賈小平，袁璽壘，陸 平，侯典云，戴凌峰

(1.河南科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所，北京 100081)

谷子是原產(chǎn)于我們國(guó)家的四大傳統(tǒng)作物之一，但是由于產(chǎn)量低、抗逆性弱，谷子種植面積一直萎縮。近些年，隨著人民生活水平的提高，對(duì)谷子的需求越來(lái)越熱，目前，小米已經(jīng)成為市場(chǎng)上暢銷的營(yíng)養(yǎng)保健品。為了增加產(chǎn)量，滿足市場(chǎng)需求，谷子雜種優(yōu)勢(shì)研究日益受到重視，并且取得了重要進(jìn)展，如張家口農(nóng)業(yè)科學(xué)院趙治海成功選育出張雜谷系列雜交谷子，在國(guó)內(nèi)廣泛推廣。

雄性不育材料是成功開(kāi)展谷子雜交育種的先決條件，國(guó)內(nèi)谷子育種工作者在不育材料選育、應(yīng)用及不育基因定位等方面進(jìn)行了大量研究。馬尚耀、胡洪凱等[1-3]在澳大利亞谷和吐魯番谷雜交的后代中首次發(fā)現(xiàn)谷子的不育株，并且系統(tǒng)地闡述了谷子雄性不育基因M_s(ch)的遺傳機(jī)制，在細(xì)胞遺傳學(xué)水平上確認(rèn)了谷子雄性不育復(fù)等位基因的存在。隨后，王天宇等[4]、王玉文等[5-6]、田崗等[7]、閆宏山等[8]選育了一批優(yōu)良的不育材料，并通過(guò)測(cè)配選出一些優(yōu)勢(shì)組合，形成了較好的谷子雜種優(yōu)勢(shì)利用模式。李素英等[9]研究了新育成的7個(gè)骨干雄性不育系與恢復(fù)系的配合力。宋國(guó)亮等[10]用30份不育系和4份恢復(fù)系為親本，配制雜交組合研究不同組合的配合力和雜種優(yōu)勢(shì)，篩選了一些具有較高配合力的親本組合。黃偉等[11]研究了谷子光溫敏不育系A(chǔ)2在夏季育性轉(zhuǎn)換的情況，結(jié)果表明，光溫敏不育系A(chǔ)2不同播種期處理的套袋自交結(jié)實(shí)率極低(5%左右)，變化規(guī)律不明顯，屬于高度不育，谷子的雜交育種適合在夏天進(jìn)行。在谷子不育基因定位研究方面。王曉明等[12]研究了播期、密度、施肥等不同因素對(duì)光溫敏不育系A(chǔ)2產(chǎn)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)播期對(duì)A2的產(chǎn)量有顯著影響。喬慧琴等[13]研究了不育系高146A不育基因與早抽穗控制基因的遺傳關(guān)系，結(jié)果表明不育性狀和早抽穗性狀由3對(duì)獨(dú)立遺傳基因控制，無(wú)連鎖關(guān)系。Wang等[14]應(yīng)用初級(jí)三體分析法對(duì)谷子進(jìn)行了雄性不育基因的染色體定位，確定了雄性不育材料1066A中的不育基因?yàn)殡[性單基因,且位于第6號(hào)染色體上。袁進(jìn)成等[15-16]、郝曉芬等[17-18]利用AFLP、SSR分子標(biāo)記對(duì)谷子的雄性不育基因進(jìn)行定位，獲得了與不育基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，并且再次確定1066A不育基因位于谷子第6號(hào)染色體。

目前，谷子雄性不育研究主要集中在不育材料選育、雜種優(yōu)勢(shì)組合選配方面，有關(guān)分子水平的研究較少。本研究在已經(jīng)報(bào)道的谷子雄性不育基因定位研究的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)方法從谷子基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)檢索到位于6號(hào)染色體上的一個(gè)雄性不育基因序列，設(shè)計(jì)特異引物從不育材料1066A中克隆雄性不育基因，以尋找導(dǎo)致不育的變異位點(diǎn)，為從分子水平揭示不育機(jī)制、開(kāi)展不育材料的標(biāo)記輔助選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為谷子雄性不育材料1066A，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所陸平研究員提供。

1.2 試驗(yàn)方法

將不育材料1066A種植于河南科技大學(xué)開(kāi)元校區(qū)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，種植方式為：種植2行，行長(zhǎng)2 m，株距5 cm，行距30 cm。待幼苗長(zhǎng)至四葉期，采集嫩葉片用CTAB法提取基因組DNA。

