吳蔚蔚，童普國，王 鑫，閻 新，李紹波，歐陽解秀，2

(1.南昌大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330031；2.南昌大學(xué) 醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心，江西 南昌 330031)

低溫、干旱、鹽堿等非生物脅迫是限制作物持續(xù)高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)的主要逆境因子[1]。因此，從作物中篩選和分離抗性基因，并在作物自身中進行抗性基因功能發(fā)揮相關(guān)的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制研究，將為進一步開展作物抗逆分子育種奠定重要基礎(chǔ)[2-3]，為我國乃至整個世界糧食安全提供保障。

一些富含脯氨酸/甘氨酸的蛋白家族已被證實在植物生長發(fā)育和逆境適應(yīng)中扮演著十分重要的角色[4-6]。這些富含脯氨酸/甘氨酸的蛋白家族種類較多，包括GRP(Glycine-rich protein)、PRP(Proline-rich protein)和GPRP(Glycine-and proline-rich protein)等[4，7-8]。其中，一些GRP 和PRP 蛋白是組成植物細(xì)胞壁的重要結(jié)構(gòu)蛋白，在植物病蟲害防御、耐旱和抗冷等方面具有重要的作用[9-11]。GPRP 則是與上述2類植物細(xì)胞壁蛋白(GRP 和PRP)明顯不同的一類，同時是富含脯氨酸和甘氨酸的新型蛋白，它與細(xì)胞膜密切相關(guān)[7，12]，可能屬于跨膜蛋白[4]，但其在植物生長發(fā)育和逆境適應(yīng)中的生物學(xué)功能還有待進一步研究。

根據(jù)前人報道的結(jié)果[4，7]，并利用生物信息學(xué)分析，我們獲得了3個候選的水稻OsGPRP基因家族成員LOC_Os05g02780、LOC_Os03g60470和LOC_Os05g02770。本研究擬利用RT-PCR和測序等方法克隆這3個水稻OsGPRP基因的cDNA序列，進而分析其編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；同時，在分析這3個水稻OsGPRP家族基因啟動子順式作用元件的基礎(chǔ)上，進一步分析了水稻幼苗中3個OsGPRP基因在RNA轉(zhuǎn)錄水平上對干旱和低溫脅迫的響應(yīng)模式，為深入研究這些基因在水稻逆境適應(yīng)中的功能及其功能發(fā)揮的分子機理奠定基礎(chǔ)，也為水稻和其他作物分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料種植、逆境處理和取樣

選取飽滿、健壯的粳稻中花11種子，用75%的酒精和5%的NaClO消毒在28 ℃浸種發(fā)芽后，于光照培養(yǎng)箱中水培培養(yǎng)，培養(yǎng)的光周期是16 h光照和8 h黑暗，光照和黑暗培養(yǎng)的溫度分別為28，20 ℃。生長25 d的幼苗，用于脅迫處理。參考Kim等[13]和Liu等[14]的方法，用紗布吸去幼苗根部水分于相同的光照培養(yǎng)箱中進行干旱處理至明顯卷葉取樣；參考Liu等[14]和Perez-Diaz等[15]的方法，在同樣的另一光照培養(yǎng)箱中8 ℃處理48 h取樣。干旱和低溫脅迫處理取樣均分為地上部(包括葉、莖和鞘，即Shoot)和地下部(根，即Root)，取3次生物學(xué)重復(fù)的樣品，取樣后立即用液氮速凍于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 總RNA提取和cDNA獲得

參考孫利軍等[16]的方法，主要采用TRIzol法提取凍存的各種水稻組織中的總RNA，利用TaKaRa公司的AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成獲得水稻各種組織的cDNA。

