片段；2.447反向片段陰性對(duì)照；3.418反向擴(kuò)增片段；4.418反向片段陰性對(duì)照。M.DNA Marker Ⅲ；A.Forward:1.447 forward；2.447 forward negative control；3.418 forward；4.418 forward negative control；B.Reverse:1.447 reverse；2.447 reverse negative control；3.418 reverse；4.418 reverse negative control.

2.1.2 菌落PCR檢測(cè) 各ESTs分別與pMD19-T simple載體連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，培養(yǎng)24～36 h，待培養(yǎng)皿上明顯出現(xiàn)菌斑后，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR，檢測(cè)出陽性單克隆供后續(xù)試驗(yàn)使用。檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。EST-418和EST-447擴(kuò)增序列成功完成了T連接。

2.1.3 pMD19-T simple和pCRI1210上游多克隆位點(diǎn)的雙酶切 提取EST-418和EST-447正向擴(kuò)增序列和pCRI1210陽性單克隆質(zhì)粒后，使用KpnⅠ/BamHⅠ雙酶切，利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)得到的酶切片段進(jìn)行分離，然后使用凝膠試劑盒進(jìn)行回收，結(jié)果顯示，中間載體pCRI1210的上游多克隆位點(diǎn)和T載體均得到了十分完整的酶切，分離充分，符合試驗(yàn)要求(圖3)。

2.1.4 中間載體PCR檢測(cè) 將EST-418和EST-447的正向擴(kuò)增片段和載體pCRI1210進(jìn)行連接，獲得中間載體pCRI1210-X(X=418、447)，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。圖4顯示，EST-418和EST-447的正向擴(kuò)增片段均已成功連接到載體pCRI1210中。

M.DNA Marker Ⅲ；A,B,C.447 3個(gè)單克隆PCR擴(kuò)增條帶；D.447陰性對(duì)照擴(kuò)增條帶；E,F,G.418 3個(gè)單克隆PCR擴(kuò)增條帶；H.418陰性對(duì)照擴(kuò)增條帶。

M.DNA Marker Ⅲ；A,B,C.Three monoclonal PCR amplification bands of 447；D.Amplification bands of 447 negative controls；E,F,G.Three monoclonal PCR amplification bands of 418；H.Amplification bands of 418 negative controls.

圖2菌落PCR檢測(cè)各EST轉(zhuǎn)化的pMD19-Tsimple載體
Fig.2IdentificationoftheESTtransformedcoloniestopMD19-TsimplevectorwithPCR

M.DNA Marker Ⅲ；A.418；B.447；C～F.pCRI1210；G.pCRI1210 對(duì)照。M.DNA Marker Ⅲ；A.418；B.447；C-F.pCRI1210；G.pCRI1210 control.

M.DNA Marker Ⅲ；A～D.4個(gè)447不同單克隆擴(kuò)增條帶；E～H.4個(gè)418不同單克隆擴(kuò)增條帶。M.DNA Marker Ⅲ；A-D.Four bands of 447 different monoclonal amplification；E-H.Four bands of 418 different monoclonal amplification.

2.1.5 pCRI1210中間載體下游多克隆位點(diǎn)和T載體反向PCR擴(kuò)增片段雙酶切 將EST-418和EST-447的pCRI1210中間載體及其反向PCR擴(kuò)增片段的T載體利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，采用EcoRⅠ/SacⅠ雙酶切組合同時(shí)進(jìn)行酶切，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，連接在T載體上的418和447反向擴(kuò)增序列和載體pCRI1210下游的多克隆位點(diǎn)酶切效果良好，符合后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.1.6 PCR檢測(cè)目標(biāo)干涉載體 將目標(biāo)干涉載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌落PCR檢測(cè)。所用特異性檢測(cè)引物AFintron(表2)，檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，目標(biāo)干涉載體pCRI1210-X(X=418、417)構(gòu)建成功，符合試驗(yàn)要求。

M.DNA Marker Ⅲ；A.418；B.447；C～D.EST-418下游中間載體；E.EST-418下游中間載體對(duì)照；F.EST-447下游中間載體對(duì)照；G～H.EST-447下游中間載體。

M.DNA Marker Ⅲ；A.418；B.447；C-D.EST-418 downstream intermediate carrier； E.EST-418 downstream intermediate carrier contrast；F.EST-447 downstream intermediate carrier contrast；G-H.EST-447 downstream intermediate carrier.

