朱 艷，喬麟軼，張曉軍，李 欣，楊足君，郭慧娟，王長(zhǎng)彪，暢志堅(jiān)

(1.山西大學(xué) 研究生院，山西 太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所，作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031；3.電子科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610054；4.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究中心，山西 太原 030031)

小麥?zhǔn)俏覈?guó)的主糧作物之一，常年遭受病原菌的侵染，其中，由小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的條銹病屬世界性禾谷類病害，是危害小麥生產(chǎn)的重要病害之一[1-3]。小麥感染條銹病后各項(xiàng)生理機(jī)能失常，導(dǎo)致小麥生長(zhǎng)發(fā)育受阻，嚴(yán)重威脅著小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)[4]，2002年全國(guó)條銹病大暴發(fā)曾導(dǎo)致小麥減產(chǎn)14億kg[5]，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。因此，廣泛發(fā)掘抗病基因、選育抗病品種對(duì)減少小麥產(chǎn)量損失尤為迫切[6]。

彭提卡偃麥草(Th.ponticum，2n=10x=70，StStEeEbEx)是禾本科小麥族中的多年生草本植物，具有抗病、抗旱、優(yōu)質(zhì)、耐鹽堿等諸多優(yōu)異性狀，是小麥遺傳改良的重要外源基因庫(kù)[7]。在20世紀(jì)70年代，李振聲[8]最先利用長(zhǎng)穗偃麥草與普通小麥雜交，從后代中選育出小偃7430等一系列八倍體小偃麥材料，以及小偃6號(hào)等小麥品種，其中，小偃6號(hào)對(duì)條銹菌的抗性保持了20年之久，在我國(guó)小麥抗病育種中具有重要意義。此外，從長(zhǎng)穗偃麥草中還分離鑒定出抗條銹病基因YrTP1、YrTP2以及具有正式命名的Yr69，分別被定位于小麥2BS、7BL和2AS上[9-10]。

CH7056是作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從20世紀(jì)90年代開始，利用小偃7430與感病普通小麥品種雜交回交后選育出的抗病品系之一。在四川成都多年的鑒定結(jié)果表明，CH7056對(duì)當(dāng)?shù)亓餍械臈l銹菌種條中32、條中33以及高毒性小種v26均表現(xiàn)為免疫；而且利用細(xì)胞學(xué)技術(shù)在CH7056中鑒定不到外源染色體片段，能最大程度地減少連鎖累贅，具有較高的育種應(yīng)用價(jià)值。

本研究利用芯片技術(shù)和常規(guī)分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)CH7056的遺傳群體進(jìn)行成株期抗性分析，旨在明確其攜帶抗病基因的數(shù)目和位置，并通過開發(fā)偃麥草特異標(biāo)記鑒定其抗病性來(lái)源。

1 材料和方法

1.1 供試材料

抗性鑒定材料為小麥CH7056/SY95-71重組自交系(F7和F8，共112家系)及其親本，用于抗性來(lái)源分析的材料為八倍體長(zhǎng)穗偃麥草和小偃7430，均由作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。供試菌種為條銹菌混合菌種CYR32+33+v26，由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所楊恩年研究員提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料種植及抗性鑒定 試驗(yàn)材料于2013，2014年種植于四川成都。播種行長(zhǎng)2 m，寬20 cm，每行種植15粒。每隔5行設(shè)置1行小麥感病對(duì)照品種銘賢169，每行的行首和行尾各種植1孔誘發(fā)材料SY95-71。RILs群體按單株種植。在小麥拔節(jié)期對(duì)誘發(fā)材料接種混合菌種，接種14 d后，待感病對(duì)照充分發(fā)病時(shí)，按葉部病害0～4級(jí)法對(duì)群體和親本材料進(jìn)行鑒定[11]。

1.2.2 抗病位點(diǎn)分析 在三葉期從親本以及每個(gè)RILs F8單株上剪取葉片，采用CTAB法提取總DNA[12]。從中分別選擇2013，2014年鑒定結(jié)果均表現(xiàn)為抗病(0或0;級(jí))和感病(4級(jí))的10個(gè)F8單株的DNA等量混合，構(gòu)建抗感池。將親本以及抗感池DNA寄往澳大利亞Diversity Arrays Technology公司(DArT?，http://www.diversityarrays.com/)進(jìn)行芯片掃描，該芯片包含27 166個(gè)具有基因組位置信息的DArT標(biāo)記。根據(jù)多態(tài)性DArT標(biāo)記分布位置初步確定抗病位點(diǎn)。

