張?jiān)茪g，鄭文博，趙 美，王陳驕子，周而勛，舒燦偉

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，植物病理學(xué)系，廣東省微生物信號與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

水稻紋枯病(Rice sheath blight)是世界性的水稻真菌病害之一[1]。近年來，隨著水稻矮稈多蘗品種的密植以及氮肥過量施用等原因，水稻紋枯病逐漸成為危害水稻生產(chǎn)的第一大病害[2]，每年可導(dǎo)致數(shù)億公斤水稻產(chǎn)量的損失，嚴(yán)重時(shí)可以使水稻減產(chǎn)50%，甚至絕收[3]。根據(jù)我國農(nóng)技中心(http：//www.natesc.agri.cn/)的預(yù)測，水稻紋枯病今年在全國稻區(qū)發(fā)生面積將達(dá)到1 766.67萬hm2，在南方稻區(qū)發(fā)病嚴(yán)重。

水稻紋枯病的病原菌為立枯絲核菌 (R.solaniAG1-IA)，該菌在自然條件下不產(chǎn)生有性孢子，而是產(chǎn)生菌絲和菌核[4]。菌核是由菌絲糾結(jié)而成的堅(jiān)硬而且高度黑色素化的結(jié)構(gòu)。菌核可以通過殘留在土壤中進(jìn)行越冬，是病害初侵染的主要來源[5]。田間菌核殘留量與紋枯病的發(fā)病情況成正比，降低田間的菌核量可有效減少水稻紋枯病的發(fā)生[6]。因此，研究水稻紋枯病菌菌核發(fā)育的關(guān)鍵因子，探索調(diào)節(jié)菌核發(fā)育的基因，對于防治水稻紋枯病具有重要的意義。

菌核發(fā)育過程與細(xì)胞的氧化脅迫有關(guān)[7]。當(dāng)真菌遭受氧化脅迫時(shí)，細(xì)胞中的活性氧物質(zhì)(Reactive oxygen species，ROS)含量會上升，ROS會激活細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，使未分化的菌絲開始分化形成菌核結(jié)構(gòu)以抵御細(xì)胞中過量的ROS，減少ROS對細(xì)胞的損害，以保存真菌的生命力。當(dāng)生物細(xì)胞響應(yīng)氧化脅迫反應(yīng)時(shí)，一些酶(如過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD))以及非酶類保護(hù)系統(tǒng)(如谷胱甘肽(GSH)和硫氧還蛋白)會保護(hù)細(xì)胞免受傷害[8]。

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)最初是在1888年由法國科學(xué)家Rey-Pailhade在酵母中發(fā)現(xiàn)，由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸組成，是廣泛存在于生物體內(nèi)具有重要生理功能的三肽化合物[9]。GSH結(jié)構(gòu)中活潑的巰基基團(tuán)與自由基結(jié)合，從而對于細(xì)胞清除活性氧起到重要作用[10]，而在這個(gè)過程中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase，GST)起了重要的催化作用[11]。

GST是一種超家族蛋白酶，具有解毒和抗氧化功能[12]，廣泛存在于各種生物體的各組織細(xì)胞內(nèi)。真菌的GST在結(jié)構(gòu)和功能上分化程度大，已報(bào)道真菌GST主要參與氧化應(yīng)激、解毒等生物學(xué)進(jìn)程。魏濤[13]研究發(fā)現(xiàn)，在煙曲霉(Aspergillusfumigatus)GST家族中，不同GST蛋白的底物譜有很大差異，對于同一底物酶活性也有很大差異，說明GST蛋白的功能出現(xiàn)了分化；張媛[14]研究發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)中，GST的編碼基因(PcgstA、PcgstB和PcgstC)的氨基酸序列都具有保守的GST功能域，但在結(jié)構(gòu)和功能上仍存在差異。Cho等[15]對裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)進(jìn)行氯化汞等脅迫處理誘導(dǎo)了GST基因表達(dá)，說明GST基因參與氧化脅迫反應(yīng)。此外，Veal等[16]對裂殖酵母的3個(gè)GST基因進(jìn)行突變后，發(fā)現(xiàn)突變體比野生型對氟康唑更加敏感，表明GST基因參與了抗真菌藥物的解毒過程。

