高 嵩，呂慶雪，何 歡，張建新，張志軍，宋廣樹，劉 偉

(1.吉林省農(nóng)業(yè)科學院，吉林 長春 130033；2.吉林省吉東種業(yè)有限責任公司，吉林 遼源 136299)

ZmUdt1基因編碼的核蛋白具有保守的bHLH結構域，調(diào)控著花藥絨氈層早期的細胞減數(shù)分裂，在減數(shù)分裂前期，突變體的花藥壁和小孢子母細胞是正常的；減數(shù)分裂期，絨氈層向著藥室內(nèi)擠壓，同時絨氈層肥大液泡化并且不能分化；突變體的小孢子母細胞，由于四分體時期胼胝質(zhì)形成不完善，使得小孢子母細胞向小孢子的發(fā)育不正常，因而不能完成減數(shù)分裂而降解，以至于中間層細胞退化，花粉囊內(nèi)花粉無法正常形成，最終導致完全雄性不育[1-2]。bHLH轉(zhuǎn)錄因子的主要作用在于對某些重要基因參與絨氈層和小孢子母細胞的分化，以及在中間層細胞的退化中起著調(diào)控作用，這意味著ZmUdt1蛋白可能屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子[3]。

具有分泌功能的絨氈層為花粉囊周圍的特殊細胞層，對植物的花粉發(fā)育過程有著非常重要的影響。絨氈層與配子體是直接相連的，位于四層孢子體細胞的最內(nèi)層，主要來自于前期細胞層的孢原細胞層的連接組織[4]。絨氈層細胞在花粉母細胞的減數(shù)分裂前期進行核內(nèi)有絲分裂，形成雙核或多核結構，RNA和蛋白質(zhì)含量較多，花粉粒發(fā)育所需養(yǎng)料由細胞內(nèi)油脂和類胡蘿卜素等營養(yǎng)物質(zhì)提供[5-6]。絨氈層發(fā)育的正常與否對雄性不育或敗育的發(fā)生影響十分明顯。1993年，Goldberg 等[7-8]通過使用細胞霉素基因在絨氈層中的特異表達，導致絨氈層消失，使得小孢子在早期就已經(jīng)凋亡，這一試驗證明了絨氈層在花粉發(fā)育過程中不可被替代的作用。

由于環(huán)境驟變或基因突變而導致雄性不育，雖然是植物本身發(fā)育的不良進化現(xiàn)象，但是對于植物新品種的選育，尤其在雜交育種上卻有十分重要的意義[3]。在實際的糧食生產(chǎn)中，雄性不育現(xiàn)象在玉米、水稻、小麥等高等作物中普遍存在，但大部分玉米不育系并不完全，雜交種中混有大量的自交系種子，使種子質(zhì)量受到嚴重影響。而雄性不育系則是保證雜交種純度、降低種子生產(chǎn)成本的良好材料[3]。ZmUdt1蛋白廣泛存在于植物體中，ZmUdt1 的變異影響植物的雄性不育，該基因在水稻中有著深入的研究，在玉米中尚未見報道。

筆者以水稻ZmUdt1 蛋白質(zhì)氨基酸序列同源克隆玉米中類似的基因BT068494.1(GenBank)，并利用相關生物信息學軟件及知識分析預測該蛋白的理化性質(zhì)、功能結構等，旨在為后期克隆該基因和功能鑒定奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以水稻OsUdt1(NCBI GenBank：AY953870.1)核苷酸以及蛋白質(zhì)為基礎，利用NCBI(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)Blast玉米的相關序列，得到與其高度相似的蛋白序列。

1.2 試驗方法

使用在線軟件ExPASy-ProtParam (http://web.expasy.org/protaparam/) 預測分析目的基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)(包括蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、等電點、氨酸組成、原子組成、脂肪系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)等)；使用在線軟件ExPASy-ProtScale (http://web.expasy.org/protscale/)對目的基因編碼蛋白質(zhì)進行疏水性分析；使用在線軟件 NPS@：SOPMA (https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測目的基因編碼蛋白的二級結構；使用在線軟件PHYRE2(http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)對目的基因編碼蛋白質(zhì)進行三級結構預測分析；通過在線軟件WoLF PSORT：(https：//wolfpsort.hgc.jp/)、TargetP 1.1 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)、iPSORT (http://ipsort.hgc.jp/)對目的基因進行亞細胞定位；使用在線軟件SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對目的基因進行信號肽預測；使用在線軟件 TMHMM Server，v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)蛋白跨膜區(qū)進行預測分析；使 用 在 線 軟 件 SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)、NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析目的基因編碼蛋白的功能結構域；NetPhos 3.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對目的基因進行磷酸化修飾位點預測；ProtFun 2.2 Server(http://cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)對目的基因進行預測；使用MEGA 7.0程序計算物種間的遺傳距離，并通過鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 玉米ZmUdt1序列的獲得