以玉米雄性不育基因mRNA序列(NM_001147243.1)為查詢序列，同源搜索谷子基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)，查詢到豫谷1號(hào)的不育基因序列(Si015780m.g)，根據(jù)獲得的模板序列，用DNAMAN 5.0設(shè)計(jì)2對(duì)特異引物，分段擴(kuò)增雄性不育基因。引物長(zhǎng)度為18～24個(gè)堿基，退火溫度55～60 ℃。引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度等信息見(jiàn)表1。

表1 擴(kuò)增所需的引物序列Tab.1 The primer sequences for sterility gene amplification

用于PCR擴(kuò)增的體系為25 μL，其中，滅菌水為9 μL，2×PowerTaqPCR Master Mix為12.5 μL，正反混合引物為2.5 μL(2.5 pmol/L)，DNA模板為1 μL(50 ng)。PCR擴(kuò)增程序：首先94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性35 s，55 ℃退火30 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1.5 min；最后72 ℃延伸5 min。將純化后的PCR產(chǎn)物送至三博遠(yuǎn)志測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。獲得1066A 的基因組序列，使用Clustal X軟件將1066A雄性不育基因編碼序列和豫谷1號(hào)、張谷的雄性不育基因編碼序列進(jìn)行比對(duì)，隨后將1066A、豫谷1號(hào)、張谷雄性不育基因推定的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行序列比對(duì)，以確定發(fā)生突變的堿基及氨基酸。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子不育材料1066A的PCR擴(kuò)增

以玉米不育基因mRNA序列(NM_001147243.1)同源搜索谷子基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得了谷子雄性不育基因序列(Si015780m.g)，該基因位于谷子6號(hào)染色體，全長(zhǎng)5 027 bp，編碼479個(gè)氨基酸，且位于前人用分子標(biāo)記定位的基因組區(qū)段[18]。用2對(duì)引物BY1和BY2擴(kuò)增谷子不育材料1066A基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)2條目標(biāo)條帶符合預(yù)期大小，且清晰特異性好，因此，適合進(jìn)行后續(xù)的測(cè)序(圖1)。

Marker.DL2000；BY1、BY2.引物對(duì)1、引物對(duì)2擴(kuò)增產(chǎn)物。Marker.DL2000；BY1，BY2.Amplified products of primer pair 1 and primer pair 2.

2.2 谷子不育材料1066A的PCR產(chǎn)物測(cè)序

將2對(duì)特異引物擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京三博遠(yuǎn)志測(cè)序公司測(cè)序，第1對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序獲得1 965 bp的基因組序列，第2對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序獲得1 017 bp的基因組序列，2對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果都小于預(yù)期，說(shuō)明谷子不育材料1066A雄性不育基因序列和豫谷1號(hào)基因組序列相比，存在部分序列的缺失。最后將2對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物所測(cè)序列拼接在一起，共獲得2 561 bp的基因序列(圖2)，該序列包含基因下游部分編碼區(qū)域。

圖2 兩對(duì)引物擴(kuò)增序列拼接獲得2 561 bp的基因序列Fig.2 2 561 bp gene fragment was obtained by assembling sequences amplified by two pairs of primers

2.3 谷子不育材料1066A雄性不育基因編碼序列比對(duì)

目前，張家口農(nóng)業(yè)科學(xué)院和華大基因中心合作測(cè)定了張谷的全基因組序列，本研究從華大基因研究中心公布的谷子基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//foxtailmillet.genomics.org.cn/page/species/index.jsp)下載了張谷雄性不育基因序列(scaffold587)，根據(jù)豫谷1號(hào)推定的mRNA編碼序列，對(duì)3個(gè)谷子材料推定的編碼序列進(jìn)行了多序列比對(duì)，比對(duì)區(qū)域包含了編碼區(qū)從第933個(gè)堿基開(kāi)始到終止密碼子結(jié)束共562 bp序列，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與豫谷1號(hào)和張谷雄性不育基因相比，谷子不育材料1066A存在3處突變：第1處是從起始密碼子開(kāi)始第1 204個(gè)堿基由A替換成G；第2處是從起始密碼子開(kāi)始第1 207個(gè)堿基由C替換成A；第3處突變是從起始密碼子開(kāi)始第1 375個(gè)堿基后插入了1個(gè)堿基T(圖3)。這3處突變可能會(huì)導(dǎo)致所編碼氨基酸的改變。