前期筆者通過RNAseq技術(shù)研究了水稻紋枯病菌菌核發(fā)育過程的基因差異表達(dá)，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)編碼GST的Unigene差異表達(dá)顯著。本研究對Rsgst進(jìn)行生物信息學(xué)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，并進(jìn)一步研究該基因在菌核形成過程的表達(dá)模式和GST酶活變化趨勢，旨在為進(jìn)一步研究該基因的功能提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 水稻紋枯病病菌(R.solaniAG1-IA)野生型菌株GD-118由廣東省微生物信號與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 菌株的培養(yǎng) 用打孔器在已活化的水稻紋枯病菌菌落邊緣打取菌塊，將菌塊接種在鋪好玻璃紙的PDA平板上，在25 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，分別在36，48，60 h刮取培養(yǎng)皿的菌絲，在72 h及5 ，7 d用滅菌的鑷子收集培養(yǎng)皿上的菌核。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，樣品收集后放于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要試劑 真菌RNA提取試劑盒(貨號：9767)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：AT341)、qRT-PCR試劑盒(貨號：AT341)均購自大連TaKaRa公司。谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)測試盒(貨號：A004)購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水稻紋枯病病菌GST基因(Rsgst)生物信息學(xué)分析 通過已公布的水稻紋枯病菌基因組數(shù)據(jù)庫(RSIADB，http：//genedenovoweb.ticp.net：81/rsia/index.php?m=index&f=index)查找Rsgst序列，確定該基因在水稻紋枯病菌基因組中的精確位置。核酸及氨基酸序列的分析、理化性質(zhì)分析利用ProtParam(http：//www.expasy.org/tools/protparam.html)進(jìn)行。利用ScanProsite(http：//prosite.expasy.org/scanprosite/)預(yù)測其所包含的功能域。利用KinasePhos(http：//kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/)軟件對其蛋白質(zhì)序列進(jìn)行激酶磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測。利用COILS(http：//www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html)軟件對序列進(jìn)行卷曲螺旋預(yù)測。利用PSIPRED(http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)在線軟件對GST蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。通過PHYRE2 (http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)在線服務(wù)器對GST蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測分析。通過對半知菌類立枯絲核菌的GST基因編碼的氨基酸序列與煙曲霉(A.fumigatus)、禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、擴(kuò)展青霉菌(Penicilliumexpansum)、綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)、小孢根霉(Rhizopusmicrosporus)、膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、玉米絲黑穗病菌(S.reilianum)和褐座堅(jiān)殼菌(Rosellinianecatrix)等9類病原菌進(jìn)行氨基酸序列多重比對，利用MEGA 5.0的臨近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)置了1 000次重復(fù)，其他均為默認(rèn)設(shè)置。

1.2.2 水稻紋枯病病菌菌核發(fā)育過程中Rsgst的表達(dá)分析 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄：真菌總RNA的提取步驟參照產(chǎn)品說明書。RNA的質(zhì)量用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，RNA的純度用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)(Thermo Scientific，Wilmington，DE)進(jìn)行檢測。RNA的反轉(zhuǎn)錄：取1 μg RNA，加入4 μL 5×TransScript?ALL-in-One SuperMix for qPCR和1 μL gDNA Remover，最終加無RNase水至20 μL。輕輕混勻后，42 ℃孵育15 min，再在85 ℃下加熱5 s。

熒光定量PCR分析：根據(jù)該基因的CDS全長序列設(shè)計(jì)熒光定量引物RsgstF(5′-ATATACGCCTACCTAAGC-3′)和RsgstR(5′-CTTGACAGTGACCATATTG-3′)。qPCR反應(yīng)體系如下，10 μL 2×TransScript?Top Green qPCR SuperMix，0.4 μL引 物(10 μmol/L)，2 μL cDNA模板，加ddH2O定容至20 μL。反應(yīng)程序設(shè)定如下：預(yù)變性 94 ℃ 30 s；變性94 ℃，5 s，退火55 ℃，15 s，延伸72 ℃，10 s，共40個(gè)循環(huán)。所有試驗(yàn)都設(shè)3次重復(fù)。樣品間基因相對定量比較用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，相對表達(dá)量的公式是R=2-(ΔCt(目的基因)-ΔCt(內(nèi)參基因) )，ΔΔCt=(Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因))-(Ct(校正)-Ct(內(nèi)參基因))?；虮磉_(dá)水平通過水稻紋枯病菌的三磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因進(jìn)行校正。