以水稻OsUdt1(AY953870.1)為參考序列，在NCBI BlastN中使用同源克隆的方法，在玉米基因組中得到蛋白同源性最高的基因BT068494.1(GenBank)位于玉米第2號染色體中，命名為ZmUdt1基因。

2.2 蛋白理化性質(zhì)的分析及一級結構預測

利用在線工具ExPASy提供的ProtParam工具預測玉米ZmUdt1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)[9]，結果如表1所示，該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為 74.23，大于 40，說明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白；平均疏水性為-0.497，初步判斷該基因為親水性蛋白。由圖1可知，該氨基酸序列第71位峰值最高，為2.000，第32位和第33位峰值最低，為-3.200，且峰值分布在0以下比分布在0以上的多，再次證明該蛋白為親水性蛋白。由圖2可知，玉米ZmUdt1氨基酸組成中，含量最高的為Glu(11.4%)，含量最低的為Pyl和Sec(0.0%)。

表1 ZmUdt1蛋白一級結構預測Tab.1 Predicting primary structure of ZmUdt1 protein

圖1 ZmUdt1蛋白疏水性預測Fig.1 Prediction of the ZmUdt1 protein hydrophobicity

2.3 蛋白二級結構三級結構預測

通過NPS@：SOPMA在線軟件分析玉米ZmUdt1蛋白的二級結構[10]，結果發(fā)現(xiàn)，玉米ZmUdt1蛋白主要由4種構象組成，其中，α-螺旋(Hh)比例最高，有99個氨基酸，占整體的45.21%；其次是無規(guī)則卷曲(Cc)，由69個氨基酸構成，占整體的31.51%；延伸鏈(Ee)和β-轉(zhuǎn)角(Tt)比例較少，分別含有38，13個氨基酸，占整體的17.35%和5.94%(圖3)。

通過在線軟件Phyre 2，依據(jù)同源建模理論預測玉米ZmUdt1蛋白的三級結構[11]，如圖4所示。以在PDB晶體庫中與玉米ZmUdt1蛋白可信度達到99.5%的c5gnjI(PDB id)作為模板，預測玉米ZmUdt1蛋白三級結構。玉米ZmUdt1蛋白的三級結構是由2個α-螺旋通過β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等連接形成的條形結構，這種結構與二級結構預測結果一致，且與水稻OsUdt1蛋白結構基本相同。

圖2 ZmUdt1的氨基酸組成及含量預測Fig.2 Predicted the amino acid composition and content in ZmUdt1

藍色.α-螺旋；玫紅色.無規(guī)則卷曲；紅色.延伸鏈；綠色.β-轉(zhuǎn)角。Blue.Alpha helix;Rose red.Random coil;Red.Extended strand;Green.Beta turn.

A.玉米；B.水稻。玫紅色.α-螺旋；藍色.β-轉(zhuǎn)角；白色.其他殘基。A.Zea mays; B.Oryza sativa.Rose red.Alpha helix;Blue.Beta turn;White.Other residues.

2.4 蛋白質(zhì)亞細胞定位預測

該基因的蛋白質(zhì)需要在細胞中處在特定的位置才能充分發(fā)揮其特定功能，因此，確定該蛋白基因在細胞中的位置，在一定程度上可以確定該蛋白基因的功能。通過在線軟件TargetP 1.1Server預測玉米ZmUdt1蛋白的分布位置，位于其他細胞器的可能性較大，不是分泌蛋白(表2)。

利用WoLF PSORT Prediction 預測蛋白的亞細胞定位情況可知，細胞核定位系數(shù)為6(nucl：6)，葉綠體定位系數(shù)為5(chlo：5)，質(zhì)粒定位系數(shù)為2(plas：2)，線粒體定位系數(shù)為1(mito：1)。使用iPSORT在線軟件預測結果如圖5所示，該蛋白不在葉綠體或線粒體中。綜上推測，玉米ZmUdt1蛋白位于細胞核的可能性較大。

