謝 昆，王 靖，王麗仙，朱靈明，尹建華，葉青霞，孫 艷

(1.紅河學院 生命科學與技術(shù)學院，云南 蒙自 661199；2.云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點實驗室，云南 蒙自 661199；3.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南 大理 671003)

抗菌肽是生物體內(nèi)一種具有抗菌活性的小分子物質(zhì)，最早發(fā)現(xiàn)的抗菌肽是天蠶素，由瑞典科學家Baman等[1]于1972年從惜古比天蠶(Hyatophoracecropin)中發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽對細菌、病毒、真菌和原蟲也都具有抑制殺傷作用[2-3]。目前，在家蠶(Bombyxmori，Bm)中已有40余種抗菌肽基因被發(fā)現(xiàn)[4]，通過比對序列的相似性，將其分為7個家族：Cecropin、Attacin、Moricin、Gloverin、Lebocin、Enbocin及Defensin家族[5]，孫偉等[6]將家蠶抗菌肽類型分為3類：富含甘氨酸或脯氨酸類抗菌肽、兩親性具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的線性抗菌肽和富含半胱氨酸類抗菌肽。Yang等[7]通過抑菌活性檢測發(fā)現(xiàn)，BmCecropinB6、BmCecropinD和Bmmoricin具有極強廣譜的抗菌性，能夠殺滅大多數(shù)的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌及真菌，預(yù)示這些家蠶抗菌肽具有廣泛的應(yīng)用前景。

自誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)(Auto-induction protein expression system)由Studier[8]于2005年提出，該系統(tǒng)利用乳糖培養(yǎng)基替代IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)表達外源蛋白[9-10]，具有毒性低、表達量高等特點。本研究在此基礎(chǔ)上對BmCecropin、BmCecropinB6、BmCecropinD和Bmmoricin這4種家蠶的抗菌肽基因進行RT-PCR擴增，構(gòu)建了pET32a-BmCecropin、pET32a-BmCecropinB6、pET32a-BmCecropin和pET32a-Bmmoricin原核表達載體，并采用自誘導(dǎo)表達系統(tǒng)表達上述4種家蠶抗菌肽重組蛋白，對表達的重組蛋白進行Ni-NTA親和純化和超濾純化，旨在為家蠶抗菌肽進一步的抑菌活性測定和應(yīng)用家蠶抗菌肽奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

家蠶(青松×皓月)由蒙自家蠶養(yǎng)殖戶提供。質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品， RNAiso Plus購自寶生物工程(大連)有限公司，T4DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶均購自Fermentas公司，DL2000 DNA Marker、RT-PCR試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，高分子量預(yù)染蛋白Marker購自Thermo Scientific公司。

50×M：稱取17.75 g Na2HPO4，17 g KH2PO4，13.4 g NH4Cl，3.55 g Na2SO4，加水溶解，調(diào)節(jié)pH值至6.7，定容至100 mL，在1.034×105Pa高壓下蒸汽滅菌20 min，4 ℃保存。

50×5052：稱取25 g甘油，2.5 g葡萄糖，10 g乳糖定容至100 mL，高壓滅菌后4 ℃保存。

1000×微量金屬：稱取0.222 g CaCl2，0.198 g MnCl2，0.288 g ZnSO4，0.047 NiCl2，0.048 4 g NaMoO4，0.012 g H3BO3，加水定容至50 mL，高壓滅菌后4 ℃保存。

0.1 mol/L MgSO4：稱取2.465 g MgSO4·7H2O加水定容至100 mL，高壓滅菌后4 ℃保存。

1% ZY：稱取1 g胰蛋白胨，0.5 g酵母提取物加水定容至50 mL，高壓滅菌后4 ℃保存。

ZYM-5052：量取2 mL 50×M ，2 mL 50×5052，2 mL 0.1 mol/L MgSO4，20 μL 1000×微量金屬，50 mL 1% ZY，加滅菌水定容至100 mL。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank公布的BmCecropin(XM_004926048)、BmCecropinB6(S60579)、BmCecropinD(NM_001043368.2)、Bmmoricin(AB006915)的mRNA序列，應(yīng)用Primer Primer 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計4對特異性引物如下：BmCecropin引物：F：5 ′-AATGGATCCATGAATTTCGCAAAGATCCTAT-3 ′，R：5′-AATAAGCTTTCATTTTCCTATAGCTTTAGCC-3′；BmCecropinB6引物：F：5′-CATGCCATGGTTAGGTGGAAGATCTTCAAG-3′，R：5′-GACCCTCGAGTCAGATAGCTTTAGCCGAACCAAGG-3′；BmCecropinD引物：F：5′-CAGTCCATGGGCAACTTCTTCAAGGATC-3′，R：5′-CCGCTCGAGTCATTGTCCGAGAGCTTTTGCTTTTG-3′；Bmmoripin引物：F：5′-CATGCCATGGCAAAAATACCTATCAAGGCCATTAAGACTGTAGGAAAGGCAGTCGGTA-3′，R：5′-CCGCTCGAGTCAATGCTTTCTTTTCTTCGGTTTCAAGAAATTGAAAACATC-3′。