1.2.3 水稻紋枯病病菌菌核發(fā)育過程中GST酶活測定 根據(jù)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)試劑盒上的步驟進(jìn)行操作：稱量0.3 g樣品用50 mmol/L磷-EDTA溶液沖洗2～3次后，將樣品放入研缽中，加入液氮研磨成粉狀，按照1∶2(m/V)體系加入50 mmol/L磷酸緩沖液(pH=7)，繼續(xù)研磨，將研磨后的懸浮液在15 000 r/min離心10 min。取100 μL上清液，加入300 μL基質(zhì)液，充分混勻后在37 ℃水浴30 min，再加入2 mL試劑二(試劑盒提供)，混勻后以3 500 r/min離心10 min，取上清液作顯色反應(yīng)。對照管在水浴后加入100 μL上清液，其他操作步驟相同。取上述上清液2 mL分別加入2 mL試劑三(試劑盒提供)和0.5 mL試劑四(試劑盒提供)，混勻后室溫靜置15 min，在紫外分光光度計(jì)412 nm處進(jìn)行比色。以加入2 mL的20 μmol/L GSH標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)準(zhǔn)管，以加入2 mL的試劑二(試劑盒提供)作為空白管，其他操作步驟相同。所有試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

組織中GST活力公式為：

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 所得的數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Rsgst的生物信息學(xué)分析

2.1.1Rsgst在基因組中定位 在RSIADB網(wǎng)站搜索Rsgst在水稻紋枯病病原菌基因組中的定位，該基因在NCBI的登錄號為443926675，基因全長1 207 bp，CDS全長為834 bp，共編碼277個(gè)氨基酸。該基因在病原菌與寄主互作蛋白數(shù)據(jù)庫(Pathogen-hostinteractiondatabase，PHI)和碳水化合物活性酶類數(shù)據(jù)庫(CAZy)沒有得到注釋。該基因在水稻紋枯病菌基因組scaffold1正鏈的2 084 816-2 086 022位置。

2.1.2 理化性質(zhì)分析 利用ProtParam在線分析工具分析GST蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)含有277個(gè)氨基酸殘基，分子量為30.90 ku，理論等電點(diǎn)為9.42，預(yù)測該蛋白質(zhì)在280 nm處的吸光度為1.031～1.039，不穩(wěn)定系數(shù)為48.71，脂肪系數(shù)為88.74，蛋白質(zhì)的平均疏水性為-0.253。

如表1所示，組成GST蛋白的氨基酸主要有酸性氨基酸、堿性氨基酸、非極性R基氨基酸和不帶電荷的極性R基氨基酸4種。其中，以亮氨酸(Leu)比例最高，為12.3%；色氨酸(Trp)比例最低，為0.7%。從氨基酸所屬種類來看，GST蛋白所占有的非極性R基氨基酸比例最高，為47%；而酸性氨基酸所占比例最低，為10.5%。

2.1.3 結(jié)構(gòu)域功能分析 利用ScanProsite軟件對GST蛋白序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該序列ID為USERSEQ1，GST序列包含2個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，分別是C-端結(jié)構(gòu)域(Pfam 登錄號：PF00043.19)和N-端結(jié)構(gòu)域(Pfam 登錄號：PF02798.14)。GST編碼蛋白的功能域中含有2個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，在N端含有一個(gè)GST-NTER結(jié)構(gòu)蛋白，位于序列第7-93位氨基酸；在C端含有一個(gè)GST-CTER結(jié)構(gòu)蛋白，位于序列第101-202位氨基酸(圖1)。

表1 GST蛋白的氨基酸的組成Tab.1 Amino acid composition of GST protein

2.1.4 激酶磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測 利用KinasePhos軟件對GST蛋白序列進(jìn)行激酶磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測，結(jié)果顯示，有2個(gè)絲氨酸(S)激酶、3個(gè)酪氨酸(Y)激酶潛在的磷酸化位點(diǎn)，0個(gè)蘇氨酸(T)激酶磷酸化位點(diǎn)，且在氨基酸序列221位置上有一個(gè)激酶磷酸化位點(diǎn)可以催化2種激酶，分別為蛋白激酶G(Protein kinase G，PKG)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cell division cycle 2，cdc2)。

2.1.5 蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用COILS軟件對序列進(jìn)行卷曲螺旋預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白沒有明顯卷曲螺旋。利用PSIPRED在線軟件對GST蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示，發(fā)現(xiàn)GST中氨基酸殘基組成以α-螺旋為主，占41.52%，有32個(gè)氨基酸殘基組成β-折疊，占11.55%。

圖1 GST蛋白的結(jié)構(gòu)域Fig.1 The protein domain of GST

圖2 GST蛋白二級結(jié)構(gòu)圖示Fig.2 The model of the secondary structure of GST protein