2.5 蛋白的信號肽預測

使用SignalP 4.1對玉米ZmUdt1編碼產(chǎn)物進行信號肽分析，得到C、Y、S的值分別為0.109，0.114，0.158。一個典型的信號肽，C值和Y值應趨向于+1，S值在剪切位點前后應該先上升后下降，如圖6所示，可以判斷，ZmUdt1蛋白沒有信號肽。

利用iPSORT在線軟件預測結果顯示，沒有任何信號，也沒有葉綠體轉(zhuǎn)運肽和線粒體靶向肽，與SignalP 4.1分析結果一致。

2.6 蛋白的跨膜結構預測

分析跨膜蛋白的功能不僅可以了解特定生物膜的功能，而且有助于分離與這些功能相關的分子組分，同時能夠進一步確定蛋白的定位與功能[12-13]，通過TMHMM Server v 2.0進行該蛋白跨膜性預測分析，玉米ZmUdt1蛋白不具有跨膜結構，全部在膜外，與水稻OsUdt1蛋白相同(圖7)。

表2 ZmUdt1蛋白亞細胞定位預測Tab.2 Subcellular location of ZmUdt1 protein

圖5 ZmUdt1蛋白亞細胞定位預測數(shù)據(jù)分布Fig.5 Distribution map of subcellular localization of ZmUdt1 protein

圖6 ZmUdt1編碼產(chǎn)物信號肽的曲線Fig.6 Figure of signal peptide of maize ZmUdt1 coding product

2.7 蛋白的結構域預測

使用SMART分析玉米ZmUdt1蛋白的功能結構域，分布在26-43位的氨基酸為低成分復雜區(qū)域，分布在53-102位的氨基酸是螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)結構域，且不具有跨膜結構(圖8)，與TMHMM分析結果一致。

同時使用NCBI在線預測該蛋白的功能結構域(圖9)，結果發(fā)現(xiàn)，該蛋白屬于螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)超級家族，位于54-100位氨基酸之間，分析結果與SMART結果基本一致。玉米ZmUdt1蛋白與水稻OsUdt1蛋白同屬于HLH超級家族。

2.8 磷酸化修飾位點預測

磷酸化修飾具有重要作用，它能夠改變、調(diào)控酶活性，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)互作，蛋白質(zhì)與DNA/RNA 互作以及穩(wěn)定蛋白質(zhì)，例如，細胞內(nèi)外的信號傳導、細胞的生長代謝、分化、分裂等都與蛋白質(zhì)的磷酸化有關[14-15]。

A.玉米；B.水稻。圖8-9同。A.Zea mays; B.Oryza sativa.The same as Fig.8-9.

粉色.低成分復雜區(qū)域；紫色.功能結構域。Rose red.Low complexity domains;Purple.Functional domains.

圖9 NCBI對玉米ZmUdt1蛋白的保守結構域預測Fig.9 The conservative domain prediction of ZmUdt1 protein by NCBI

預測結果如圖10所示，玉米ZmUdt1蛋白磷酸化位點共有17個，其中，Ser 12個(Ser 9、Ser 10、Ser 50、Ser 81、Ser 84、Ser 87、Ser 120、Ser 122、Ser 124、Ser 126 、Ser 170和Ser 211)，Thr 3個(Thr 7、Thr 85和Thr 128)，Tyr 2個(Tyr 135和Tyr 184)。磷酸化過程是一個可逆的動態(tài)過程，由相應的激酶和磷酸酶分別催化磷酸化過程和去磷酸化過程[16]?？赡媪姿峄揎椩诨ㄋ幇l(fā)育過程中起著十分重要的作用[17]。

2.9 蛋白功能預測

通過對該蛋白功能的預測，進一步確定該基因的功能作用，使用ProtFun 2.2蛋白功能結構分類軟件進行預測[18]，從表3可以看出，其轉(zhuǎn)錄功能概率較大，推測其可能是轉(zhuǎn)錄因子。

圖10 玉米ZmUdt1蛋白磷酸化位點預測Fig．10 The phosphorylation sites prediction of ZmUdt1 protein

功能分類Functionalcategory概率Probability功能分類Functionalcategory概率Probability翻譯0.235信號轉(zhuǎn)導0.071TranslationSignaltransducer復制和轉(zhuǎn)錄0.320轉(zhuǎn)錄0.329ReplicationandtranscriptionTranscription調(diào)控功能0.228轉(zhuǎn)錄調(diào)控0.137RegulatoryfunctionsTranscriptionregulation

