劉子記，朱 婕，牛 玉，楊 衍

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737；2.海南大學(xué) 熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南 海口 570228)

基因啟動(dòng)子是一段特殊的DNA序列，能與RNA聚合酶結(jié)合主導(dǎo)基因的起始轉(zhuǎn)錄位置[1]，根據(jù)轉(zhuǎn)錄方式不同，啟動(dòng)子主要包括3種類型，分別為組成型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子[2-3]。轉(zhuǎn)錄調(diào)控和翻譯調(diào)控是真核生物基因表達(dá)的主要調(diào)控途徑，轉(zhuǎn)錄因子和位于啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件間的相互作用完成基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控[4]，轉(zhuǎn)錄因子能夠與位于啟動(dòng)子區(qū)域的順式調(diào)控元件特異結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)基因的表達(dá)調(diào)控，促進(jìn)作物適應(yīng)環(huán)境條件的變化[5]。生物信息學(xué)是近年來發(fā)展起來的一門學(xué)科，與互聯(lián)網(wǎng)結(jié)合進(jìn)行發(fā)展，促進(jìn)了基因序列數(shù)據(jù)發(fā)掘的前進(jìn)步伐，很多分析和預(yù)測(cè)工具、網(wǎng)站被開發(fā)出來，為科研提供了便利[6]。利用預(yù)測(cè)工具對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行分析，能夠預(yù)測(cè)位于啟動(dòng)子上的順式調(diào)控元件[7]。

核糖體失活蛋白(Ribosome inactivating proteins，RIPs)是主要存在于植物體內(nèi)具有多種生物學(xué)活性的毒蛋白，核糖體功能失活致使蛋白質(zhì)生物合成受到抑制主要是由于RIPs作用于28S rRNA實(shí)現(xiàn)的，截至目前，國內(nèi)外研究團(tuán)隊(duì)從苦瓜果實(shí)和種子中分離到多種RIPs，主要包括α-苦瓜素、β-苦瓜素和MAP30 (Momordica anti-HIV protein of 30 kDa，MAP30)等。其中苦瓜MAP30蛋白是藥理作用最強(qiáng)的Ⅰ型RIPs[8]。具有顯著的抗腫瘤、抗病毒等藥理活性[9-15]。

目前，有關(guān)MAP30的研究主要集中在重組表達(dá)和藥理活性分析方面，林育泉等[16]選用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組MAP30蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞株具有明顯的抑制作用。樊劍鳴等[17]在畢赤酵母中表達(dá)的苦瓜蛋白MAP30能夠誘發(fā)胃腺癌細(xì)胞MCG803的凋亡。樊劍鳴等[18]研究表明，重組的苦瓜MAP30蛋白在體外能抑制大腸LoVo細(xì)胞生長，并能誘導(dǎo)其凋亡。朱振洪等[19]研究發(fā)現(xiàn)，MAP30基因在畢赤酵母中的表達(dá)產(chǎn)物具有抑制腫瘤細(xì)胞的活性。韓曉紅等[20]研究表明，重組表達(dá)MAP30蛋白可以誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞株EC-1.71凋亡。邱華麗等[21]研究結(jié)果證實(shí)，重組表達(dá)MAP30蛋白體外可誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞凋亡。有關(guān)苦瓜MAP30基因啟動(dòng)子及單倍型的研究鮮有報(bào)道。因此，該研究擬克隆MAP30基因的上游啟動(dòng)子序列，利用生物信息學(xué)分析方法分析該啟動(dòng)子潛在的順式作用元件；分析不同苦瓜種質(zhì)資源MAP30基因啟動(dòng)子序列SNPs和InDels分布情況，鑒定單倍型，分析不同單倍型之間在順式作用元件上的差別以及共同點(diǎn)，為進(jìn)一步闡明MAP30基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試苦瓜材料共30份，來源于苦瓜初級(jí)核心種質(zhì)庫[22]，其中3份來自日本，3份來自中國廣東，1份來自中國江西，5份來自中國海南，3份來自泰國，2份來自中國云南，1份來自中國湖南，4份來自中國廣西，2份來自中國福建，3份來自斯里蘭卡，3份來自印度(表1)。試驗(yàn)于2016年9月初在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行，將供試苦瓜種子用50 ℃溫水處理30 min，常溫浸種12 h后，播種于營養(yǎng)缽中，按照常規(guī)方法管理。待苦瓜長至三葉一心時(shí)，摘取葉片貯于-20 ℃冰箱備用。