1.3 水稻OsGPRP基因的cDNA克隆和編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

依據(jù)phytozome網(wǎng)站(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)上3個水稻OsGPRP1(LOC_Os05g02780)、OsGPRP2(LOC_Os03g60470)和OsGPRP3(LOC_Os05g02770)基因信息，設(shè)計特異引物(表1)，以幼苗的根、莖、葉和幼穗的混合cDNA為模板，利用TOYOBO公司的KOD plus高保真酶進行PCR擴增3個OsGPRP基因的cDNA序列，PCR程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火(OsGPRP1為57 ℃退火30 s；OsGPRP2為58 ℃退火30 s；OsGPRP3為60 ℃退火30 s)，72 ℃延伸45 s，28個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴增結(jié)束后，將純化的目的片段連接到TaKaRa Biotechnology公司的pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抗性篩選獲得陽性克隆后搖菌并提取質(zhì)粒，送上海生工進行測序分析。利用ClustalX program (ver 1.83)軟件，參考Peng等[4]和Marty等[7]的報道，分析3個水稻OsGPRP基因cDNA所編碼的蛋白保守結(jié)構(gòu)域。

1.4 啟動子順式作用元件分析

在phytozome網(wǎng)站上下載獲得3個水稻OsGPRP基因起始密碼子上游2 kb的基因組序列，再利用PlantCARE database (http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析3個水稻OsGPRP基因啟動子的順式作用元件[14，17]。

1.5 熒光定量PCR分析

參考Liao等[18]和杜方等[19]的方法，設(shè)計3個水稻OsGPRP基因的熒光定量PCR引物(表1)，以O(shè)sActin1(LOC_Os03g50885)為內(nèi)參，在StepOnePlus PCR 儀(ABI，USA)上進行qRT-PCR反應(yīng)，每個反應(yīng)均設(shè)3 次重復(fù)。三步法qRT-PCR反應(yīng)程序設(shè)為：95 ℃預(yù)變性3 min；40個循環(huán)反應(yīng)(95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s)；溶解曲線階段(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，以每秒上升0.3 ℃的速度升溫到95 ℃，95 ℃ 15 s)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)熒光定量PCR的擴增曲線和溶解曲線，表達量分析采用2-ΔΔCt計算。

表1 水稻OsGPRP基因cDNA克隆和qRT-PCR擴增的引物和產(chǎn)物大小Tab.1 Primers and amplicon sizes used for OsGPRP cDNA cloning and qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻OsGPRP基因的cDNA克隆及保守結(jié)構(gòu)域分析

以水稻幼苗根、莖、葉和幼穗的混合cDNA為模板，根據(jù)設(shè)計的特異引物(見材料與方法1.3)，經(jīng)RT-PCR擴增獲得了大小約為653，665，547 bp的單一cDNA目的片段(圖1)，將這些片段回收后經(jīng)TA克隆、測序和Blast軟件分析發(fā)現(xiàn)，OsGPRP1、OsGPRP2和OsGPRP3分別包含197，180，170個氨基酸，且均具有3個保守結(jié)構(gòu)域即N端的XYPP重復(fù)區(qū)域、中部富含A(丙氨酸)的疏水區(qū)(Hydro domain)和C端HGK重復(fù)序列(圖2)，因而屬于典型的植物GPRP蛋白家族成員[4，7]。

M.DNA Marker；1.OsGPRP1 PCR產(chǎn)物；2.OsGPRP2 PCR產(chǎn)物；3.OsGPRP3 PCR產(chǎn)物。M.DNA Marker；1.PCR product of OsGPRP1；2.PCR product of OsGPRP2；3.PCR product of OsGPRP3。

圖2 水稻OsGPRP蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 Conserved motifs in the rice OsGPRPs

2.2 水稻OsGPRP基因的啟動子順式作用元件分析

基因啟動子順式作用元件分析結(jié)果表明(表2)，3個水稻OsGPRP基因啟動子中除含有與植株生長發(fā)育和激素調(diào)控相關(guān)的順式作用元件外，還含有許多與非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，但3個水稻OsGPRP基因啟動子所含的非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件種類和數(shù)目存在一定的差異；其中，OsGPRP1啟動子中含有2個ARE、3個HSE、2個LTR和1個TC-rich repeats共4類作用元件；OsGPRP2啟動子中含有1個GC-motif、1個HSE、1個ARE、1個LTR、1個WUN-motif和2個MBS共6類作用元件；OsGPRP3啟動子中含有1個TC-rich repeats、4個MBS和3個ARE共3類作用元件，其中，ARE為3個水稻OsGPRP啟動子所共有的非生物脅迫作用元件。由此表明，這些水稻OsGPRP基因在RNA轉(zhuǎn)錄表達水平上可能受到不同非生物脅迫的誘導(dǎo)。