2.10系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以玉米ZmUdt1序列為探針，在NCBI上查詢各物種相關序列，結果發(fā)現(xiàn)，ZmUdt1和DYT1蛋白相似度較高[19-21]，使用MEGA 7.0軟件，構建了12個物種的ZmUdt1和DYT1系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖11可知，玉米與水稻、高粱等物種遺傳距離最近，它們首先聚為一支后再與海藻、芭蕉等聚在一起，與擬南芥的DYT1蛋白也有一定的遺傳相關性。

3 討論

玉米ZmUdt1蛋白是HLH超級家族，屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[22]，對不育基因起到一定的調(diào)控作用，研究該蛋白的結構和功能在培育花粉不育的玉米新品種中有著重要的理論意義[23]。本研究通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，ZmUdt1蛋白表現(xiàn)為親水性，是可溶性蛋白質(zhì)；通過亞細胞定位預測，該基因編碼產(chǎn)物位于細胞核的可能性較大，沒有信號肽以及跨膜結構，其編碼產(chǎn)物的二級結構主要是由α-螺旋與無規(guī)則卷曲構成，在質(zhì)膜中發(fā)揮生物學作用；通過預測，該蛋白具有翻譯、復制與轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導等功能，具有17個磷酸化修飾位點，可逆磷酸化修飾在花藥發(fā)育過程中起著十分重要的作用，為進一步證明該蛋白是控制絨氈層形成的轉(zhuǎn)錄因子提供了依據(jù)，而對于其他幾種功能尚未確定。

圖11 ZmUdt1蛋白與其他生物ZmUdt1和DYT1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.11 Phylogenetic tree of ZmUdt1 protein and other biological ZmUdt1 and DYT1 proteins

由于Udt1基因相關的研究報道較少，通過比較以及相關數(shù)據(jù)分析，Udt1與DYT1蛋白的相似性極高且有一定的遺傳相關性。DYT1蛋白是絨氈層發(fā)育中期表達的bHLH 類轉(zhuǎn)錄因子，通過試驗發(fā)現(xiàn)，DYT1在花藥發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄水平與翻譯水平上的表達上可能存在差異，可能與RNA轉(zhuǎn)錄后的加工修飾有關[2]；轉(zhuǎn)錄因子DYT1對中層細胞的退化可能不是關鍵影響因子，但對完成中層細胞的退化可能發(fā)揮關鍵作用[24]；DYT1和TDF1以及位于其下游的AMS、MS188、MS1和TEK 這4個轉(zhuǎn)錄因子能夠形成2條遺傳通路來控制絨氈層的發(fā)育：“DYT1→TDF1→AMS→MS188→MS1”控制花粉外壁外層的形成[25]， “DYT1→TDF1→AMS→TEK”控制花粉外壁內(nèi)層的形成[26]。DYT1與水稻中的OsUdt1基因高度同源[27-28]，因此，通過了解DYT1基因及水稻OsUdt1基因功能推測玉米中ZmUdt1基因的相關功能，二者同屬bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子，編碼產(chǎn)物在花藥發(fā)育早期表達，調(diào)節(jié)花粉發(fā)育相關的基因，突變體在減數(shù)分裂時期，絨氈層發(fā)生不正常的空泡化，花粉母細胞不分裂為小孢子，逐漸解體，造成雄性不育[29-30]。絨氈層發(fā)育過程并非獨立的過程，受到各個基因共同調(diào)控的作用與結果，其中任何一個基因的影響都可能引起花粉不育，ZmUdt1只是其中的一個，隨著不斷地深入研究，會發(fā)現(xiàn)更多影響不育的基因，從而創(chuàng)造人工玉米不育系新品種，提高品種純度，縮短育種周期。

玉米ZmUdt1蛋白在植株中實際的功能表達，還需要具體的分子生物學試驗及田間表現(xiàn)來驗證。為了保證預測準確性，盡量減少誤差，各類數(shù)據(jù)均采用了多種不同軟件進行分析，所使用的原理和算法各有不同，但結果基本一致。因此，本研究預測結果具有較高可信度。但由于生物信息學是根據(jù)已知的信息預測未知的結果，所以還有很大的局限性和不確定性。進一步確定蛋白質(zhì)的性質(zhì)與功能，還需通過具體生物學試驗驗證，同時為玉米ZmUdt1的性質(zhì)與功能提供了一定的理論依據(jù)，為后續(xù)研究ZmUdt1基因在玉米中的功能研究奠定了基礎。

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