表1 供試苦瓜材料Tab.1 The test materials of bitter gourd

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用改良的CTAB法[23]提取待測(cè)苦瓜材料的基因組DNA。

1.2.2MAP30啟動(dòng)子序列分離 根據(jù)GenBankMAP30編碼序列S79450比對(duì)苦瓜基因組序列[24]，該編碼序列對(duì)應(yīng)于Scaffold_175，為了獲得MAP30啟動(dòng)子序列，從MAP30基因起始密碼子下游200 bp內(nèi)利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物(表2)，獲取起始密碼子上游1.5 kb左右的序列。以苦瓜材料Y5基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Omega Gel Extraction Kit，美國)回收目的條帶，將目的條帶連接到北京全式金生物技術(shù)有限公司pEASY-T5載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1，篩選出陽性克隆，委托廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司測(cè)序。

PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括12 μL Premix TaqTM(寶生物工程有限公司)，1 μmol/L引物，150 ng模板DNA。擴(kuò)增步驟為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物10 ℃保存。20 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與3 μL上樣緩沖液、2 μL UltraPower DNA染料混合經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠于110 V電泳30 min，顯色進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)。

表2 擴(kuò)增MAP30啟動(dòng)子區(qū)域引物序列Tab.2 The primers used for amplifying MAP30 promoter

1.2.3MAP30啟動(dòng)子序列分析 利用在線軟件FGENESH預(yù)測(cè)MAP30基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。利用在線分析工具P1antCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測(cè)MAP30啟動(dòng)子區(qū)域順式作用調(diào)控元件[25]。

1.2.4MAP30啟動(dòng)子單倍型分析 采用BioEdit軟件對(duì)不同苦瓜種質(zhì)MAP30啟動(dòng)子序列進(jìn)行多序列比對(duì)，分析MAP30啟動(dòng)子區(qū)域SNPs和InDels分布情況，分析MAP30啟動(dòng)子單倍型及調(diào)控元件差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 MAP30基因啟動(dòng)子片段克隆

為了獲得MAP30啟動(dòng)子序列，從MAP30基因起始密碼子下游200 bp內(nèi)利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，獲取起始密碼子上游1.5 kb左右的序列，共設(shè)計(jì)7對(duì)引物。以苦瓜種質(zhì)Y5葉片基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中引物MAPP1擴(kuò)增條帶單一，目的片段為1 600 bp左右，與預(yù)期片段大小吻合，回收特異片段、連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序，獲得1 682 bp的序列，經(jīng)與MAP30編碼序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，起始密碼子(ATG)位于1 582 bp處，且起始密碼子下游編碼序列完全與MAP30編碼序列相匹配，證明所克隆序列為MAP30基因上游啟動(dòng)子序列。MAP30基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)利用FGENESH軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果表明，TSS位于MAP30起始密碼子上游52 bp處，位于目的片段1 530 bp位點(diǎn)(C)。選取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 500 bp序列進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件分析(圖1)。