下劃線部分為限制性內(nèi)切酶識別位點，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 總RNA提取及RT-PCR擴增

取五齡七天家蠶中腸組織，應(yīng)用RNAiso Plus提取總RNA，方法參考《分子克隆實驗指南》[11]。應(yīng)用寶生物工程(大連)有限公司的PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit，分別加入合成4種抗菌肽基因的特異性引物，RT-PCR擴增出4種抗菌肽基因，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。

1.4 表達載體的連接、轉(zhuǎn)化及鑒定

DNA凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產(chǎn)物，用NcoⅠ/XhoⅠ分別雙酶切BmCecropinB6、BmCecropinD、Bmmoricin基因和pET32a載體，用BamHⅠ/Hind Ⅲ分別雙酶切BmCecropin基因和pET32a載體，構(gòu)建pET32a-BmCecropinD、pET32a-BmCecropinB6、pET32a-BmCecropin和pET32a-Bmmoricin原核表達載體，連接，轉(zhuǎn)化，酶切鑒定，PCR鑒定等參考《分子克隆實驗指南》[11]。

1.5 重組蛋白的自IPTG誘導(dǎo)表達

構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達重組蛋白，分別收集誘導(dǎo)0～6 h菌液，SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白表達情況。

1.6 重組蛋白的自誘導(dǎo)表達

按照Studier[8]的方法進行自誘導(dǎo)表達研究。挑取含有重組質(zhì)粒的單菌落，接種到4 mL含有100 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 、220 r/min培養(yǎng)過夜，再按1% 的接種量接種到10 mL含有100 μg/mL Amp的ZYM-5052 培養(yǎng)基中，37 ℃ 、220 r/min培養(yǎng)18 h，收集菌液，與IPTG誘導(dǎo)的菌液進行SDS-PAGE電泳分析，比較二者重組蛋白表達產(chǎn)率的差異。

1.7 重組蛋白的純化

應(yīng)用GE公司的GE healthcare Ni-NTA親和層析試劑盒純化重組蛋白，并用10 ku超濾管進行超濾濃縮，BCA蛋白定量試劑盒測定重組蛋白濃度，真空冷凍干燥得到重組抗菌肽粉末。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶抗菌肽基因的RT-PCR擴增

以五齡七天(5L7D)時期家蠶的中腸組織總RNA為模板，通過RT-PCR技術(shù)擴增家蠶BmCecropin、BmCecropinB6、BmCecropinD、Bmmoricin這4條抗菌肽基因，結(jié)果顯示，4條抗菌肽基因大小約為198，108，105，129 bp，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。

M.DL2000 Marker；1，2.BmCecropinD的RT-PCR擴增結(jié)果；3，4.BmCecropinB6的RT-PCR擴增結(jié)果；5，6.BmCecropin的RT-PCR擴增結(jié)果；7，8.Bmmoricin的RT-PCR擴增結(jié)果。

M.DL2000 DNA Marker;1，2.The RT-PCR amplification ofBmCecropinD;3，4.The RT-PCR amplification ofBmCecropinB6;5，6.The RT-PCR amplification ofBmCecropin;7，8.The RT-PCR amplification ofBmmoricin.