圖3 三個(gè)谷子的雄性不育基因部分編碼區(qū)多序列比對(duì)分析Fig.3 Multiple sequence analysis of partial coding region from three male sterility genes

2.4 雄性不育基因蛋白質(zhì)序列比對(duì)

為進(jìn)一步揭示雄性不育基因變異機(jī)制，對(duì)3個(gè)谷子品種雄性不育基因蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖4)，1 204，1 207這2個(gè)位點(diǎn)堿基替換導(dǎo)致豫谷1號(hào)和張谷不育基因第402，403個(gè)氨基酸異亮氨酸、亮氨酸被替換成谷子不育材料1066A的不育基因編碼的纈氨酸，異亮氨酸，這3種氨基酸都屬于脂肪族中性氨基酸，且屬于非極性的R基氨基酸，他們之間的相互替換，可能不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)造成大的影響。而在1 375個(gè)堿基處插入1個(gè)堿基T，導(dǎo)致移碼突變的發(fā)生，從459位氨基酸開(kāi)始谷子不育材料1066A的不育基因編碼的氨基酸序列與豫谷1號(hào)、張谷不育基因?qū)?yīng)氨基酸序列發(fā)生很大改變，移碼突變還導(dǎo)致谷子不育材料1066A的不育基因在編碼到第466個(gè)氨基酸時(shí)提前出現(xiàn)終止信號(hào)，不能表達(dá)完整的蛋白。因此，谷子不育材料1066A的不育基因蛋白質(zhì)提前終止可能是導(dǎo)致其功能喪失，從而產(chǎn)生不育表型的主要原因。

圖4 雄性不育基因編碼的部分蛋白質(zhì)序列比對(duì)結(jié)果Fig.4 Multiple sequence alignment result of partial protein sequences coding by male sterility gene

3 結(jié)論與討論

赤峰市農(nóng)科所在澳大利亞谷和吐魯番谷雜交的子代F3中首次發(fā)現(xiàn)谷子的不育株，較系統(tǒng)地闡述了谷子雄性不育基因M_s～(ch)的遺傳機(jī)制，從而進(jìn)一步在細(xì)胞遺傳學(xué)水平上確認(rèn)了谷子雄性不育復(fù)等位基因的存在[1-3]。李會(huì)霞等[19]對(duì)10個(gè)華北谷子品種與谷子高度雄性不育系(高117A、高146A)進(jìn)行測(cè)交，根據(jù)F2、BC1F1分離群體的育性反應(yīng)對(duì)不育系的不育基因進(jìn)行了遺傳分析。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)這2個(gè)不育系的不育性可能受1對(duì)隱性主效基因控制的同時(shí)還受微效多基因的影響。袁進(jìn)成等[15]通過(guò)試驗(yàn)篩選找到了P17/M37224、P35/M52208共2個(gè)AFLP標(biāo)記與不育基因Msch緊密連鎖，其中，P17/M37224與不育基因的遺傳距離是2.1 cM，P35/M52208與不育基因的遺傳距離是1.4 cM，且P17/M37224、P35/M52208這2個(gè)距離為0.7 cM 的AFLP標(biāo)記位于不育基因Msch的同一側(cè)，表明P17/M37224、P35/M52208可有效用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。Wang等[14]進(jìn)行了谷子雄性不育基因的染色體定位研究，確定控制1066A不育性狀的不育基因?yàn)殡[性單基因，且位于第6條染色體上。郝曉芬等[18]利用SSR方法對(duì)谷子光敏雄性不育基因用分子標(biāo)記的方法來(lái)尋找谷子光敏雄性不育基因。首先以谷子光敏不育系GM和恢復(fù)系恢東1號(hào)2個(gè)品種為親本，用166對(duì)引物對(duì)兩親本進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，有61對(duì)引物在親本間存在差異；然后經(jīng)F2群體153株單株驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，僅有距目標(biāo)引物距離為13．5 cM的1對(duì)引物b159和目標(biāo)基因連鎖，且b159位于第6條染色體上。Wang等[20]利用SSR標(biāo)記將谷子不育材料高146A的不育基因也定位在6號(hào)染色體上。