2.2 MAP30基因啟動(dòng)子序列分析

MAP30基因啟動(dòng)子序列經(jīng)P1antCARE軟件分析，結(jié)果表明，多個(gè)順式作用調(diào)控元件存在于MAP30基因啟動(dòng)子區(qū)域(圖1、表3)。其中1 461(-39)～1 464 bp(-36)位置含有1個(gè)TATA-box，即RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，能夠保證轉(zhuǎn)錄起始的準(zhǔn)確性。調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始頻率的CAAT-box元件位于1 419(-81)～1 422 bp(-78)位置，綜合以上分析結(jié)果表明，MAP30核心啟動(dòng)子區(qū)域位于TSS上游-39～-81區(qū)域。另外，發(fā)現(xiàn)多個(gè)光響應(yīng)元件，28個(gè)元件中與光響應(yīng)相關(guān)的有10個(gè)，占35.7%。如AT1-motif、Box 4、Box Ⅰ、Box Ⅱ、CATT-motif、G-Box、GAG-motif、GATA-motif、GT1-motif、TCT-motif等。植物激素響應(yīng)元件，如脫落酸響應(yīng)元件ABRE、乙烯響應(yīng)元件ERE。特異表達(dá)元件，如CCGTCC-box、Skn-1_motif；防御與生物、非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件，如TC-rich repeats、TCA-element、HSE、MBS、ARE、GC-motif。晝夜節(jié)律調(diào)控響應(yīng)元件，如circadian。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該啟動(dòng)子可能參與光、厭氧、逆境脅迫、脫落酸、水楊酸和乙烯等誘導(dǎo)，同時(shí)它還可能參與胚乳高效表達(dá)及晝夜節(jié)律調(diào)控。

圖1 MAP30啟動(dòng)子序列Fig.1 The promoter sequence of MAP30 in bitter gourd

2.3 MAP30基因啟動(dòng)子單倍型分析

以MAPP1為引物，以其余29份苦瓜種質(zhì)基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，回收目的片段進(jìn)行測(cè)序，以MAP30(Y5)啟動(dòng)子序列為參考序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖2所示，共發(fā)現(xiàn)37個(gè)SNPs位點(diǎn)和6個(gè)InDels，SNPs位點(diǎn)分別是100位點(diǎn)的A/G，342位點(diǎn)的T/C、363位點(diǎn)的T/A、387位點(diǎn)的G/C、409位點(diǎn)的C/A、584位點(diǎn)的A/G、610位點(diǎn)的C/T、783位點(diǎn)的G/T、788位點(diǎn)的G/T、807位點(diǎn)的G/C、812位點(diǎn)的T/A、820位點(diǎn)的T/C、833位點(diǎn)的A/C、867，868，869位點(diǎn)的GAA/TCG，872位點(diǎn)的A/G、875位點(diǎn)的G/A、881位點(diǎn)的A/G、930位點(diǎn)的G/A、947位點(diǎn)的T/C、1022位點(diǎn)的G/A、1062位點(diǎn)的A/G、1075位點(diǎn)的G/C、1087位點(diǎn)的T/G、1111位點(diǎn)的T/A、1125位點(diǎn)的G/T、1128位點(diǎn)的A/G、1189位點(diǎn)的A/G、1200位點(diǎn)的A/C、1207位點(diǎn)的G/A、1237位點(diǎn)的C/T、1244位點(diǎn)的G/T、1368位點(diǎn)的G/A、1383位點(diǎn)的G/A、1402位點(diǎn)的C/T、1437位點(diǎn)的C/G。6個(gè)InDels位點(diǎn)分別是951-952位點(diǎn)的--/GT、1238-1240位點(diǎn)的AAG/---、1273位點(diǎn)的T/-、1285-1287位點(diǎn)的AAA/---、1305位點(diǎn)的A/-、1372位點(diǎn)的-/G。(圖2)。通過SNPs分組發(fā)現(xiàn)，30份苦瓜種質(zhì)資源MAP30基因啟動(dòng)子共存在3種單倍型。Y5、Y7、Y16、Y39、Y58、Y60、Y66、Y77、Y83、Y96、Y100、Y112、Y121屬于第1組，Y43、Y50、Y90、Y108、Y113、Y115、Y140、Y141、Y144屬于第2組，Y69、Y72、Y85、Y131、Y139、Y146、Y147、Y153屬于第3組。結(jié)合順式調(diào)控元件的位置，其中5個(gè)SNPs(342位點(diǎn)的T/C、584位點(diǎn)的A/G、783位點(diǎn)的G/T、872位點(diǎn)的A/G、1087位點(diǎn)的T/G)位于順式調(diào)控元件內(nèi)部，涉及的順式調(diào)控元件分別為MBSI、ABRE、ARE、5UTR Py-rich stretch、GAG-motif、TC-rich repeats，SNP導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生改變，可能對(duì)MAP30基因的表達(dá)調(diào)控有重要作用。