圖1家蠶抗菌肽基因的RT-PCR擴增
Fig.1TheRT-PCRamplificationofantibacterialpeptidegenesfromsilkworm

2.2 重組表達載體的構(gòu)建

分別將4種抗菌肽基因與pET32a原核表達載體連接，構(gòu)建pET32a-BmCecropin、pET32a-BmCecropinB6、pET32a-BmCecropinD和pET32a-Bmmoricin原核表達載體，陽性重組質(zhì)粒分別經(jīng)PCR鑒定，鑒定結(jié)果如圖2，3所示。

2.3 抗菌肽的自誘導(dǎo)表達

4種抗菌肽經(jīng)自誘導(dǎo)表達后，SDS-PAGE檢測顯示，BmCecropin、BmCecropinB6、BmCecropinD、Bmmoricin重組蛋白表達。結(jié)果表明，BmCecropin、BmCecropinB6、BmCecropinD、Bmmoricin經(jīng)自誘導(dǎo)后均有高效表達，表達的4種抗菌肽重組蛋白大小分別為24，21，20，22 ku，自誘導(dǎo)表達產(chǎn)率明顯高于IPTG誘導(dǎo)組(圖4-7)。

M.DL2000 DNA Marker；1～11.pET32a-BmCecropin重組質(zhì)粒的PCR鑒定；13～24.pET32a-Bmmoricin重組質(zhì)粒的PCR鑒定。

M.DL2000 DNA Marker;1-11.The PCR identification of recombinant plasmids pET32a-BmCecropin;13-24.The PCR identification of recombinant plasmids pET32a-Bmmoricin

圖2pET32a-BmCecropin和pET32a-Bmmoricin重組質(zhì)粒的PCR鑒定
Fig.2ThePCRidentificationofrecombinantplasmidspET32a-BmCecropinandpET32a-Bmmoricin

M.DL2000 DNA Marker；1～11.pET32a-BmCecropinB6重組質(zhì)粒的PCR鑒定；12～21.pET32a-BmCecropinD重組質(zhì)粒的PCR鑒定。

M.DL2000 DNA Marker;1-11.The PCR identification of recombinant plasmids pET32a-BmCecropinB6;12-21.The PCR identification of recombinant plasmids pET32a-BmCecropinD.

圖3pET32a-BmCecropinB6和pET32a-BmCecropinD重組質(zhì)粒的PCR鑒定
Fig.3ThePCRidentificationofrecombinantplasmidspET32a-BmCecropinB6andpET32a-BmCecropinD

M.Protein Marker；1.含pET32a空質(zhì)粒的菌液；2～8.IPTG分別誘導(dǎo)0，1，2，3，4，5，6 h重組菌株；9～14.自誘導(dǎo)12，14，16，18，20，22 h重組菌株。圖5～7同。

M.Protein Marker;1.The bacteria include pET32a empty plasmid;2-8.Recombinant bacterium induced for 0，1，2，3，4，5 and 6 hours by IPTG，respectively;9-14.BmCecropin expression by auto-induction for 12，14，16，18，20，22 hours.The same as Fig.5-7.

圖4SDS-PAGE檢測BmCecropin抗菌肽的表達
Fig.4TheexpressingdetectingofBmCecropinbySDS-PAGE

圖5 SDS-PAGE檢測BmCecropinB6抗菌肽的表達Fig.5 The expressing detecting of BmCecropinB6 by SDS-PAGE

圖6 SDS-PAGE檢測BmCecropinD抗菌肽的表達Fig.6 The expressing detecting of BmCecropinD by SDS-PAGE

圖7 SDS-PAGE檢測Bmmoricin抗菌肽表達產(chǎn)率Fig.7 The expressing detecting of Bmmoricin by SDS-PAGE

2.4 抗菌肽的純化

分別對pET32a-BmCecropin、pET32a-BmCecropinB6、pET32a-BmCecropinD和pET32a-Bmmoricin重組蛋白進行Ni-NTA親和純化，Sephadex G-10柱分子篩凝膠脫鹽和30 ku的超濾管進行超濾濃縮，然后真空干燥。結(jié)果如圖8-11所示。結(jié)果表明，已獲得比較純的濃縮BmCecropin、BmCecropinB6、BmCecropinD、Bmmoricin重組抗菌肽樣品，可以下一步用作抑菌活性研究。

3 討論

昆蟲抗菌肽具有分子量小、熱穩(wěn)定、水溶性好、無免疫原、廣譜抗菌等特點，可以抑殺細菌、真菌、病毒及原蟲，而且對多種癌細胞及動物實體瘤有明顯的殺傷作用而不破壞高等動物的正常細胞。到目前為止，已從絕大多數(shù)生物如水稻[12]、人[13-15]、蜜蜂[16]、蛇[17]、蜈蚣[18]、蚯蚓[19]中獲得上千種抗菌肽，在多種昆蟲中分離或鑒定出超過200種抗菌肽。BmCecropin、BmCecropinB6、BmCecropinD和Bmmoricin 這4種抗菌肽是家蠶體內(nèi)抑菌活性最強的抗菌肽，能抑制大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、酵母菌、青霉菌、放線菌、毛霉菌、曲霉菌等常見細菌和真菌的生長，顯示其在防腐劑、化妝品和飼料添加劑等方面有廣泛的應(yīng)用前景[7]。本研究通過RT-PCR技術(shù)從家蠶中場組織中擴增上述4種家蠶抗菌肽基因，構(gòu)建原核表達載體，通過自誘導(dǎo)表達系統(tǒng)表達4種抗菌肽重組蛋白，Ni-NTA親和純化重組蛋白，為4種家蠶抗菌肽的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