圖5pCRI1210中間載體下游多克隆位點(diǎn)和T載體反向PCR擴(kuò)增片段雙酶切
Fig.5DoubleenzymedigestionofpCRI1210intermediatevectordownstreamcloningsiteandTvectorreversePCRamplificationfragment

M.DNA Marker Ⅲ；CK.負(fù)對(duì)照；A～H.EST-447完整干涉載體；I～P.EST-418完整干涉載體。M.DNA Marker Ⅲ; CK.Negative contrast; A-H.EST-447 complete interference vector; I-P.EST-418 complete interference vector.

2.1.7 目標(biāo)干涉載體酶切驗(yàn)證 提取目標(biāo)干涉載體pCRI1210-X(X=418、417)陽性克隆的質(zhì)粒，對(duì)上游和下游擴(kuò)增序列進(jìn)行雙酶切，由圖7 可知，目標(biāo)干涉載體pCRI1210-X(X=418、417)的正反片段均得到了預(yù)期的片段，證明各干涉載體均成功構(gòu)建。

2.1.8 農(nóng)桿菌菌落PCR法檢測(cè)目標(biāo)完整干涉載體 利用質(zhì)粒提取試劑盒提取目的質(zhì)粒，冰凍法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，菌落PCR法檢測(cè)陽性單克隆，如圖8所示。

由圖8可知，各ESTs干涉載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌成功，可以用于浸染下胚軸外植體等后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化棉花下胚軸外植體

2.2.1 誘導(dǎo)下胚軸愈傷組織 各ESTs干涉載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后所浸染的下胚軸切段，部分切段12 d左右兩端開始膨大，出現(xiàn)愈傷，40 d后達(dá)到最大值。不同ESTs干涉載體出愈率發(fā)生了變化，與對(duì)照相比，pCRI1210-418出愈率有所提高，而其他載體的出愈率出現(xiàn)了不同程度的下降，3次重復(fù)結(jié)果一致。

M.DNA Marker Ⅲ；A.EST-418正向擴(kuò)增條帶；B.EST-418反向擴(kuò)增條帶；C.EST-447正向擴(kuò)增條帶；D.EST-447反向擴(kuò)增條帶。M.DNA Marker Ⅲ; A.EST-418 positive amplification bands; B.EST-418 reverse amplification bands; C.EST-447 positive amplification bands;D.EST-447 reverse amplification bands.

由圖9可知，農(nóng)桿菌浸染后的下胚軸誘導(dǎo)40 d后，轉(zhuǎn)化各EST對(duì)應(yīng)的干涉載體的愈傷組織出愈率和愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)出現(xiàn)了明顯的差異。EST-447的下胚軸切段經(jīng)過培養(yǎng)基誘導(dǎo)后雖然兩端也一定程度上發(fā)生了膨大，但發(fā)育非常緩慢最終未能繼續(xù)誘導(dǎo)成愈傷組織，有的變?yōu)楹诤稚蟮蛲?。而EST-418的愈傷組織生長(zhǎng)旺盛且有一定光澤。

A.pCRI1210；B.pCRI1210-418干涉載體；C.pCRI1210-447干涉載體。A.pCRI1210；B.pCRI1210-418 interference vector；C.pCRI1210-447 interference vector.

圖9 誘導(dǎo)40 d的下胚軸愈傷組織Fig.9 Callus induction of hypocotyl at 40 days

2.2.2 出愈率統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)各ESTs干涉載體轉(zhuǎn)化的下胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)情況，記錄其出愈塊數(shù)及其生長(zhǎng)狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)其出愈率，具體情況如表3所示。

表3 各干涉載體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.3 Effect of different interference vector on induction of callus

利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SAS 9.1，對(duì)記錄的數(shù)據(jù)整理后進(jìn)行顯著性方差分析，結(jié)果如表4所示。