表3 MAP30啟動(dòng)子區(qū)域順式作用調(diào)控元件Tab.3 The cis-acting regulation elements in MAP30 promoter region

3 討論

啟動(dòng)子作為精確調(diào)控基因表達(dá)的重要元件[26]，位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游，能夠活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確結(jié)合，另外啟動(dòng)子區(qū)含有一系列順式作用元件[27]，決定轉(zhuǎn)錄起始方向和效率，控制基因表達(dá)的起始時(shí)間、空間和表達(dá)程度[28]。

MAP30是從苦瓜果實(shí)和種子中分離純化得到的一種單鏈I型核糖體失活蛋白[29]，具有抗腫瘤[20]、抗菌[30]、抗病毒[31]等多種生物學(xué)活性。為了分析MAP30基因啟動(dòng)子特征特性，本研究從MAP30基因起始密碼子下游200 bp內(nèi)設(shè)計(jì)引物，獲取1 682 bp的序列，經(jīng)與MAP30編碼序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，起始密碼子(ATG)位于1 582 bp處，且起始密碼子下游編碼序列完全與MAP30編碼序列相匹配，證明所克隆序列為MAP30基因上游啟動(dòng)子序列。選取MAP30基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 500 bp的序列作為啟動(dòng)子序列進(jìn)行了研究，對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行了結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，分析結(jié)果表明，MAP30啟動(dòng)子序列不但含有植物啟動(dòng)子所具有的基本順式調(diào)控元件CAAT-box和TATA-box等，還含有其他多個(gè)與光、激素、防御脅迫等相關(guān)的順式作用調(diào)控元件。MAP30啟動(dòng)子尤其與光響應(yīng)密切相關(guān)，28個(gè)元件中與光響應(yīng)相關(guān)的有10個(gè)，占35.7%，進(jìn)而推測(cè)光在MAP30基因表達(dá)過程中具有重要作用。另外，啟動(dòng)子序列含有逆境脅迫、厭氧及水楊酸響應(yīng)元件，推測(cè)該基因具有抵抗不利條件，參與植物早期的過敏反應(yīng)并在植物的抗病過程中發(fā)揮重要作用，這與前期MAP30蛋白生物活性研究結(jié)果一致[32]。MAP30啟動(dòng)子含有與胚乳表達(dá)相關(guān)的元件，推測(cè)MAP30在種子中高效表達(dá)，這與以往研究一致，以往研究主要從苦瓜種子中提取MAP30蛋白[33-34]。另外還預(yù)測(cè)到水楊酸響應(yīng)元件，該結(jié)果表明，MAP30啟動(dòng)子可能并不完全屬于組織或器官型啟動(dòng)子，還有可能是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

圖2 MAP30啟動(dòng)子序列SNPs和InDels分布情況Fig.2 The SNPs and InDels distribution of MAP30 promoter in bitter gourd germplasm

本研究以30份苦瓜種質(zhì)為材料，分析了MAP30啟動(dòng)子區(qū)域SNPs和InDels分布情況，共發(fā)現(xiàn)37個(gè)SNPs位點(diǎn)和6個(gè)InDels，通過SNPs和InDels分組發(fā)現(xiàn)，30份苦瓜種質(zhì)資源共存在3種單倍型。結(jié)合MAP30啟動(dòng)子區(qū)域順式調(diào)控元件預(yù)測(cè)結(jié)果來看，5個(gè)SNPs位于順式調(diào)控元件區(qū)域，SNPs導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生改變，可能對(duì)MAP30基因的表達(dá)調(diào)控有重要作用。在下一步的研究計(jì)劃中，將開展不同單倍型與MAP30表達(dá)水平的相關(guān)性分析。

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