表2 水稻OsGPRP基因的啟動子順式作用元件Tab.2 cis-elements in the promoters of rice OsGPRPs

注：順勢作用元件上的數(shù)字上標(biāo)代表該基因中包含該類順式作用元件的數(shù)量，沒有數(shù)字上標(biāo)代表該基因中僅包含有一個該類順式作用元件。ABRE.脫落酸響應(yīng)元件；TGA-element.植物激素響應(yīng)元件；CGTCA-motif、TGACG-motif.茉莉酸甲酯調(diào)控元件；ERE.乙烯反應(yīng)元件；TCA-element.水楊酸響應(yīng)元件；TATC-box、GARE-motif.赤霉素響應(yīng)元件；CE3.ABA和VP1響應(yīng)元件；O2-site.新陳代謝調(diào)控元件；ARE.厭氧感應(yīng)調(diào)控元件；HSE.熱應(yīng)激調(diào)控元件；LTR.低溫響應(yīng)元件；TC-rich repeats.脅迫響應(yīng)元件；MBS.參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點；GC-motif.增強誘發(fā)厭氧反應(yīng)；WUN-motif.創(chuàng)傷響應(yīng)元件；GCN4-motif、Skn-1-motif.胚乳表達調(diào)控元件； 5UTR Py-rich stretch.調(diào)控高轉(zhuǎn)錄水平元件； Circadian.生理周期調(diào)控元件。

Note：The superscript numbers of thecis-element represents the number of thecis-element pesent in the promoter，cis-element with no superscript are the onlycis-element present in the promoter.ABRE.cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness; TGA-element.Auxin-responsive element; CGTCA-motif and TGACG-motif.cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness; ERE.Ethylene-responsive element; TCA-element.cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness; TATC-box and GARE-motif.cis-acting element involved in gibberellin-responsiveness; CE3.cis-acting element involved in ABA and VP1 responsiveness; O2-site.cis-acting regulatory element involved in zein metabolism regulation; ARE.cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction; HSE.cis-acting element involved in heat stress responsiveness; LTR.cis-acting element involved in low-temperature responsiveness; TC-rich repeats.cis-acting element involved in defense and stress responsiveness; MBS.MYB binding site involved in drought-inducibility; GC-motif.Enhancer-like element involved in anoxic specific inducibility; WUN-motif.Wound-responsive element; GCN4-motif and Skn-1-motif.cis-regulatory element involved in endosperm expression; 5UTR Py-rich stretch.cis-acting element conferring high transcription levels; Circadian.cis-acting regulatory element involved in circadian control.

2.3 水稻OsGPRP家族成員對干旱的響應(yīng)

以水稻OsActin1為內(nèi)參，未處理為空白對照組，干旱脅迫下OsGPRP家族成員在水稻地上部和地下部的表達變化情況如圖3所示。其中，OsGPRP1在水稻幼苗地上部和地下部的表達量略有上升，但差異均不顯著；OsGPRP2在水稻幼苗地上部的表達量上升差異不顯著，而在地下部的表達量則呈極顯著上升；OsGPRP3在水稻幼苗地上部和地下部的表達量均為極顯著上升。

** .P < 0.01水平上差異極顯著。**.Indicates significant difference at level of P < 0.01.

2.4 水稻OsGPRP家族成員對低溫的響應(yīng)