將表3，4轉(zhuǎn)化繪制成圖10，可直觀觀測(cè)各載體誘導(dǎo)的愈傷干涉后出愈率的變化。

由表4、圖10可知，各ESTs平均值與對(duì)照pCRI210相比，在P<0.01和P<0.05水平上均存在顯著性差異。其中，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)化載體pCRI1210-418所轉(zhuǎn)化的下胚軸外植體出愈率提高，而其他3個(gè)載體pCRI1210-X(X=447、496和653)所轉(zhuǎn)化的下胚軸外植體的出愈率均出現(xiàn)不同程度的下降。其中，轉(zhuǎn)化載體pCRI1210-653的下胚軸外植體出愈率最低，且其愈傷組織生長(zhǎng)最為緩慢，生長(zhǎng)狀態(tài)也較差。

表4 顯著性方差分析Tab.4 Significant analysis of variance

不同小寫字母表示0.05水平差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示0.01水平差異顯著(P<0.01)。Different lowercase means significant difference (P<0.05);Different capital letters mean significant difference (P<0.01)

2.3 愈傷組織PCR和GFP熒光檢測(cè)

2.3.1 PCR法檢測(cè)愈傷組織基因組DNA 提取誘導(dǎo)40 d后的下胚軸外植體愈傷組織的基因組DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖11所示，在相應(yīng)位置均出現(xiàn)了目標(biāo)條帶，條帶清晰且單一，可以確定4個(gè)干涉載體和pCRI210都成功整合進(jìn)棉花愈傷組織基因組DNA中。

圖11 PCR檢測(cè)愈傷組織基因組DNAFig.11 PCR screening of callus genomics DNA

2.3.2 熒光檢測(cè)下胚軸外植體愈傷組織GFP表達(dá) 將誘導(dǎo)40 d的下胚軸外植體愈傷組織，用無菌鑷子輕輕夾取少量制成水裝片，在熒光顯微鏡下檢測(cè)GFP基因蛋白的表達(dá)量和分布，檢測(cè)結(jié)果如圖12所示。由圖12可知，GFP基因成功地整合進(jìn)棉花愈傷組織基因組DNA中，在細(xì)胞核和細(xì)胞膜中均得到了高效表達(dá)。

圖12 GFP在棉花愈傷組織中的表達(dá)Fig.12 Expression of GFP in cotton callus

2.4 Semi-Quantitative RT-PCR

2.4.1 RNA提取 利用天澤植物RNAout 2.0試劑盒提取誘導(dǎo)40 d的下胚軸外植體愈傷組織的總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳分離，結(jié)果由圖13可知，所提取的RNA條帶清晰無彌散現(xiàn)象，可滿足試驗(yàn)要求。

M.DNA Marker Ⅲ； A.野生型；B.pCRI1210；C.pCRI1210-418；D.pCRI1210-447； E.pCRI1210-496；F.pCRI1210-653。M.DNA Marker Ⅲ；A.Wild type；B.pCRI1210；C.pCRI1210-418；D.pCRI1210-447；E.pCRI1210-496；F.pCRI1210-653.

2.4.2 確定Semi-Quantitative RT-PCR指數(shù)擴(kuò)增期 由圖14可知，循環(huán)數(shù)分別為28，30，32的擴(kuò)增條帶中，將擴(kuò)增數(shù)設(shè)定為30，擴(kuò)增產(chǎn)物剛好處于指數(shù)擴(kuò)增期。

圖14 半定量RT-PCR指數(shù)擴(kuò)增期的確定Fig.14 Identify index of the semi-quantitative RT-PCR amplification

2.4.3 Semi-Quantitative RT-PCR 結(jié)果 內(nèi)參基因Histone3調(diào)整后，干涉后愈傷組織分別和野生型、空載體相比。由圖15可知，各干涉載體對(duì)應(yīng)的下胚軸外植體愈傷組織中，目標(biāo)RNA的轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)了一定程度的下降。而野生型和空載體對(duì)照下胚軸外植體RNA的轉(zhuǎn)錄量差異不明顯。

2.4.4 檢測(cè)目標(biāo)RNA的轉(zhuǎn)錄效率 采用倍比稀釋法檢測(cè)目標(biāo)RNA的轉(zhuǎn)錄效率。將轉(zhuǎn)化載體pCRI1210的愈傷組織進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物(R1)采用10倍倍比稀釋法，與pCRI1210-418干涉后的RT-PCR產(chǎn)物(R2)進(jìn)行對(duì)比，干涉后mRNA的降低量為60%～70%，結(jié)果如圖16所示。由于半定量RT-PCR的局限性，重復(fù)多次試驗(yàn)，結(jié)果一致。

A.干涉后653；B.干涉后496；C.干涉后447；D.干涉后418；P.空載體pCRI1210；W.野生型。A.After the intervention 653；B.After the intervention 496；C.After the intervention 447；D.After the intervention 418；P.Empty vector pCRI1210；W.Wild type.