1.2.3 外源特異標(biāo)記開發(fā) 利用中間偃麥草(StEeEb)相關(guān)同源群的標(biāo)記序列檢索本研究中抗病位點(diǎn)所在的小麥基因組序列[13]，對(duì)獲得的小麥scaffold序列診斷SSR位點(diǎn)并開發(fā)相應(yīng)分子標(biāo)記，隨后利用彭提卡偃麥草(StStEeEbEx)、八倍體小偃7430(ABD+StEeEbEx)和普通小麥(ABD)材料從中篩選出能鑒定出外源片段的特異SSR標(biāo)記，用來(lái)分析CH7056中是否攜帶有來(lái)自于其外源親本長(zhǎng)穗偃麥草的序列片段。

1.2.4 基因定位 利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)和銀染法，篩選抗病位點(diǎn)所在染色體上的公共SSR標(biāo)記 (GrainGenes，http://wheat.pw.usda.gov/)以及新開發(fā)的物種特異SSR標(biāo)記，將得到的多態(tài)性SSR標(biāo)記擴(kuò)增RIL F8群體定位抗病基因，利用JoinMap v4.0軟件構(gòu)建遺傳圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體抗性遺傳分析

抗病鑒定結(jié)果顯示(表1)，CH7056對(duì)混合條銹菌種免疫(IT=0)，SY95-71則表現(xiàn)為重度感病(IT=4)，RILs家系中抗感單株比例在2013年和2014年間均接近1∶1，符合顯性單基因遺傳的孟德爾分離模型，由此推斷，CH7056中攜帶有1個(gè)顯性的抗條銹病基因，暫命名為YrCH7056。

表1 小麥CH7056/SY95-71 RIL群體及其親本對(duì)混合條銹小種CYR32+33+v26成株期的抗性Tab.1 Adult plant resistance to mixed Pst pathotypes CYR32+33+v26 of CH7056/SY95-71 RIL population and its parents

2.2 抗病位點(diǎn)確定

芯片掃描結(jié)果顯示(圖1)，共有1 565個(gè)DArT位點(diǎn)在親本及抗、感池間具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為5.8%。其中，有629個(gè)位點(diǎn)分布于1B基因組上，占全部多態(tài)性位點(diǎn)的40.2%；有322個(gè)(51.2%)集中位于1B基因組的260 000 000～450 000 000區(qū)段(圖2-A)。由此初步推測(cè)，YrCH7056可能位于小麥1B染色體上。

2.3 抗病基因定位及抗性來(lái)源分析

利用中間偃麥草第一同源群的標(biāo)記序列比對(duì)小麥1B基因組，獲得包含SSR位點(diǎn)的659條小麥scaffolds，據(jù)此開發(fā)出246對(duì)SSR標(biāo)記，并從中篩選出72對(duì)可鑒定外源序列片段的SSR標(biāo)記(表2)。

利用72對(duì)偃麥草特異SSR標(biāo)記以及小麥1B染色體上的129對(duì)常規(guī)SSR標(biāo)記[14]，對(duì)CH7056、SY95-71和抗感池進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出6條多態(tài)性SSR標(biāo)記，依次為gwm11、barc137、1BL-3848555、barc240、barc181和barc256，最終將YrCH7056定位在小麥1BL染色體上(圖2-b)，側(cè)翼標(biāo)記為1BL-3848555-1.1cM-YrCH7056-2.5cM-barc240(圖3)。

圖1 多態(tài)性DArT標(biāo)記在染色體上的分布Fig.1 Chromosome distribution of polymorphic DArT markers

A.多態(tài)性DArT標(biāo)記在1B基因組的分布；B.YrCH7056遺傳圖譜；C.1B遺傳圖譜[12]。A.Distribution of polymorphic DArT markers in 1B genome;B.YrCH7056 genetic map;C.1B genetic map[12].

