孫 嬌，趙美愛，潘順祥，裴玉賀，郭新梅，宋希云

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109; 2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院，山東 青島 266109;3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 青島市主要農(nóng)作物種質(zhì)創(chuàng)新與應(yīng)用重點實驗室，山東 青島 266109)

玉米葉夾角屬于數(shù)量性狀，受多基因控制。隨著標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，QTL定位方法大量應(yīng)用于數(shù)量性狀的研究。借助QTL作圖，確定控制玉米葉夾角的基因位點，為玉米育種改良提供理論依據(jù)。Mickelson等[1]用玉米B73和Mo17 2個親本構(gòu)建重組自交系，采用符合區(qū)間作圖法在2個環(huán)境中分別檢測到7，3個控制玉米葉夾角的QTL；于永濤等[2]利用3個不同的F2：3群體玉米H21×Mo17、自330×K36和B73×L050，采用復(fù)合區(qū)間作圖法檢測到9個控制葉夾角的QTL；路明等[3]以掖478×丹340的F2為作圖材料，采用復(fù)合區(qū)間作圖法檢測到6個與玉米葉夾角相關(guān)的QTL。但受到標(biāo)記密度的限制，QTL檢測的置信區(qū)間較大、有效性較低，難以為育種提供優(yōu)良等位基因的信息。而全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study，GWAS)具有高分辨率、高通量的優(yōu)勢，有利于鑒定種質(zhì)資源中的有利基因[4-11]。本研究利用全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)合玉米自然條件下的農(nóng)藝性狀對玉米穗上葉夾角進(jìn)行初步定位，為進(jìn)一步進(jìn)行玉米葉夾角相關(guān)基因位點的精細(xì)定位、候選基因的功能及表達(dá)分析奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為289份玉米自交系構(gòu)建的自然群體，包括我國骨干自交系及國外引進(jìn)的優(yōu)良自交系、山東省農(nóng)業(yè)良種工程課題組選育的自交系。

1.2 田間試驗設(shè)計

2014年在河北保定、山東棗莊，2015年在河北保定、河南洛陽種植289份玉米自交系，3 m行長，0.6 m行寬，每行15株，每個試驗點3個重復(fù)。在玉米開花后15 d測量全部植株的葉夾角。

1.3 表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用SPSS 2.0軟件對玉米葉夾角的表現(xiàn)型數(shù)據(jù)進(jìn)行描述統(tǒng)計分析，獲得不同環(huán)境下雄穗柄長的均值、方差、標(biāo)準(zhǔn)差、偏度、峰度及直方圖。

1.4 玉米葉片總DNA的提取及基因型分析

參照CTAB法提取DNA[12]，采用美國先鋒公司開發(fā)的MaizeSNP50基因芯片進(jìn)行基因分型。該芯片包括55 126個SNP標(biāo)記，均勻分布在玉米B73的全基因組。參照Weng等[13]控制基因型數(shù)據(jù)質(zhì)量。

1.5 SNP基因型的關(guān)聯(lián)分析

從55 126個SNP中剔除缺失率大于20%、雜合率大于10%和最小基因頻率低于0.05的標(biāo)記，剩余25 331個基因型Marker，利用TASSEL 5.0軟件對玉米雄穗柄長進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米葉夾角的表型數(shù)據(jù)分析

將已獲得的玉米葉夾角表現(xiàn)型數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，同時得到不同環(huán)境下的直方圖，如表1、圖1所示。2014年保定、棗莊，2015年保定、洛陽4個環(huán)境玉米葉夾角的均值分別為26.25，29.32，27.57，24.41 cm，方差分別為56.477，81.562，54.015，28.254，標(biāo)準(zhǔn)差分別為7.515，9.031，7.350，5.315，如表1所示。4個環(huán)境下玉米葉夾角呈極顯著相關(guān)。不同環(huán)境下玉米葉夾角的表現(xiàn)型數(shù)據(jù)雖然存在一定差異，但整體呈正態(tài)分布，植株具有一定的代表性，符合全基因組關(guān)聯(lián)分析的要求，如圖1所示。

表1 不同環(huán)境下玉米葉夾角的統(tǒng)計分析Tab.1 Statistical analysis of leaf angle in maize under different environments

2.2 玉米葉夾角的全基因組關(guān)聯(lián)分析

將25 331個基因Marker與葉夾角用farmCPU進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。圖2為玉米葉夾角的全基因組關(guān)聯(lián)分析。圖2-A、C、E、G為4個環(huán)境的曼哈頓圖，縱軸間接表示各個標(biāo)記與性狀的關(guān)聯(lián)性。圖2-B、D、F、H為4個環(huán)境下玉米葉夾角全基因組關(guān)聯(lián)分析的Q-Q圖，橫軸表示經(jīng)過負(fù)的常數(shù)對數(shù)轉(zhuǎn)換的期望P值，縱軸表示經(jīng)過負(fù)的常數(shù)對數(shù)轉(zhuǎn)換的觀察到的P值。在2014年保定中篩選出14個標(biāo)記，分布在1，2，3，4，5，8，9，10號染色體，如圖2-A、表2。2014年棗莊篩選出10個標(biāo)記，分布在1，5，7，8，9號染色體，如圖2-C、表2。2015年保定篩選出10個標(biāo)記，分布在1，5，6，7，8，10號染色體，如圖2-E、表2。2015年洛陽篩選出8個標(biāo)記，分布在1，3，5，8，9，10號染色體，如圖2-G、表2。