A.10 μL干涉后pCRI1210-418； B.10 μL 空載體pCRI1210；C.20 μL 空載體pCRI1210；D.30 μL 空載體pCRI1210；E.40 μL 空載體pCRI1210；F.5 μL 空載體pCRI1210原液；G.6 μL 空載體pCRI1210原液；H.7 μL 空載體pCRI1210原液。

A.10 μL pCRI1210-418 after interference;B.10 μL empty vector pCRI1210; C.20 μL empty vector pCRI1210 D.30 μL empty vector pCRI1210; E.40 μL empty vector pCRI1210 F.5 μL empty vector pCRI1210 stoste; G.6 μL empty vector pCRI1210 stoste; H.7 μL empty vector pCRI1210 stoste.

圖16估測(cè)目標(biāo)RNA的轉(zhuǎn)錄效率
Fig.16EstimationoftranscriptionalefficiencyoftargetRNA

3 討論

棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，它既受到細(xì)胞內(nèi)因素的影響，如基因、激素和調(diào)控因子等，同時(shí)也受到細(xì)胞外因素的影響。不同的棉花品種體細(xì)胞胚胎的發(fā)生能力差異十分明顯，有的發(fā)生能力高達(dá)90%以上，有的發(fā)生能力幾乎為0，并且同一品種不同種子之間體細(xì)胞胚胎的發(fā)生也存在一定的差異，這種差異極有可能是由基因型之間的差異造成的[29]。通過本試驗(yàn)可知，不同的調(diào)控因子在體細(xì)胞胚胎分化過程中發(fā)揮著不同的作用。干涉后，EST-418的出愈率提高，而EST-447、EST-496和EST-653的出愈率出現(xiàn)了不同程度的下降。我們大膽預(yù)測(cè)，EST-418在棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中起抑制作用，而EST-447、EST-496和EST-653在棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中起促進(jìn)作用，SSH文庫中必定還存在很多這樣的調(diào)控因子。從棉花種類來分，再生能力從易到難依次為珂字棉、愛字棉、斯字棉和岱字棉。國(guó)內(nèi)品種中，從易到難依次為黃河流域品種、陜西及河北的品種、長(zhǎng)江流域的品種。外植體是影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生的一個(gè)重要因素，不同類型的外植體分化得到體細(xì)胞胚胎的能力差異很大，其中，下胚軸最容易，子葉較差，真葉和莖最差[30]。也有研究指出，培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件(pH值、溫度等)以及激素的種類(氮化物、谷氨酰胺、吲哚乙酸、細(xì)胞分裂素、2，4-二氯苯氧基乙酸等)都對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生具有重要的作用[31-32]，其發(fā)生途徑很好地詮釋了細(xì)胞的全能性，證明植物體細(xì)胞同樣具有一套完整的遺傳信息。因此，為了更加深入了解細(xì)胞分化、發(fā)育、形態(tài)發(fā)生以及合子胚發(fā)育的機(jī)制，必須進(jìn)一步研究植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)制以及真核細(xì)胞中基因表達(dá)與調(diào)控。只有深入了解體細(xì)胞胚胎發(fā)生的分子機(jī)制，將與體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)的基因進(jìn)行克隆并進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，甚至找到棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的主效基因，才能在研究棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的道路上走得更遠(yuǎn)，從而使不容易發(fā)生體細(xì)胞胚胎分化的品種實(shí)現(xiàn)分化，創(chuàng)造出更多的優(yōu)質(zhì)、特異種質(zhì)資源供育種家使用。一些無法利用傳統(tǒng)手段來解決的問題或許可以通過遺傳轉(zhuǎn)化和體細(xì)胞胚胎發(fā)生的途徑來解決。抑制性消減雜交文庫的構(gòu)建提供了大量的差異表達(dá)基因，SSR-EST、RNAi等技術(shù)的應(yīng)用找到了驗(yàn)證這些基因的方法[33-36]。相信，隨著研究工作的深入以及一些新技術(shù)新方法的使用，棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的密碼將會(huì)一步步被破解。

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