通過PHYRE2在線服務(wù)器對GST蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測分析，獲得了該蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型(圖3)。

圖3 預(yù)測的GST蛋白三維結(jié)構(gòu)Fig.3 The predicted tertiary structure of GST

2.1.6 系統(tǒng)發(fā)育分析 通過MEGA 5.0構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，立枯絲核菌不同融合群之間GST的氨基酸(R.SolaniAG-1 IA)序列都聚在一個(gè)大的分支中，其中，水稻紋枯病菌單獨(dú)一個(gè)分支，而立枯絲核菌融合群3和融合群8親緣關(guān)系比較近；立枯絲核菌GST與擔(dān)子菌類玉米絲黑穗病菌(Sporisoriumreilianum)GST親緣關(guān)系最近，與半知菌類煙曲霉(A.fumigatus)、禾谷鐮孢菌(F.graminearum)、膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)GST親緣關(guān)系次之，與小孢根霉(R.microsporus)GST親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖4)。

圖4 GST的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of GST

2.2 水稻紋枯病病菌菌核發(fā)育過程中Rsgst的表達(dá)量

2.2.1 菌核發(fā)育過程樣品收集和RNA提取 本研究選定立枯絲核菌菌核發(fā)育過程中6個(gè)階段的病菌樣品，結(jié)果如圖5所示，初期在培養(yǎng)皿上長出白色菌絲，在48 h時(shí)菌絲長滿培養(yǎng)皿，之后菌絲逐漸糾結(jié)在一起，在60 h時(shí)開始形成白色菌核。菌核不斷發(fā)育積累黑色素，在72 h時(shí)已有黑核出現(xiàn)，此后菌核繼續(xù)發(fā)育成質(zhì)地堅(jiān)硬的黑核，在7 d時(shí)黑核發(fā)育成熟。

A.菌核發(fā)育36 h；B.菌核發(fā)育48 h；C.菌核發(fā)育60 h；D.菌核發(fā)育72 h；E.菌核發(fā)育5 d；F.菌核發(fā)育7 d。

A.Sclerotial development 36 h; B.Sclerotial development 48 h;C.Sclerotial development 60 h；D.Sclerotial development 72 h;E.Sclerotial development 5 d；F.Sclerotial development 7 d.

圖5水稻紋枯病菌菌核發(fā)育過程的6個(gè)階段
Fig.5SixstagesofsclerotialdevelopmentofR.solaniAG1-IA

分別提取了上述樣品的RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，所提取的RNA條帶清晰、完整，無拖帶和降解；RNA的純度用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)(Thermo Scientific，Wilmington，DE)檢測，結(jié)果表明，OD260/280的值為1.9～2.1，說明RNA質(zhì)量和純度合格，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.2 水稻紋枯病菌菌核發(fā)育過程中Rsgst表達(dá)規(guī)律 利用qRT-PCR檢測Rsgst在菌核發(fā)育過程中的表達(dá)規(guī)律，如圖6所示，Rsgst在菌絲逐漸發(fā)育過程中表達(dá)量逐漸上升，在60 h時(shí)(白核開始發(fā)育時(shí)期)達(dá)到最高表達(dá)量(7.64)，該階段表達(dá)量約為36 h時(shí)的7.64倍，之后該基因的表達(dá)量呈逐漸下調(diào)趨勢，在黑核發(fā)育成熟時(shí)(7 d)表達(dá)量達(dá)到最低，為0.41。

a、b、c、d、e為方差分析結(jié)果，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖7同。a，b，c，d and e are the result of variance analysis，different letter showed significant difference(P<0.05).The same as Fig.7.

2.3 水稻紋枯病菌菌核發(fā)育過程中GST酶活測定

利用GST酶活測定試劑盒測定水稻紋枯病菌菌核發(fā)育過程中GST酶活性，結(jié)果如圖7所示，在36 h時(shí)GST的酶活性為0.108 U/μg；隨著菌核不斷發(fā)育，GST的酶活性大致呈增長趨勢，在第5天時(shí)GST的酶活性最高，達(dá)到了0.375 U/μg；隨后該酶的活性迅速降低，在第7天酶活性僅為0.235 U/μg。