以水稻OsActin1為內(nèi)參，未處理為空白對照組，經(jīng)低溫處理后發(fā)現(xiàn)，3個水稻OsGPRP家族成員在水稻幼苗地上部和地下部中的表達量均具有不同程度的變化(圖4)；其中，OsGPRP1在水稻幼苗地上部的表達量略有上升但差異不顯著，而在地下部的表達量則顯著上升；OsGPRP2在水稻幼苗地上部的表達量極顯著降低，而在地下部的表達量則極顯著上升；OsGPRP3在水稻幼苗地上部和地下部的表達量均為極顯著上升。

* 和 **分別表示P<0.05和P<0.01水平上的顯著和極顯著差異。* and ** .Indicate significant differences at level of P<0.05 and P<0.01，respectively.

3 討論

GRPR 蛋白含有4 個保守結(jié)構(gòu)域，近N 端的XYPP 重復(fù)和中部富含A(丙氨酸)的疏水區(qū)(Hydro domain)是所有GPRP 蛋白所共有的，而另外2個結(jié)構(gòu)域(N 端G-rich 區(qū)和C 端HGK重復(fù))只存在于部分GPRP 蛋白中[4，7]。本研究克隆的3個水稻OsGPRP基因編碼的蛋白序列中均包含了近N端的XYPP重復(fù)區(qū)域、中部多A 疏水區(qū)和C端HGK重復(fù)序列3個保守結(jié)構(gòu)域，說明這3個水稻OsGPRP基因是典型的植物GPRP家族成員。

在前人研究的基礎(chǔ)上進一步利用生物信息學(xué)進行同源蛋白基因搜索分析發(fā)現(xiàn)，GPRP蛋白基因廣泛分布于高等植物中[4，7]。目前，在擬南芥、玉米、大豆和鷹嘴豆中報道的GPRP基因數(shù)分別僅有5，3，6，4個[4，7]；本研究在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，利用RT-PCR等方法也只分離到了3個水稻OsGPRP蛋白編碼基因的cDNA序列。由此表明，GPRP這類基因在高等植物中應(yīng)屬于數(shù)量少的小基因家族。

前人研究結(jié)果已經(jīng)表明，擬南芥、大豆、鷹嘴豆和蠶豆等植物中GPRP基因的表達會受到各種生物和非生物脅迫的調(diào)控[4，7，20]。本研究發(fā)現(xiàn)，3個水稻OsGPRP基因的表達也分別受到干旱和低溫的影響，只是3個OsGPRP基因?qū)Ω珊岛偷蜏孛{迫響應(yīng)的模式存在一定的差異。例如，干旱脅迫下，OsGPRP1在水稻幼苗地上部和地下部的上升表達量變化均不顯著；OsGPRP3在水稻幼苗地上部和地下部的表達量均極顯著上升；而OsGPRP2只在水稻幼苗地下部的表達量極顯著上升，在地上部的上升表達差異不顯著。低溫脅迫下，OsGPRP1只在水稻幼苗地下部的表達量顯著上升，在地上部的表達量差異不顯著；OsGPRP3在水稻幼苗地上部和地下部的表達量均為極顯著上升；而OsGPRP2在水稻幼苗地上部的表達量極顯著下降，但在地下部的表達量則極顯著上升。由此表明，在干旱、低溫等脅迫下，這些OsGPRP家族成員可能既存在協(xié)同作用，也可能存在功能分化；類似的基因家族成員存在功能冗余和分化的現(xiàn)象在擬南芥、大豆和水稻等中均有報道[4，18，21]。

[1] Shen G X，Wei J，Qiu X Y，et al.Co-overexpression ofAVP1 andAtNHX1 in cotton further improves drought and salt tolerance in transgenic cotton plants[J].Plant Molecular Biology Reporter，2015，33(2)：167-177.

[2] 萬建民.中國水稻分子育種現(xiàn)狀與展望[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2007，9(2)：1-9.

[3] 朱義旺，林雅容，陳 亮.我國水稻分子育種研究進展[J].廈門大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2016，55(5)：661-671.