上述研究表明，谷子6號(hào)染色體確實(shí)存在雄性不育基因，但是有關(guān)谷子雄性不育基因克隆的報(bào)道極少，只有楊莉芳[21]分析了J29A雄性不育突變體不育的形態(tài)學(xué)原因，利用基因組分析精細(xì)定位了不育基因SiMS1，發(fā)現(xiàn)基因下游非編碼區(qū)的3處突變，穩(wěn)定地存在于3種雄性不育系材料與4種正?？捎牧现g。本試驗(yàn)選擇谷子6號(hào)染色體進(jìn)行不育基因的克隆和測(cè)序比對(duì)，同樣發(fā)現(xiàn)谷子不育材料1066A與張谷、豫谷1號(hào)不育基因間存在3處突變位點(diǎn)，這3處突變位點(diǎn)可能是導(dǎo)致谷子1066A不育的重要原因。

[1] 馬尚耀，成慧娟，董歧福，等.谷子顯性核不育基因的研究與進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，1990(2)：9-11.

[2] 馬尚耀，成慧娟，郝明杰.谷子雄性不育基因Msch的遺傳研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1992，7(3)：9-14.

[3] 胡洪凱，馬尚耀，石艷華.谷子顯性雄性核不育基因的發(fā)現(xiàn)與利用[J].遺傳，1985(3)：4-4.

[4] 王天宇，杜瑞恒.谷子高度雄性不育基因在常規(guī)品種選育中的應(yīng)用[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1994，9(3)：21-25.

[5] 王玉文，李會(huì)霞，王高鴻，等.利用光敏不育性進(jìn)行谷子輪回選擇方法研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，27(2)：13-15.

[6] 王玉文，王隨保，李會(huì)霞，等.谷子光敏雄性不育系選育及應(yīng)用研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36(6)：714-717.

[7] 田 崗，王玉文，李會(huì)霞，等.谷子高度雄性不育系研究與利用[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007(2)：12-13.

[8] 閆宏山，劉金榮，王素英，等.谷子品種間雜交選育雄性不育系研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40(4)：53-55.

[9] 李素英，馮小磊，范光宇，等. 幾個(gè)骨干谷子雄性不育系和恢復(fù)系的配合力分析[J]. 河北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016，20(2): 1-4.

[10] 宋國(guó)亮，馮小磊，范光宇，等. 谷子新不育系的配合力分析[J]. 作物雜志，2017(2): 44-50.

[11] 黃 偉，馮小磊，蘇 旭，等.谷子光溫敏不育系A(chǔ)2育性轉(zhuǎn)換研究初報(bào)[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，19(2)：1-4.

[12] 王曉明，宋國(guó)亮，馮小磊，等. 谷子光溫敏雄性不育系A(chǔ)2高產(chǎn)繁育技術(shù)研究[J]. 河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，20(2): 5-9.

[13] 喬慧琴，杜曉芬，楊慧卿，等. 谷子不育系高146A不育與早抽穗性狀遺傳關(guān)系分析[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31(27): 159-163

[14] Wang R Q，Gao J H，Mao L P，et al.Chromosome location of the male-sterility and yellow seedling gene in line 1066A of foxtail millet[J].Journal of Integrative Plant Biology，2002，44(10)：1209-1212.

[15] 袁進(jìn)成，石云素，胡洪凱，等.谷子顯性雄性不育基因Ms-(ch)的AFLP標(biāo)記[J].作物學(xué)報(bào)，2005，31(10)：1295-1299.

[16] 袁進(jìn)成，程校云，姚志剛，等. 谷子顯性恢復(fù)基因的AFLP分析[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，7: 1547-1551.

[17] 郝曉芬，王節(jié)之，王根全，等.利用AFLP技術(shù)對(duì)谷子光敏雄性不育基因進(jìn)行分子標(biāo)記[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(11)：3-5.

[18] 郝曉芬，王志民，王根全，等.SSR方法標(biāo)記谷子光敏雄性不育基因[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2011，26(5)：112-116.

[19] 李會(huì)霞，王玉文，田 崗，等.谷子高度雄性不育系不育基因的遺傳分析[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，14(11)：96-99.

[20] Wang J，Wang Z L，Yang H Q，et al.Genetic analysis and preliminary mapping of a highly Male-Sterile gene in foxtail millet (SetariaitalicaL.beauv.) using SSR markers[J].Journal of Integrative Agriculture，2013，12(12)：2143-2148.

[21] 楊莉芳.谷子雄性不育基因SiMS1的精細(xì)定位[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013.