小麥序列位置Ta-scaffoldslocation與偃麥草第一同源群同源HomologoutoThi-Group1包含SSR位點(diǎn)ContainSSRs已開發(fā)標(biāo)記DevelopedSSRmarkers已篩選特異標(biāo)記ScreenedThp-specificmarkers1BS1751048102431BL48461514429總計(jì)Total659166324672

其中，物種特異SSR標(biāo)記1BL-3848555在CH7056中的擴(kuò)增條帶與在彭提卡偃麥草和小偃7 430中的條帶一致，并且該標(biāo)記與YrCH7056連鎖，表明YrCH7056很可能來(lái)自于其外源親本彭提卡偃麥草(圖3)。

圖3 YrCH7056側(cè)翼SSR標(biāo)記1BL-3848555 (A)和barc240 (B)的擴(kuò)增圖譜Fig.3 Amplification profiles of 1BL-3848555 (A) and barc240 (B)，the flanking SSR markers of YrCH7056

3 討論與結(jié)論

3.1 抗性基因來(lái)源

彭提卡偃麥草是小麥抗性改良的優(yōu)異近緣種，迄今為止，已從彭提卡偃麥草向普通小麥中導(dǎo)入了抗條銹(Yr)[10]、抗葉銹(Lr)[15]和抗稈銹(Sr)[16]等多種抗銹病基因。CH7056即是由彭提卡偃麥草-小麥八倍體材料小偃7430與普通小麥品種雜交回交后選育出的滲入系，對(duì)當(dāng)前流行條銹菌種表現(xiàn)出優(yōu)異且持久的成株期抗性，而且利用細(xì)胞學(xué)技術(shù)在CH7056中檢測(cè)不到外源染色體信號(hào)，表明其可能很少存在連鎖累贅[17]，具有較高的育種價(jià)值。為了證實(shí)CH7056中抗條銹病基因的來(lái)源，本研究開發(fā)了一批能鑒定出偃麥草特異片段的SSR標(biāo)記，其中，1BL-3848555在彭提卡偃麥草、小偃7430和CH7056中擴(kuò)增出了一致的條帶，并且該標(biāo)記與YrCH7056緊密連鎖。初步推斷，YrCH7056來(lái)自于彭提卡偃麥草。

利用72對(duì)偃麥草特異SSR標(biāo)記以及小麥1B染色體上的129對(duì)常規(guī)SSR標(biāo)記[14]，對(duì)CH7056、SY95-71和抗感池進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出6條多態(tài)性SSR標(biāo)記，最終將YrCH7056定位在小麥1BL染色體上，側(cè)翼標(biāo)記為1BL3848555-1.1cM-YrCH7056-2.5cM-barc240。

3.2YrCH7056不同于其他已知抗性基因

本研究最終篩選出6個(gè)SSR標(biāo)記，將YrCH7056定位在小麥1BL染色體上，與來(lái)自彭提卡偃麥草的YrTP1(2BS)、YrTP2[9](7BL)和Yr69[10](2AS)位于不同的染色體。此外，小麥1BL染色體上目前已定位的抗條銹病基因有Yr3a-c[18]、Yr21[19]、Yr29[20]和YrExp1[21]，其中，Yr3a-c、Yr21均為苗期抗病基因，并且抗性來(lái)源于普通小麥，與YrCH7056不是同一基因。而Yr29和YrExp1雖然也表現(xiàn)為成株期抗性，但都來(lái)源于普通小麥，并且二者的緊密連鎖標(biāo)記wmc44(Yr29)和wmc631(YrExp1)與YrCH7056的遺傳距離較遠(yuǎn)，不在同一位點(diǎn)。因此推斷，YrCH7056可能是一個(gè)新的抗條銹病基因。

3.3 YrCH7056的育種潛力和價(jià)值

偃麥草具有諸多小麥缺乏的優(yōu)良基因及性狀，是小麥遺傳改良的優(yōu)質(zhì)資源[22]。挖掘、鑒定、利用新的有效抗條銹病基因，可豐富小麥抗病資源，為培育持久小麥抗病新品種提供物質(zhì)儲(chǔ)備。本研究的YrCH7056可用于小麥條銹病成株抗性改良分子育種，而與其連鎖的分子標(biāo)記，為基因圖位克隆及分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。小麥抗條銹菌具有高度變異性，抗原單一的抗病品種易失去抗性，該基因可與其他有效的抗條銹病基因結(jié)合起來(lái)，通過雜交、回交、復(fù)交等技術(shù)應(yīng)用于聚合育種，延長(zhǎng)其用于控制小麥條銹病危害的時(shí)間[23-25]。

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