[4] Peng H，F(xiàn)eng Y M，Zhang H，et al.Molecular cloning and characterisation of genes coding for Glycine-and proline-rich proteins (GPRPs) in soybean[J].Plant Molecular Biology Reporter，2012，30(3)：566-577.

[5] Boron A K，Van Orden J，Markakis M N，et al.Proline-rich protein-like PRPL1 controls elongation of root hairs inArabidopsisthaliana[J].Journal of Experimental Botany，2014，65(18)：5485-5495.

[6] Fujino K，Obara M，Sato K.Diversification of the plant-specific hybrid glycine-rich protein (HyGRP) genes in cereals[J].Frontiers in Plant Science，2014，5(1)：489.

[7] Marty I，Monfort A，Stiefel V，et al.Molecular characterization of the gene coding for GPRP，a class of proteins rich in glycine and proline interacting with membranes inArabidopsisthaliana[J].Plant Molecular Biology，1996，30(3)：625-636.

[8] Kour A，Boone A M，Vodkin L O.RNA-Seq profiling of a defective seed coat mutation in glycine max reveals differential expression of Proline-rich and other cell wall protein transcripts[J].PLoS One，2014，9(5)：e96342.

[9] Kim J Y，Kim W Y，Kwak K J，et al.Glycine-rich RNA-binding proteins are functionally conserved inArabidopsisthalianaandOryzasativaduring cold adaptation process[J].Journal of Experimental Botany，2010，61(9)：2317-2325.

[10] Yeom S I，Seo E，Oh S K，et al.A common plant cell-wall protein HyPRP1 has dual roles as a positive regulator of cell death and a negative regulator of basal defense against pathogens[J].Plant Journal，2012，69(5)：755-768.

[11] Tan J，Zhuo C，Guo Z.Nitric oxide mediates cold-and dehydration-induced expression of a novel MfHyPRP that confers tolerance to abiotic stress[J].Physiologia Plantarum，2013，149(3)：310-320.

[12] Schoofs L，Hamdaoui A，Devreese B，et al.The ovary of the desert locustSchistocercagregariacontains a glycine-and proline-rich peptide that displays sequence similarities with a new class of GPRP proteins from plants[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，1998，243(2)：390-394.

[13] Kim D Y，Kwon S I，Choi C，et al.Expression analysis of rice VQ genes in response to biotic and abiotic stresses[J].Gene，2013，529(2)：208-214.

[14] Liu J L，Luo M S，Yan X，et al.Characterization of genes coding for galacturonosyltransferase-like (GATL) proteins in rice[J].Genes & Genomics，2016，38(10)：917-929.

[15] Perez-Diaz J，Wu T M，Perez-Diaz R A，et al.Organ-and stress-specific expression of theASRgenes in rice[J].Plant Cell Reports，2014，33(1)：61-73.

[16] 孫利軍，黃 磊，李大勇，等.水稻OsWRKY轉(zhuǎn)錄因子對非生物脅迫響應(yīng)的重疊表達特性分析[J].植物生理學(xué)報，2014，50(11)：1651-1658.

[17] Lescot M，Dehais P，Thijs G，et al.PlantCARE，a database of plantcis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences [J].Nucleic Acids Research，2002，30(1)：325-327.

[18] Liao P F，Huang J Q，Tong P G，et al.Characterization and expression analysis of inositolphosphorylceramide synthase family genes in rice (OryzasativaL.)[J].Genes & Genomics，2017，39(5)：485-492.

[19] 杜 方，王 婷，樊俊苗，等.新鐵炮百合朱麗葉器官差異基因表達分析[J].華北農(nóng)學(xué)報，2017，32(5)：25-30.

[20] Nakahara K S，Kitazawa H，Atsumi G，et al.Screening and analysis of genes expressed upon infection of broad bean withCloveryellowveinviruscausing lethal necrosis[J].Virology Journal，2011，8：355.

[21] Lee B H，Henderson D A，Zhu J K.TheArabidopsiscold-responsive transcriptome and its regulation by ICE1[J].Plant Cell，2005，17(11)：3155-3175.