圖1 玉米葉夾角表型數(shù)據(jù)的直方圖Fig.1 The histogram of leaf angles

A.2014年保定葉夾角的曼哈頓圖；B.2014年保定葉夾角全基因組關(guān)聯(lián)分析的Q-Q圖；C.2014年棗莊葉夾角的曼哈頓圖；D.2014年棗莊葉夾角全基因組關(guān)聯(lián)分析的Q-Q圖；E.2015年保定葉夾角的曼哈頓圖；F.2015年保定葉夾角全基因組關(guān)聯(lián)分析的Q-Q圖；G.2015年洛陽葉夾角的曼哈頓圖；H.2015年洛陽葉夾角全基因組關(guān)聯(lián)分析的Q-Q圖。

A.Manhattan-map of leaf angle in Baoding during 2014;B.QQ-map of genome-wide association analysis of leaf angle in Baoding during 2014;C.Manhattan-map of leaf angle in Zaozhuang during 2014;D.QQ-map of genome-wide association analysis of leaf angle in Zaozhuang during 2014;E.Manhattan-map of leaf angle in Baoding during 2015;F.QQ-map of genome-wide association analysis of leaf angle in Baoding during 2015;G.Manhattan-map of leaf angle in Luoyang during 2015;H.QQ-map of genome-wide association analysis of leaf angle in Luoyang during 2015.

圖2 玉米葉夾角全基因組關(guān)聯(lián)分析Fig.2 Genome-wide association analysis of leaf angle

2.3 玉米葉夾角的候選基因分析

4個環(huán)境所篩選出的42個標(biāo)記綜合分析，共篩選出15個標(biāo)記，分別位于Bin1.02、Bin1.03、Bin1.06、Bin1.11、Bin2.05、Bin3.04、Bin5.03、Bin5.04、Bin8.03、Bin8.04、Bin10.07處(表3)。

表3 15個與葉夾角顯著相關(guān)的SNP位點Tab.3 The 15 SNP associated with leaf angle

3 討論

GWAS是一種以連鎖不平衡為基礎(chǔ)，將SNP均勻分布于全基因組，借助統(tǒng)計學(xué)工具分析某一群體目標(biāo)性狀遺傳變異的方法。目前，GWAS大量應(yīng)用于鑒定植物病害、開花期、籽粒性狀、株高等性狀的研究[13-18]。本研究采用289份玉米自交系組成的關(guān)聯(lián)作圖群體對玉米雄穗柄長進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，在4個環(huán)境中共檢測到42個與玉米葉夾角顯著關(guān)聯(lián)(P<0.000 01)的SNP。

Tuberosa等[19]提出，相同性狀的QTL在不同環(huán)境下檢測到，且效應(yīng)方向相同，置信區(qū)間、標(biāo)記區(qū)間重疊，可認(rèn)為是同一QTL位點，Tian等[19-21]認(rèn)為連鎖定位和關(guān)聯(lián)分析都可以檢測數(shù)量性狀位點，2種方法檢測到的位點在位置上大部分具有一致性。結(jié)合前人的研究結(jié)果，本研究篩選出15個候選位點。Bin1.02、Bin1.06、Bin3.04、Bin10.07處篩選出與玉米穗上葉夾角相關(guān)的SNP標(biāo)記與于永濤等[2]研究的結(jié)果在同一標(biāo)記區(qū)間；Bin1.03處篩選的SNP標(biāo)記位點與劉正等[22]的研究結(jié)果一致；Bin1.11處篩選出的SNP標(biāo)記位點與劉兵[23]的研究結(jié)果一致；Bin2.05、Bin5.03、Bin8.03、Bin8.04處篩選出的SNP標(biāo)記位點與劉鵬飛等[24]的研究結(jié)果處于同一區(qū)間。結(jié)果表明，以上區(qū)間極大可能存在與玉米葉夾角相關(guān)的基因位點。進(jìn)一步研究時，可以在此區(qū)間適量加大標(biāo)記密度。但本研究檢測到的顯著位點并非都與已經(jīng)定位的QTL重疊，可能是與前人采用的雙親QTL作圖法受親本種質(zhì)背景或檢測微效QTL功效較低的影響有關(guān)。這表明采用全基因組關(guān)聯(lián)分析策略是一種解析雄穗長遺傳結(jié)構(gòu)的有效方法[23，25]。

玉米葉夾角為多基因控制的數(shù)量性狀，且受環(huán)境影響較大，研究過程比較復(fù)雜、可控性差，本試驗結(jié)果可以為今后研究玉米葉夾角的基因位點提供參考依據(jù)，同時為進(jìn)一步進(jìn)行玉米葉夾角相關(guān)基因位點的精細(xì)定位、候選基因的功能及表達(dá)分析奠定理論基礎(chǔ)，進(jìn)而為玉米育種提供參考借鑒。

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