圖7 6個(gè)階段的GST酶活Fig.7 The activity of GST in six stages

3 討論

GST是一類超家族蛋白酶。在哺乳動物中，GST可以根據(jù)一級序列被劃分為8個(gè)主要亞家族[17]。在真菌中，GST很難分類，因?yàn)闊o論是在結(jié)構(gòu)上還是在功能上，GST都具有多樣性[18]。因此，真菌中主要根據(jù)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶催化過程中催化殘基的類型進(jìn)行劃分，分為酪氨酸催化(Tyr-)、絲氨酸催化(Ser-)、半胱氨酸催化(Cys-)三大類[19]。對水稻紋枯病菌GST蛋白激酶磷酸化修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有絲氨酸/酪氨酸激酶修飾位點(diǎn)，因此，可以推測該菌的GST蛋白是酪氨酸催化(Tyr-)/絲氨酸催化(Ser-)蛋白酶家族成員。從遺傳進(jìn)化樹的結(jié)果也可以發(fā)現(xiàn)，立枯絲核菌不同融合群的GST氨基酸序列聚在一個(gè)大分支中，說明它們的氨基酸序列中有些序列相對保守，立枯絲核菌GST與擔(dān)子菌類的玉米絲黑穗病菌(S.reilianum)GST親緣關(guān)系最近，推測是同一家族成員。在結(jié)構(gòu)域功能分析中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水稻紋枯病菌的GST序列包含2個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，分別是C-端結(jié)構(gòu)域和N-端結(jié)構(gòu)域。其中，N端結(jié)構(gòu)域含有G位點(diǎn)能夠特異性與GSH結(jié)合，C端結(jié)構(gòu)域含有H位點(diǎn)與特異性結(jié)合底物有關(guān)[20]。推測這2個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)τ贕ST行使其功能催化GSH與底物結(jié)合來清除活性氧有作用。

對水稻紋枯病菌菌核發(fā)育6個(gè)階段的GST酶活進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在菌絲階段該酶的活性逐漸上升，在白核轉(zhuǎn)化為黑核階段(5 d)活性達(dá)到最高峰，qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rsgst在菌核發(fā)育初期(60 h)時(shí)的表達(dá)量最高。本研究發(fā)現(xiàn)，GST酶蛋白的活性和基因的表達(dá)趨勢不一致，這與戴瀚洋等[21]結(jié)果類似，其原因可能是因?yàn)镚ST是一種超基因家族酶，有多個(gè)基因共同調(diào)節(jié)其活性變化。Fujimiya等[22]也發(fā)現(xiàn)，人類肝臟中GST mRNA的表達(dá)與活性的相關(guān)性與GST的基因型有關(guān)，不同基因型的酶蛋白mRNA的表達(dá)量與酶活性相關(guān)性有顯著差異。此外，mRNA轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控和翻譯后的修飾都可能導(dǎo)致mRNA的表達(dá)水平和蛋白酶活力水平不一致[23]。但在這個(gè)過程中，GST蛋白的表達(dá)和活性都出現(xiàn)了顯著變化，說明GST基因響應(yīng)了菌核發(fā)育過程。

在小鼠睪丸中研究發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)共同參與了體內(nèi)自由基代謝的調(diào)節(jié)，在小鼠氧化應(yīng)激時(shí)，GSH可以作為GST或者GPx的底物清除小鼠體內(nèi)的氧自由基[27]。在植物中研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植物受到低溫脅迫時(shí)，活性氧含量上升，GST會催化GSH與膜脂過氧化物結(jié)合，從而使植物的細(xì)胞減少損傷[28]。由此推測，GST通過催化GSH與活性氧結(jié)合從而來消除活性氧。而到了菌核發(fā)育的成熟階段，菌核的形態(tài)不再變化，菌核作為一個(gè)休眠結(jié)構(gòu)，此時(shí)細(xì)胞中的活性氧物質(zhì)含量不斷降低，因此在成熟階段，菌核中產(chǎn)生的GST的量也相對減少了。Zhou等[29]在研究HL-60細(xì)胞凋亡過程中發(fā)現(xiàn)，GST和ROS存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，細(xì)胞內(nèi)ROS水平不斷上升，GST水平不斷降低，細(xì)胞抗氧化能力減弱，導(dǎo)致死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，在菌核成熟時(shí)GST表達(dá)量逐漸下降，這表明了水稻紋枯病菌在菌核發(fā)育過程通過產(chǎn)生GST來平衡細(xì)胞中的有毒活性氧物質(zhì)，對菌核的發(fā)育具有調(diào)節(jié)作用。因此，推測在絲狀真菌中GST作為一種抗氧化劑通過調(diào)節(jié)活性氧代謝來響應(yīng)菌核發(fā)育，但GST如何調(diào)節(jié)活性氧代謝來調(diào)節(jié)菌核發(fā)育還有待于進(jìn)一步研究。

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