M.Protein Marker；1.空質(zhì)粒菌液；2.IPTG誘導(dǎo)5 h重組菌株；3～4.30 ku超濾濃縮后的BmCecropin重組抗菌肽。

M.Protein Marker;1.The bacteria include pET32a empty plasmid;2.Recombinant bacterium induced for 5 hours by IPTG;3-4.Recombinant antibacterial peptide BmCecropin by 30 ku ultrafiltrations.

圖830ku超濾管超濾濃縮后的BmCecropin重組抗菌肽純品
Fig.8ThepurifiedrecombinantantibacterialpeptideBmCecropinby30kuultrafiltrations

M.Protein Marker；1.空質(zhì)粒菌液；2.IPTG誘導(dǎo)5 h重組菌株；3～4.30 ku超濾濃縮后的BmCecropinB6重組抗菌肽。

M.Protein Marker;1.The bacteria include pET32a empty plasmid;2.Recombinant bacterium induced for 5 hours by IPTG;3-4.Recombinant antibacterial peptide BmCecropinB6 by 30 ku ultrafiltrations.

圖930ku超濾管超濾濃縮后的BmCecropinB6重組抗菌肽純品
Fig.9ThepurifiedrecombinantantibacterialpeptideBmCecropinB6by30kuultrafiltrations

M.Protein Marker；1.空質(zhì)粒菌液；2.IPTG誘導(dǎo)5 h重組菌株；3～4.30 ku超濾濃縮后的BmCecropinD重組抗菌肽。

M.Protein Marker;1.The bacteria include pET32a empty plasmid;2.Recombinant bacterium induced for 5 hours by IPTG;3-4.Recombinant antibacterial peptide BmCecropinD by 30 ku ultrafiltrations.

圖1030ku超濾管超濾濃縮后的BmCecropinD重組抗菌肽純品
Fig.10ThepurifiedrecombinantantibacterialpeptideBmCecropinDby30kuultrafiltrations

M.Protein Marker；1.空質(zhì)粒菌液；2.IPTG誘導(dǎo)5 h重組菌株；3～4.30 ku超濾濃縮后的Bmmoricin重組抗菌肽。

M.Protein Marker;1.The bacteria include pET32a empty plasmid;2.Recombinant bacterium induced for 5 hours by IPTG;3-4.Recombinant antibacterial peptide Bmmoricin by 30 ku ultrafiltrations.

圖1130ku超濾管超濾濃縮后的Bmmoricin重組抗菌肽純品
Fig.11ThepurifiedrecombinantantibacterialpeptideBmmoricinby30kuultrafiltrations

自誘導(dǎo)表達系統(tǒng)于2005年由Studier發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)通過乳糖培養(yǎng)基替代IPTG，當培養(yǎng)基中葡萄糖耗盡后，乳糖才被利用，目的蛋白開始表達[20-23]。自誘導(dǎo)表達系統(tǒng)的優(yōu)點是毒性低，外源蛋白表達量高。從本研究結(jié)果可以看出，通過自誘導(dǎo)表達系統(tǒng)表達的4種抗菌肽重組蛋白表達量明顯高于IPTG誘導(dǎo)組。與天然來源和化學合成生產(chǎn)抗菌肽相比，大腸桿菌融合表達的獨特優(yōu)勢使其成為大規(guī)模生產(chǎn)抗菌肽最具成本效益的方式，硫氧還蛋白是融合表達生產(chǎn)抗菌肽使用最多的載體蛋白，在適宜條件下可以獲得大量的可溶性融合蛋白，分子量小、高度的溶解性等優(yōu)良性能使其特別適用于抗菌肽的生產(chǎn)[24-25]。pET載體系統(tǒng)被證明是一種能高效表達可溶性重組蛋白的載體蛋白，其具有高度的特異性和穩(wěn)定性。在外源基因的原核表達中具有廣泛的應(yīng)用價值[26-27]。本研究結(jié)果為后續(xù)家蠶抗菌肽的進一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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